羥基自由基氧化對(duì)牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)及水合特性的影響

王策，李俠，鄧少穎，王航，張春暉

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羥基自由基氧化對(duì)牛血清白蛋白結(jié)構(gòu)及水合特性的影響

王策，李俠，鄧少穎，王航，張春暉

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193）

【目的】研究羥基自由基（·OH）氧化對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)及其水合特性的影響，探討氧化介導(dǎo)的關(guān)于蛋白質(zhì)和水分相互作用的變化情況?！痉椒ā繉⑴Ｑ灏椎鞍祝╞ovine serum albumin，BSA）溶解在含15 mmol·L-1的PIPES緩沖溶液中（pH 6.0），并在不同濃度H2O2（0、0.5、1.0、5.0、10.0和20.0 mmol·L-1）的鐵-抗壞血酸-過氧化氫（FeCl3-Vc-H2O2）羥基自由基氧化體系孵育12 h，采用氨基酸自動(dòng)分析儀分析BSA不同程度氧化的氨基酸含量變化；通過測(cè)定羰基含量、巰基含量分析蛋白的氧化程度；通過測(cè)定BSA表面疏水性、離子鍵、氫鍵，考察BSA氧化不同程度后水合能力的變化情況；通過測(cè)定Zeta電位值來分析蛋白氧化后表面電荷的變化；采用傅里葉紅外光譜法分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。【結(jié)果】隨著羥基自由基氧化體系中H2O2濃度的增加，氨基酸含量呈下降趨勢(shì)，但不同種類氨基酸對(duì)·OH氧化敏感性不同，在1 mmol·L-1H2O2處理濃度下，蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）含量顯著降低，較對(duì)照組（未經(jīng)H2O2處理組）分別下降了4.30%、4.22%；當(dāng)H2O2濃度升高到20 mmol·L-1時(shí)，較對(duì)照組蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、組氨酸（His）這3類氨基酸的含量下降程度最大，分別為35.32%、19.19%、11.15%，其次為異亮氨酸（Ile）、甘氨酸（Gly）、半胱氨酸（Cys）。隨H2O2濃度的增加，BSA的羰基含量顯著增加（＜0.05），20 mmol·L-1H2O2處理組比對(duì)照組羰基含量升高了57.52%；巰基含量顯著降低（＜0.05），20 mmol·L-1H2O2處理組比對(duì)照組巰基含量降低了74.04%，蛋白氧化程度顯著加??；BSA經(jīng)氧化處理后，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋、無規(guī)卷曲含量顯著降低（＜0.05），β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加（＜0.05），多肽鏈中α-螺旋結(jié)構(gòu)伸展變成線性結(jié)構(gòu)，蛋白表面疏水性隨著氧化程度的加劇而顯著增加（＜0.05），蛋白持水力降低；同時(shí)氧化作用降低了蛋白表面的凈電荷數(shù)，Zeta電位的絕對(duì)值隨著羥基自由基氧化體系中H2O2濃度的增加而顯著降低（＜0.05），離子鍵和氫鍵作用力顯著減弱，降低了蛋白-水分子相互作用力，蛋白持水力降低?！窘Y(jié)論】BSA在羥基自由基氧化體系中，存在顯著的濃度效應(yīng)，隨著氧化程度加劇，蛋白表面的凈電荷顯著降低，離子鍵和氫鍵作用力顯著減弱，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，蛋白-水分子相互作用力降低。

