雙歧桿菌細(xì)菌素Bifidocin A對金黃色葡萄球菌的抑菌作用及其機(jī)制

劉國榮，郜亞昆，王 欣,2，劉玉潔，曹季林，王成濤,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

雙歧桿菌細(xì)菌素Bifidocin A對金黃色葡萄球菌的抑菌作用及其機(jī)制

劉國榮1，郜亞昆1，王 欣1,2，劉玉潔1，曹季林1，王成濤1,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

Bifidocin A是由Bifi dobacterium animalis BB04代謝合成的一種新型廣譜高效細(xì)菌素。以革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌為測試敏感菌，分析細(xì)菌素Bifidocin A的最低抑菌濃度及不同質(zhì)量濃度下的抑菌效果，并從敏感菌細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞膜的完整性以及細(xì)胞膜質(zhì)子移動勢的變化4 個角度分別探討該細(xì)菌素的抑菌作用機(jī)制。結(jié)果表明，細(xì)菌素Bifidocin A對金黃色葡萄球菌CVCC 26112的最低抑菌濃度為0.058 μg/mL，抑菌活性較強(qiáng)且存在濃度依賴性；并初步推測其抑菌作用機(jī)制是通過耗散細(xì)胞膜質(zhì)子移動勢，增加細(xì)胞膜通透性，形成孔洞，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜完整性，并最終瓦解細(xì)胞。

細(xì)菌素；雙歧桿菌；金黃色葡萄球菌；抑菌活性；抑菌機(jī)制

乳酸菌細(xì)菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體機(jī)制合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，它在人體內(nèi)可被降解，具有高效、無抗藥性、無毒、無殘留等優(yōu)點(diǎn)，已成為天然食品生物防腐劑研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[1]。

對乳酸菌細(xì)菌素抑菌作用機(jī)制的研究是評價(jià)其在食品中應(yīng)用安全性的重要依據(jù)[2-3]。目前乳酸菌細(xì)菌素抑菌作用機(jī)理的研究主體主要集中在Ⅰ類和Ⅱ類細(xì)菌素上，Ⅲ類和Ⅳ類細(xì)菌素由于分子質(zhì)量較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，對其作用機(jī)理的研究較少[4]。所研究的靶細(xì)胞基本都圍繞G＋細(xì)菌展開，如單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌等[5-6]。目前已確認(rèn)部分乳酸菌細(xì)菌素對G＋細(xì)菌的主要作用機(jī)制是改變敏感菌細(xì)胞膜通透性，釋放胞內(nèi)的離子（如K＋），ATP、乳酸脫氫酶及紫外吸收物質(zhì)，引起質(zhì)子驅(qū)動勢（proton motive force，PMF）的喪失，干擾膜運(yùn)輸，導(dǎo)致能量代謝以及蛋白質(zhì)和核酸合成受阻甚至無法進(jìn)行，最終引起細(xì)胞的死亡[7-9]。也有部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，乳酸菌細(xì)菌素在改變細(xì)胞膜通透性的同時，還可能會破壞敏感菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性[10-11]。

雙歧桿菌（Bifidobacterium spp.）是寄生在人和動物腸道內(nèi)的典型有益乳酸菌，它可以對宿主發(fā)揮生物屏障、營養(yǎng)、免疫、延緩衰老、抗腫瘤等生理作用。已發(fā)現(xiàn)極少數(shù)雙歧桿菌屬菌株也可產(chǎn)生細(xì)菌素[12-16]，如兩歧雙歧桿菌（B. bifidum）NCFB1454、嗜熱雙歧桿菌（B. thermophilum）RBL67、嬰兒雙歧桿菌（B. infants）BCRC14602、動物雙歧桿菌（B. animals）BB04等。而有關(guān)雙歧桿菌細(xì)菌素的抑菌作用機(jī)理目前鮮見研究報(bào)道[12,17]。

B. animalis BB04可代謝合成廣譜高效細(xì)菌素Bifidocin A，是國內(nèi)外首次報(bào)道的產(chǎn)細(xì)菌素動物雙歧桿菌[16]。課題組前期已建立Bifidocin A的提取純化方法，分析了該細(xì)菌素的分子結(jié)構(gòu)、抑菌譜和應(yīng)用特性，確定其有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力。為評價(jià)細(xì)菌素Bifidocin A的應(yīng)用安全性，本研究重點(diǎn)分析該細(xì)菌素對敏感菌之一——金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CVCC 26112的抑菌作用機(jī)理，旨在為進(jìn)一步闡釋雙歧桿菌細(xì)菌素的抑菌機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及培養(yǎng)基