牛血清白蛋白；羥基自由基氧化體系；蛋白結(jié)構(gòu)；水合特性

0 引言

【研究意義】蛋白質(zhì)很多功能性質(zhì)，如溶解性、乳化性和凝膠特性等都取決于蛋白質(zhì)和水的相互作用[1]。水分子通過與蛋白中的帶電基團(tuán)（離子-偶極相互作用）、酰胺基團(tuán)（偶極-偶極相互作用）、羥基（偶極-偶極相互作用）等進(jìn)行相互作用。蛋白質(zhì)氧化是食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)課題，蛋白質(zhì)在自由基或其他氧化物的作用下，氨基酸殘基發(fā)生氧化效應(yīng)，改變了其質(zhì)子化程度，使得蛋白帶電基團(tuán)發(fā)生改變，進(jìn)而改變蛋白表面的凈電荷，影響蛋白持水力。另一方面，氧化導(dǎo)致蛋白主鏈及氨基酸殘基側(cè)鏈發(fā)生改變，如肽鏈的斷裂、氨基酸殘基側(cè)鏈的氧化修飾、蛋白交聯(lián)聚合等[2-3]，使其一級(jí)、二級(jí)及高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致溶液中蛋白表面疏水殘基和親水殘基的改變，從而影響蛋白與水的互作關(guān)系。因此，開展蛋白氧化基礎(chǔ)理論研究，探索氧化效應(yīng)對(duì)牛血清白蛋白水合特性的影響具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對(duì)蛋白氧化的研究大多以肉蛋白、乳蛋白等為研究對(duì)象，且取得一定進(jìn)展。PARK等[4-5]研究了3種氧化模擬體系中豬肉肌原纖維蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白經(jīng)不同程度氧化后，其羰基含量增加，蛋白的熱穩(wěn)定性下降以及蛋白交聯(lián)聚合等。李銀等[6]研究發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白在羥基自由基氧化體系中，氨基酸含量下降，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白持水力降低。HARRIS等[7]研究發(fā)現(xiàn)蛋白氧化能顯著改變蛋白質(zhì)的空間效應(yīng)，從而影響肌肉的持水性。血清蛋白是動(dòng)物體血漿中含量較為豐富的一種蛋白質(zhì)，其分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、溶解度大，連接氨基殘基的共價(jià)鍵有肽鍵及由兩個(gè)半胱氨酸殘基的側(cè)鏈形成的二硫鍵，它可以使兩條單獨(dú)的肽鏈通過共價(jià)鍵交聯(lián)[8-9]。大量文獻(xiàn)表明，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是研究蛋白理化性質(zhì)的理想模型[10-11]。目前關(guān)于BSA氧化的研究主要集中在生化研究等方面，程伶俐等[12]在研究牛血清白蛋白的光損傷和光氧化機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)SO4-·自由基是通過與BSA中的酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)來氧化BSA的。IONITA等[13]研究發(fā)現(xiàn)加入環(huán)糊精能夠降低肼基自由基對(duì)BSA的氧化速率。ALEGRIA等[14]在研究環(huán)木質(zhì)素醌對(duì)BSA的巰基氧化和其與BSA的共價(jià)結(jié)合時(shí)發(fā)現(xiàn)，在有MgCl2存在的情況下可以使環(huán)木質(zhì)素醌介導(dǎo)的BSA的巰基氧化和共價(jià)結(jié)合作用增強(qiáng)。而以BSA為研究對(duì)象，研究其在羥基自由基氧化體系中的氧化機(jī)制卻未見報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國內(nèi)外關(guān)于蛋白氧化的研究大多集中在蛋白表觀指標(biāo)變化方面以及氧化對(duì)蛋白凝膠形成的影響。蛋白的氧化反應(yīng)是一個(gè)電子轉(zhuǎn)移過程，改變了蛋白的表面電荷狀態(tài)，進(jìn)而影響了蛋白中的帶電基團(tuán)與水分子之間的互作關(guān)系，常見食品體系復(fù)雜多樣，為探討和揭示蛋白氧化過程中電子轉(zhuǎn)移機(jī)制而避免離子強(qiáng)度、pH等其他因素的干擾，本試驗(yàn)首先選擇純蛋白體系BSA為研究對(duì)象?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過分析BSA在鐵-抗壞血酸-過氧化氫（FeCl3-Vc-H2O2）羥基自由基氧化體系中，不同氧化程度條件下蛋白氨基酸殘基、羰基含量、巰基含量、表面疏水性、Zeta電位值、蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及分子間作用力等指標(biāo)變化，研究蛋白氧化過程中結(jié)構(gòu)及水合特性的變化情況，探討蛋白結(jié)構(gòu)與蛋白水合特性之間的內(nèi)在關(guān)系，為進(jìn)一步揭示氧化對(duì)蛋白持水力的影響機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年6—12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所肉品實(shí)驗(yàn)室和農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1主要試劑 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、哌嗪-N,N'-雙（2-乙磺酸）（piperazine- 1,4-bisethanesulfonic acid，PIPES）（美國Sigma公司），5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-Dithio bis-(2- nitrobenzoic acid)，DTNB）、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、鹽酸胍、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) aminomethane，Tris）、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、尿素、溴酚藍(lán)（Bromophenol blue，BPB）（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2.2 主要儀器設(shè)備 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），TXF200-S12 恒溫循環(huán)水浴鍋（英國 Grant公司），T6紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），L-8900 氨基酸自動(dòng)分析儀（日本日立公司），Zeta電位分析儀（英國Malvern公司），X-12R高速冷凍離心機(jī)（美國Beckman公司），傅里葉變換紅外光譜儀（德國Buruker公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 FeCl3/Vc/H2O2（鐵/抗壞血酸/過氧化氫）氧化體系構(gòu)建 參考PARK等[15]方法構(gòu)建以下氧化體系：反應(yīng)歷程為Vc+Fe3+→Fe2+，F(xiàn)e2++H2O2→·OH，F(xiàn)eCl3濃度為0.01 mmol·L-1，Vc濃度為0.1 mmol·L-1，H2O2濃度分別為0（對(duì)照組）、0.5、1、5、10和20 mmol·L-1。牛血清白蛋白分散于上述氧化體系中（終質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1），在4℃條件下密封氧化12 h后用EDTA（終濃度為1 mmol·L-1）終止反應(yīng)。以上氧化反應(yīng)均在15 mmol·L-1PIPES緩沖溶液（pH 6.0）中進(jìn)行。