細(xì)菌素Bifidocin A（質(zhì)量濃度為1.85 mg/mL，純度為95.3%），由本實(shí)驗(yàn)室自主分離提取純化[16]；敏感菌：金黃色葡萄球菌CVCC 26112，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

胰蛋白酶大豆肉湯（tryptic soy，TSB）培養(yǎng)基北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；ATP分析測定試劑盒 北京半夏化工產(chǎn)品有限公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、SYTO9 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計(jì) 上海美析儀器有限公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司；S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、ZA-3000原子吸收光譜儀 日本日立有限公司；JEM 1200EX透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本電子株式會社；FV-1200激光共聚焦掃描顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社。

1.3 方法

1.3.1 抑菌活性分析

1.3.1.1 最低抑菌濃度的確定

收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌CVCC 26112菌體細(xì)胞，制備濃度為106CFU/mL的菌懸液，并向其中加入不同質(zhì)量濃度的細(xì)菌素Bifidocin A純品溶液，使其最終質(zhì)量濃度分別為1.85、0.925、0.463、0.232、0.116、0.058、0.029、0.015 mg/mL，37 ℃條件下溫育處理24 h，測定各管OD600nm。對照采用同樣體積蒸餾水代替細(xì)菌素Bifidocin A樣品。以未見指示菌生長（即OD600nm不增高）的最低細(xì)菌素質(zhì)量濃度為該細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌CVCC 26112的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）[18]。

1.3.1.2 不同質(zhì)量濃度細(xì)菌素Bifidocin A對敏感菌生長的抑制作用

參考Bendali等[19]報(bào)道方法，收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌CVCC 26112菌體細(xì)胞，制備濃度為106CFU/mL的菌懸液，并向其中加入不同質(zhì)量濃度的細(xì)菌素純品溶液，使其最終濃度分別為1×MIC、2×MIC及4×MIC水平，37 ℃溫育處理24 h，采用平板計(jì)數(shù)法測其活菌數(shù)。以不添加細(xì)菌素培養(yǎng)組為對照，觀察不同質(zhì)量濃度細(xì)菌素處理下敏感菌活菌數(shù)的變化情況。

1.3.2 抑菌機(jī)理研究

1.3.2.1 敏感菌培養(yǎng)及細(xì)菌素Bifidocin A處理菌懸液的制備

收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌CVCC 26112菌體細(xì)胞，用0.1 mol/L pH 7.0的羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）緩沖液反復(fù)洗滌3 次后，重懸于含10 mmol/L葡萄糖的HEPES緩沖液中，制備成菌懸液（106CFU/mL），并向其中加入適量細(xì)菌素Bifidocin A純品溶液，使最終作用濃度為1×MIC水平，37℃溫育處理3 h。以未添加細(xì)菌素的菌懸液為對照。

1.3.2.2 細(xì)菌素對敏感菌細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

采用SEM觀察敏感菌細(xì)胞外部形態(tài)變化，采用TEM觀察敏感菌細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化[20]。具體方法為：將1.3.2.1節(jié)中菌懸液樣品在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，保留菌體細(xì)胞并用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）反復(fù)清洗3 遍，加入2.5%戊二醛預(yù)固定3 h，再用1%鋨酸固定1.5 h。接著采用30%、50%、70%、80%、90%的乙醇溶液對樣品進(jìn)行洗脫，每步15 min，之后在100%乙醇的水溶液中脫水2 次，每次15 min；再將樣品置于乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V）混合液中15 min；最后置樣品于叔丁醇中懸浮15 min左右，作為SEM觀察細(xì)胞樣品，待用。其中，取一部分處理好的細(xì)胞樣品滴加于5 mm×5 mm的蓋玻片上，置－80 ℃冰箱凍存后放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥。采用SEM觀察并采集圖像；剩余細(xì)胞樣品用丙酮和樹脂進(jìn)行浸透和包埋后，在超薄切片機(jī)上切成約100 nm薄片，5%磷鎢酸染色后，采用TEM觀察敏感菌細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)并采集圖像。

1.3.2.3 細(xì)菌素對敏感菌細(xì)胞膜通透性的影響

通過監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)外小分子物質(zhì)（K＋和無機(jī)磷）及大分子物質(zhì)（ATP）的含量變化，分析細(xì)菌素Bifidocin A對敏感菌細(xì)胞膜通透性的影響作用[9]。具體方法為：將