1.3.2 氨基酸分析 取1 mL氧化的BSA溶液，加入10 mL 6 mol·L-1的鹽酸溶液，充氮1 min排出管內(nèi)空氣并封口，水解管置于110℃的恒溫箱內(nèi)水解24 h后冷卻至室溫，過濾，并將濾液定容到50 mL容量瓶中。取1 mL液體氮吹，直到吹干后再加入5 mL 0.02 mol·L-1的鹽酸復(fù)溶?；靹蚝筮^0.2 μm膜，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定氨基酸[6]。

1.3.3 羰基含量的測(cè)定 參考LEVINE等[16]方法測(cè)定羰基值。將氧化后的BSA濃度調(diào)整為2 mg·mL-1。取0.1 mL稀釋后的蛋白溶液，然后加入0.5 mL含2,4-二硝基苯肼的2 mol·L-1HCl溶液，空白樣品中加入0.5 mL不含2,4-二硝基苯肼的2 mol·L-1HCl溶液，在25℃下反應(yīng)40 min。然后再加入0.5 mL 20%的三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA），震蕩后離心（11 000×，5 min）棄去上清，用體積比為1﹕1的乙醇-乙酸乙酯溶液洗滌沉淀3次，揮發(fā)完溶劑后將蛋白質(zhì)懸浮于1 mL 6 mol·L-1鹽酸胍溶液中，在37℃條件下水浴保溫30 min。以空白為對(duì)照并于370 nm下測(cè)吸光值，蛋白質(zhì)羰基衍生物的含量（nmol·mg-1蛋白）使用摩爾吸光系數(shù)22 000 M-1cm-1計(jì)算。

1.3.4 巰基含量的測(cè)定 總巰基含量的測(cè)定參考ELLMAN等[17]方法。將氧化后的BSA濃度調(diào)整為2 mg·mL-1。取1 mL稀釋后的蛋白溶液，然后加入1 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液（pH 8.3）（含有6 mol·L-1鹽酸胍、1 mmol·L-1EDTA）與10 μL 100 mmol·L-1Tris-HCl 溶液（pH 7.6）（含有10 mmol·L-1DTNB）混勻，在25℃下靜置25 min，并于412 nm下測(cè)定其吸光值，巰基含量（nmol·mg-1蛋白）使用摩爾吸光系數(shù)13 600 M-1cm-1計(jì)算。

1.3.5 傅里葉紅外分析 采用傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）分析BSA氧化后二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。參照GANGIDI等[18]方法，并略作修改。采用多次衰減全反射技術(shù)（Attenuated total re?ection，ATR）進(jìn)行測(cè)量，取適量氧化后的BSA溶液放于ATR附件上掃描，紅外譜圖記錄采用OMNIC軟件，測(cè)定范圍4 000—400 cm-1，掃描次數(shù)100次，掃描速率0.63 cm·s-1，分辨率4 cm-1。紅外光譜的數(shù)據(jù)處理采用PeakFit 4.12軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。

1.3.6 表面疏水性 用20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液將氧化的BSA濃度調(diào)整為2 mg·mL-1，取2 mL蛋白溶液并加入40 μL 1 mg·mL-1的溴酚藍(lán)溶液，空白為2 mL磷酸鹽緩沖液加入40 μL 1 mg·mL-1的溴酚藍(lán)溶液，渦旋振蕩混勻10 min后離心（4℃，4 000×，15 min），取上清液于595 nm測(cè)定吸光值[19]。用結(jié)合態(tài)的疏水溴酚藍(lán)結(jié)合量（總溴酚藍(lán)與游離溴酚藍(lán)的差值）作為表面疏水性指數(shù)。

=40×

式中，為表面疏水性（μg）；control為空白的吸光度值；sample為樣品的吸光度值。

1.3.7 Zeta電位的測(cè)定 參考劉澤龍[20]的方法測(cè)定Zeta電位值，并略作修改。用15 mmol·L-1PIPES緩沖溶液（pH 6.0）將氧化的BSA濃度調(diào)整為1 mg·mL-1。使用馬爾文NanoZS型粒度儀中的SOP模式測(cè)定Zeta電位（mV）。

1.3.8 離子鍵、氫鍵的測(cè)定 參照Gómez-Guillén等[21]方法測(cè)定離子鍵和氫鍵含量，并略作修改。取2 mL經(jīng)氧化的BSA溶液分別與10 mL 0.05 mol·L-1NaCl（S1）、0.6 mol·L-1NaCl（S2）、0.6mol·L-1NaCl + 1.5 mol·L-1尿素（S3）混合均勻，4℃靜置1 h后離心（10 000×，15 min，4℃）。按照雙縮脲測(cè)定蛋白含量的方法測(cè)定各上清液的吸光值。離子鍵含量用S2溶液和S1溶液的吸光值之差來表示，氫鍵含量用 S3溶液和S2溶液的吸光值之差來表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SAS9.2軟件進(jìn)行方差分析，不同處理間差異采用Duncan多重比較，顯著水平為＜0.05，上述試驗(yàn)如未特殊說明均最少為6次平行并進(jìn)行了3次重復(fù)，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果

2.1 H2O2濃度對(duì)BSA氨基酸殘基含量的影響

H2O2濃度對(duì)BSA氨基酸含量的影響如表1所示。隨著H2O2濃度的提高，所有氨基酸殘基含量基本呈下降趨勢(shì)，但不同氨基酸對(duì)羥基自由基的敏感性不同。在H2O2濃度為1 mmol·L-1時(shí)，蘇氨酸（Thr）和賴氨酸（Lys）含量表現(xiàn)出顯著下降（＜0.05），較對(duì)照組分別下降了4.30%、4.22%，表明這兩類氨基酸對(duì)羥基自由基體系下的氧化效應(yīng)最為敏感。隨著H2O2濃度的升高，各類氨基酸含量下降程度不同，當(dāng)H2O2濃度升高到20 mmol·L-1時(shí)，蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）和組氨酸（His）下降程度最大，分別為35.32%、19.19%和11.15%；其次為異亮氨酸（Ile），甘氨酸（Gly）和半胱氨酸（Cys），分別下降了10.62%、10.60%和10.35%。

2.2 H2O2濃度對(duì)BSA羰基、巰基含量的影響

由圖1-a可知，對(duì)照組中BSA的羰基含量為0.46 nmol·mg-1蛋白，當(dāng)H2O2濃度為1 mmol·L-1時(shí)，羰基含量開始顯著增加（＜0.05），當(dāng)H2O2濃度升高到20 mmol·L-1，羰基含量為0.72 nmol·mg-1蛋白，較對(duì)照組增加了57.52%，表明蛋白氧化程度顯著加劇。由圖1-b可知，對(duì)照組中BSA的巰基含量為76.47 nmol·mg-1蛋白，隨著H2O2濃度的增加，巰基含量呈顯著下降趨勢(shì)，在低濃度的H2O2條件下，巰基含量下降程度較低。當(dāng)H2O2濃度為5 mmol·L-1時(shí)，巰基含量為32.72 nmol·mg-1蛋白，較對(duì)照組降低57.21%；當(dāng)H2O2濃度升高到20 mmol·L-1，巰基含量為19.85 nmol·mg-1，較對(duì)照組降低74.04%。

2.3 H2O2濃度對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

采用FTIR分析蛋白氧化過程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，BSA在紅外區(qū)有明顯的特征光譜吸收帶，其中酰胺I帶（1 600—1 700 cm-1）主要是由C=O的伸縮振動(dòng)引起，此外C–N的伸縮振動(dòng)也起部分作用，酰胺I帶能非常敏感地反映出蛋白質(zhì)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化[22-23]。圖2為BSA的酰胺I帶FTIR光譜圖，與對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度H2O2氧化后，該譜帶半峰寬、強(qiáng)度及峰位有一定程度的變化，表明BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。采用傅里葉自退卷積、二階導(dǎo)數(shù)及曲線擬合等技術(shù)對(duì)BSA的酰胺I帶進(jìn)行處理，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的譜峰指認(rèn)如下：1 646—1 661 cm-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 615—1 637 cm-1和1 682—1 698 cm-1為β折疊結(jié)構(gòu)，1 661—1 681 cm-1為β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 637—1 645 cm-1為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)[24]。

表1 H2O2濃度對(duì)氨基酸含量的影響

同行不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同 Values with different letters in the same row indicate significant difference (＜0.05). The same as below

不同字母表示差異達(dá)5%顯著水平。下同 Values in a column followed by different letters are significant differ (P＜0.05). The same as below

H2O2濃度對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的影響如表2所示。隨著H2O2處理濃度的升高，α-螺旋含量下降，當(dāng)H2O2處理濃度升高到10 mmol·L-1和20 mmol·L-1時(shí)，α-螺旋含量分別下降了11.16 %和21.63%；H2O2處理濃度在0—1 mmol·L-1時(shí)，β-折疊含量與對(duì)照組相比無顯著差異（＞0.05），在5—20 mmol·L-1時(shí)，β折疊含量出現(xiàn)了顯著增加（＜0.05），增幅為15.46 %—21.97 %；β-轉(zhuǎn)角含量隨著H2O2濃度的升高而顯著增加（＜0.05），并存在·OH濃度效應(yīng)；無規(guī)卷曲含量在H2O2濃度為0—1 mmol·L-1時(shí)基本保持不變，當(dāng)H2O2濃度升高到5—20 mmol·L-1時(shí)含量顯著降低（＜0.05）。

2.4 H2O2濃度對(duì)BSA表面疏水性影響

羥基自由基氧化體系中H2O2濃度對(duì)BSA表面疏水性的影響如圖3所示，對(duì)照組BSA吸附溴酚藍(lán)（BPB）的量為13.39 μg，0.5 mmol·L-1H2O2處理組BSA的表面疏水性與對(duì)照組無顯著差異（＞0.05）；隨著H2O2處理濃度的升高，表面疏水性較對(duì)照組顯著增加（＜0.05），當(dāng)H2O2濃度為1 、5、10和20 mmol·L-1時(shí)，BSA吸附溴酚藍(lán)的量分別為14.30 μg、15.73 μg、16.07 μg和16.46 μg。

2.5 H2O2濃度對(duì)BSA的Zeta電位影響

圖4為羥基自由基氧化體系條件下BSA中Zeta電位隨H2O2濃度的變化情況。隨著H2O2濃度的升高，Zeta電位的絕對(duì)值顯著降低（＜0.05）；對(duì)照組BSA的Zeta電位值為-8.61 mV，在0.5—5 mmol·L-1H2O2氧化條件下，Zeta電位的絕對(duì)值降低緩慢；當(dāng)H2O2處理濃度升高到10 mmol·L-1和20 mmol·L-1時(shí)，BSA的Zeta電位值分別為-7.34、-7.04 mV，電位的絕對(duì)值較對(duì)照組分別降低了14.75%、18.23 %。

圖3 H2O2濃度對(duì)表面疏水性的影響

圖4 H2O2濃度對(duì)Zeta電位的影響

表2 H2O2濃度對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響

2.6 H2O2濃度對(duì)BSA分子間作用力的影響

不同H2O2濃度氧化條件下BSA中離子鍵、氫鍵變化情況如圖5-a、5-b所示。由圖5-a可知，對(duì)照組中BSA的離子鍵含量為0.25，0.5 mmol·L-1和1 mmol·L-1H2O2處理組離子鍵含量與對(duì)照組相比無顯著差異（＞0.05）；5、10和20 mmol·L-1H2O2處理組離子鍵含量分別為0.16、0.12、0.10，均較對(duì)照組顯著降低（＜0.05）。由圖5-b可知對(duì)照組的氫鍵含量為0.37，當(dāng)H2O2濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)，BSA中的氫鍵含量與對(duì)照組相比無顯著差異（＞0.05）；當(dāng)H2O2濃度為1、5、10和20 mmol·L-1時(shí)，各處理組氫鍵含量分別為0.30、0.27、0.21、0.19，較對(duì)照組顯著降低（＜0.05）。表明受氧化影響，BSA溶液中離子鍵和氫鍵逐漸斷裂。

圖5 H2O2濃度對(duì)離子鍵（A）、氫鍵（B）的影響

3 討論

自由基介導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化致使多肽鏈氧化斷裂和蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸發(fā)生氧化修飾。在活性氧（ROS）的作用下，會(huì)引起蛋白質(zhì)某些特定的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，如羰基化合物的形成，巰基基團(tuán)的損失，各類交聯(lián)物的形成等[25]，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。然而蛋白氧化是與脂肪氧化相類似的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其實(shí)質(zhì)是一個(gè)電子轉(zhuǎn)移過程。蛋白質(zhì)氧化能夠引起電子轉(zhuǎn)移，改變蛋白的表面特性，最終改變蛋白帶電基團(tuán)與水分子間的相互作用[20]。

蛋白氧化導(dǎo)致的氧化損傷，首先涉及的是氨基酸殘基的破壞或修飾作用。理論上，所有的氨基酸側(cè)鏈都有可能被自由基氧化，但是許多學(xué)者指出，由于半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met）含有易被ROS攻擊的活性基團(tuán)，因此其為氧化反應(yīng)中的敏感氨基酸[26]。其中蛋氨酸（Met）是必需氨基酸中唯一含硫的氨基酸，極易被氧化形成蛋氨酸亞砜衍生物；酪氨酸（Tyr）含有芳香環(huán)，·OH可氧化其生成二酪氨酸，半胱氨酸（Cys）含有巰基，極易被氧化形成二硫鍵[6]。然而，不同的氧化體系和蛋白質(zhì)類型也會(huì)導(dǎo)致敏感氨基酸類型和氧化程度的不同[5]。AMICI等[27]指出，在金屬離子催化的氧化系統(tǒng)中，組氨酸（His）、脯氨酸（Pro）、精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）、半胱氨酸（Cys）都是容易被氧化的氨基酸。ELIAS等[28]認(rèn)為，β-乳球蛋白中的半胱氨酸（Cys）比色氨酸（Trp）更易受氧化損傷，而蛋氨酸（Met）卻具有一定的抗氧化特性。BSA在266 nm激光作用下，BSA中的色氨酸（Trp）殘基首先以脫電子和發(fā)生分子內(nèi)電子能級(jí)躍遷的形式受到破壞，進(jìn)而通過分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移的形式氧化酪氨酸（Tyr）殘基，最終其光損傷以這兩種氨基酸自由基的形式表達(dá)出來[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著氧化體系中H2O2濃度的升高，BSA中氨基酸殘基遭受自由基攻擊的程度加劇。其中，在低濃度 H2O2處理?xiàng)l件下，蘇氨酸（Thr）和賴氨酸（Lys）為氧化敏感氨基酸；而在高濃度H2O2條件下，蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、和組氨酸（His）的含量下降程度最大，然后依次為異亮氨酸（Ile）、甘氨酸（Gly）和組氨酸（Cys）。而李銀等[6]指出半胱氨酸（Cys）、蛋氨酸（Met）及酪氨酸（Tyr）是肌原纖維蛋白中在研究羥基自由基體系條件下的氧化敏感氨基酸。同樣的，PARK等[29]在研究肉蛋白中氨基酸的氧化情況時(shí)也得出了類似結(jié)論。這證實(shí)了不同的蛋白類型和氧化體系導(dǎo)致氨基酸敏感程度的差異較大，推測(cè)可能是由于不同蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的暴露程度不同[28]或蛋白結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了其抗氧化能力的不同。羰基的形成（醛基和酮基）以及巰基的減少被廣泛用來評(píng)價(jià)蛋白的氧化程度[30]。帶有NH-或NH2-的氨基酸殘基側(cè)鏈與肽鏈骨架，易受自由基氧化攻擊，斷裂生成羰基衍生物，蛋白質(zhì)中羰基含量越高表明蛋白的氧化程度越高[31]。巰基和二硫鍵是維系蛋白分子構(gòu)象的重要化學(xué)鍵，對(duì)于穩(wěn)定BSA完整的空間結(jié)構(gòu)具有重要作用，BSA分子由581個(gè)氨基酸殘基組成，其中含有35個(gè)半胱氨酸，在肽鏈的第34位有一自由巰基[9]。巰基是蛋白質(zhì)中最具反應(yīng)活性的基團(tuán)，在氧化過程中可發(fā)生可逆或不可逆反應(yīng)，生成二硫鍵、次磺酸、亞磺酸和磺酸[32]。在MgCl2和鄰醌同時(shí)存在的情況下，BSA巰基的被氧化程度變得更大[14]。本研究發(fā)現(xiàn)BSA在羥基自由基氧化體系中，隨著H2O2濃度的升高，羰基含量顯著增加（＜0.05），巰基含量顯著降低（＜0.05）。崔旭海[33]、孫妍[34]等在研究自由基氧化體系下乳清蛋白和β-乳球蛋白的理化變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)蛋白的巰基含量下降，羰基含量呈增加的趨勢(shì)。姜晴晴等[35]在研究羥基自由基氧化體系對(duì)帶魚蛋白理化性質(zhì)的影響時(shí)指出，隨著氧化時(shí)間的延長，蛋白羰基含量顯著增加（＜0.05），而巰基含量表現(xiàn)為先增加后減少，推測(cè)可能是在短時(shí)間的氧化條件下肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致更多的巰基基團(tuán)暴露，而隨著氧化時(shí)間的延長巰基被氧化，含量隨之降低。

蛋白質(zhì)氨基酸殘基的疏水性是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)水合特性的一個(gè)重要指標(biāo)，蛋白質(zhì)表面疏水性反映了與外界極性水環(huán)境相連的蛋白質(zhì)表面疏水性基團(tuán)的數(shù)量，亦可用來衡量蛋白質(zhì)的變性程度，蛋白表面疏水性越高，其結(jié)合水分的能力就越弱，變性程度越大[36]。氧化會(huì)導(dǎo)致蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化，隨著氧化程度的增加其結(jié)構(gòu)逐漸展開，包裹在分子內(nèi)部的一些疏水性的芳香族和脂肪族氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)逐漸暴露，導(dǎo)致溶液中極性與非極性基團(tuán)數(shù)量的改變，蛋白表面疏水性增加[23]。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量下降，β-折疊和β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加，證明氧化確實(shí)導(dǎo)致了BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。李艷青[37]在研究鯉魚肌原纖維蛋白經(jīng)自由基氧化后表面疏水性的變化情況時(shí)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)氧化期間蛋白表面疏水性隨著H2O2濃度的升高、氧化時(shí)間的延長而不斷增加（＜0.05）；相同H2O2濃度，蛋白表面疏水性隨著氧化時(shí)間的延長而增加。李學(xué)鵬等[38]在研究羥基自由基氧化對(duì)草魚肌原纖維蛋白的表面疏水性影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，草魚肌原纖維蛋白表面疏水性隨著H2O2濃度的升高而逐漸增大。本研究發(fā)現(xiàn)隨著氧化程度的加劇，蛋白表面疏水性顯著增加, 這與SUN等[39]研究蛋白氧化導(dǎo)致蛋白表面疏水性增加結(jié)果一致。此外，表面疏水性的氧化依賴性增加與蛋氨酸亞砜和二酪氨酸的含量增加也是相關(guān)的[40]。

蛋白粒子表面存在的凈電荷影響其界面周圍的離子分布形成雙電層[41]。Zeta電位是評(píng)價(jià)帶電微粒表面電荷的特性表征參數(shù)，可反映出體系中帶電粒子表面電荷的狀態(tài)，粒子表面電荷基團(tuán)的微小變化將引起 Zeta電位的改變[42]。Zeta電位同時(shí)也是表征溶液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，Zeta電位絕對(duì)值越大，體系越穩(wěn)定；反之穩(wěn)定性下降，溶液會(huì)出現(xiàn)凝結(jié)和聚集現(xiàn)象[43]。本研究結(jié)果表明隨著氧化程度的加劇，BSA溶液的Zeta電位絕對(duì)值表現(xiàn)出顯著降低，表明隨著氧化程度的加深，BSA溶液氧化體系趨向于不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)表面氨基酸所帶電荷的多少和電荷的正負(fù)性影響著蛋白質(zhì)表面電位，從而影響了蛋白質(zhì)溶液的Zeta電位值。一般說來，蛋白質(zhì)表面帶正電荷的氨基酸多于帶負(fù)電荷氨基酸，其蛋白溶液Zeta電位為正值；反之，蛋白質(zhì)表面帶負(fù)電荷的氨基酸多于帶正電荷氨基酸，其蛋白溶液Zeta電位為負(fù)值[44]。葉林[45]在研究蛋白質(zhì)氧化對(duì)花生蛋白乳液電位的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)新鮮乳液的電位絕對(duì)值隨著氧化程度的增加主要呈減小趨勢(shì)，吳偉等[46]在研究過氧自由基氧化對(duì)大米蛋白Zeta電位的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著過氧自由基濃度的增加，大米蛋白Zeta電位絕對(duì)值顯著下降（＜0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)BSA經(jīng)氧化后Zeta電位的絕對(duì)值表現(xiàn)出顯著降低（＜0.05），這與葉林[45]和吳偉[46]等的研究結(jié)論是一致的，推測(cè)可能是氨基酸含量發(fā)生改變以及氨基酸殘基側(cè)鏈發(fā)生的羰基化反應(yīng)，改變了蛋白表面的質(zhì)子化程度，其表面凈電荷隨著氧化程度的加劇而減少，蛋白的極性降低，蛋白的持水能力降低。此外，蛋白氧化后表面凈電荷的改變使得蛋白等電點(diǎn)發(fā)生偏移，亦會(huì)影響蛋白的持水能力[45]。α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲是蛋白質(zhì)中主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)[47]。氫鍵、范德華力以及疏水作用和離子鍵等對(duì)維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定以及蛋白與水的互作關(guān)系起到非常重要的作用[48]，而靜電作用形成的氫鍵在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中起著穩(wěn)定構(gòu)象的重要作用。本研究結(jié)果表明氧化使BSA多肽鏈中的α-螺旋結(jié)構(gòu)不斷伸展而變成線性結(jié)構(gòu)，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量顯著增加（＜0.05）。推測(cè)可能是由于自由基的攻擊使分子內(nèi)部氫鍵的排列取向發(fā)生改變，維持蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂，各種分子內(nèi)和分子間相互作用力的平衡被打破，蛋白質(zhì)各部分的空間排列發(fā)生改變。這與本試驗(yàn)觀察到的氫鍵含量隨氧化程度增強(qiáng)而降低的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

氨基酸總含量隨H2O2濃度增加呈下降趨勢(shì)，其中蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）為低濃度H2O2條件下牛血清白蛋白（BSA）中的敏感氨基酸，蛋氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）和組氨酸（His）為高濃度H2O2條件下BSA中的敏感氨基酸。隨著H2O2處理濃度的升高，蛋白羰基含量顯著升高、巰基含量顯著降低；BSA經(jīng)氧化處理后，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋、無規(guī)卷曲含量降低，多肽鏈中α-螺旋結(jié)構(gòu)伸展變成線性結(jié)構(gòu)，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量增加，同時(shí)蛋白表面疏水性增加，蛋白持水力降低。氧化作用改變了蛋白的表面電荷狀態(tài)，Zeta電位絕對(duì)值顯著下降，蛋白表面的電荷數(shù)降低，離子鍵和氫鍵作用力顯著減弱，降低了蛋白-水分子相互作用力。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Effects of Hydroxyl Radicals Oxidation on Structure and Hydration Properties of Bovine Serum Albumin

WANG Ce, LI Xia, DENG ShaoYing, WANG Hang, ZHANG ChunHui

(Institute of Agro-Products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Comprehensive Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

【Objective】The effects of oxidation on protein structure and its hydration properties were investigated. The purpose of this study was to explore the changes in protein and water interactions mediated by oxidation.【Method】Ferric ion-ascorbic acid-hydrogen peroxide (FeCl3-Vc-H2O2) hydroxyl radical oxidation system was used in this study. Bovine Serum Albumin (BSA) was suspended in 15 mmol·L-1piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid (PIPES) buffer (pH 6.0) and incubated at 4℃ for 12 h with ferric ion (Fe3+) and ascorbic acid (Vc) at different concentrations of hydrogen peroxide (0, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, and 20.0 mmol·L-1H2O2). Amino acid content was measured by automatic amino acid analyzer. Carbonyl content and sulfhydryl content were detected to evaluate the degree of proteins oxidation. The changes of hydratability of BSA was evaluated by measuring the surface hydrophobicity, the content of ionic bond and the content of hydrogen bond. Electrochemical change rule under different oxidation levels was studied by measuring Zeta potential. In addition, the protein secondary structure was analyzed by Fourier Transform Infrared (FT-IR) spectroscopy. 【Result】The content of amino acids in BSA declined with the increasing H2O2concentration. However, the selective effects of ·OH on amino acids were observed. Compared to the control group (0 H2O2treatment) , threonine (Thr) and lysine (Lys) decreased significantly by 4.30% and 4.22%, respectively, at 1 mmol·L-1of the H2O2concentration. When the concentration of H2O2increased to 20 mmol·L-1, the contents of methionine (Met), tyrosine (Tyr) and histidine (His) showed the highest reduction, which was reduced by 35.32%, 19.19% and 11.15%, respectively. Then the content of leucine (Ile), glycine (Gly) and cysteine (Cys) also showed their higher reduction. It was observed that the carbonyl content increased significantly (＜0.05) with increasing H2O2concentration, while sulfhydryl content significantly declined (＜0.05), i.e. Carbonyl content in 20 mmol·L-1H2O2treatment group (0.723 nmol·mg-1protein) increased by 57.52% when it was compared to control (0.459 nmol·mg-1protein), and sulfhydryl content in 20 mmol·L-1H2O2treatment group (19.853 nmol·mg-1protein) decreased by 74.04% when it was compared to control (76.471 nmol·mg-1protein). Both indicated that BSA protein oxidation became more severe with the extension of H2O2concentration. The result of secondary structure analysis indicated thatα-helix, random coil decreased significantly with the increase of ·OH (＜0.05), while β-sheet, β-turn increased significantly (＜0.05), which demonstrates BSA oxidation induced the α-helix structure become a linear structure. The exposure of hydrophobic residues led to the significant increase of protein surface hydrophobicity (＜0.05). The absolute value of Zeta potential was significantly decreased (＜0.05) with the increase of H2O2concentration, which demonstrated that the protein oxidation could significantly affect the surface charge of protein. Chemical interactions results showed that hydrogen bond and ionic bond were weakened significantly (＜0.05), with reduction of interaction between protein and water molecules and the protein hydration capacity.【Conclusion】BSA oxidation is H2O2concentration-dependent in hydroxyl radical oxidation system. Protein surface electrostatic charge decreased and protein secondary structure changed significantly as affected by protein oxidation,the interaction between protein and water molecules were reduced.

Bovine Serum Albumin (BSA); hydroxyl radical (·OH) oxidizing system; protein structure; hydration properties

2017-01-20；接受日期：2017-03-29

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31571787）

王策，Tel：010-62815950；E-mail：1551082195@qq.com。通信作者張春暉，Tel：010-62819469；E-mail：dr_zch@163.com