1.3.2.1 節(jié)中菌懸液樣品在4 ℃、10 000 r/min離心5 min，留取上清液作為胞外樣品；剩余菌體細(xì)胞沉淀用1 mL 5%三氯乙酸懸浮，－20 ℃冷凍過夜，解凍后95 ℃溫育10 min，每個樣品加4 mL去離子水，10 000 r/min離心15 min，留取上清液作為胞內(nèi)樣品。采用原子吸收光譜儀測定K＋濃度；鉬銻抗比色法來測定無機(jī)磷濃度；熒光素-熒光素酶試劑盒測定ATP含量。

1.3.2.4 細(xì)菌素對敏感菌細(xì)胞膜完整性的影響

首先通過在260 nm和280 nm波長處在線監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)外紫外吸收物質(zhì)的含量變化，初步分析細(xì)菌素Bifidocin A對敏感菌細(xì)胞膜完整性的影響作用。然后，根據(jù)綠色熒光染料SYTO 9能夠滲透進(jìn)入所有細(xì)胞，包括膜受損及膜完整的細(xì)胞，而紅色熒光染料PI只能夠進(jìn)入膜破損的細(xì)胞并且與SYTO 9競爭結(jié)合位點(diǎn)的原理，采用PI和SYTO 9熒光探針對敏感菌細(xì)胞進(jìn)行雙熒光標(biāo)記，再次驗(yàn)證分析觀察細(xì)胞完整性情況[21]。具體方法為：1.3.2.1節(jié)中菌懸液樣品中加入2 μL PI-SYTO 9（1∶1，V/V）的混合熒光探針，室溫條件下避光育孵30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集標(biāo)記后菌體細(xì)胞，無菌生理鹽水重復(fù)漂洗3次。采用FV-1200激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況并采集復(fù)合圖片。

1.3.2.5 細(xì)菌素對敏感菌細(xì)胞膜PMF的影響

分別通過監(jiān)測細(xì)胞膜Δψ和ΔpH值變化分析細(xì)菌素Bifidocin A對細(xì)胞膜PMF的影響[8]。

ΔpH值的測定：經(jīng)10 mmol/L葡萄糖能量化的菌懸液分成4 管，每管20 μL。加入1 μL 50 mg/mL（10 mmol/L）的2 ,7 -二羧乙基-5(6)-羧基熒光素（2 ,7 -bis-(2-carboxyethyl)5(6)-carboxyfluorescein，BCECF），混勻，室溫條件下放置5 min，然后加入1 mL緩沖液搖勻，12 000 r/min離心1 min，沉淀含有一定數(shù)量的BCECF（通過黃色程度可判斷）。加入2～3 μL HCl酸處理后，用1 mL緩沖液洗4 次，搖勻后離心，最終懸浮于200 μL緩沖液中。一管作對照，其他3 管分別加入1 μmol/L Nigericin、Valinomycin、Bifidocin A，立即用熒光光度計(jì)測其胞內(nèi)BCECF的熒光值，用5 nm的狹縫，激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長525 nm，掃描5 min。

Δψ的測定：將含有10 mmol/L葡萄糖的細(xì)胞懸浮液和0.4 μmol/L DISC3(5)混合，直到DISC3(5)達(dá)到最大吸收。然后加入100 mmol/L KCl來平衡細(xì)胞外和胞內(nèi)的K＋濃度，各取1 mL細(xì)胞懸浮液，分別加入1 μmol/L Nigericin、Valinomycin、Bifidocin A，立即測其熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長622 nm，發(fā)射波長670 nm，掃描10 min。由于細(xì)胞膜受到破壞，最大吸收熒光量將上升。用細(xì)胞和染料的混合物做空白調(diào)零。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取其平均值。采用SAS 8.1、Microsoft Excel 2003及Design Expert 7.1.3軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性分析

2.1.1 MIC測定結(jié)果

當(dāng)細(xì)菌素Bifidocin A樣品質(zhì)量濃度大于或等于0.058 μg/mL時，樣品菌懸液中OD600nm未見增大，由此確定該細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌CVCC 26112的最低抑菌濃度為0.058 μg/mL。

2.1.2 細(xì)菌素Bifidocin A對敏感菌生長的抑制作用

圖 1 細(xì)菌素Bifidocin A處理后金黃色葡萄球菌活菌數(shù)變化曲線Fig. 1 Effect of bifi docin A on viable Staphylococcus aureus counts

由圖1可知，當(dāng)細(xì)菌素質(zhì)量濃度為1×MIC（0.058 μg/mL）時，敏感菌活菌數(shù)變化不顯著（P＞0.05），說明1×MIC水平細(xì)菌素對該敏感菌的作用表現(xiàn)抑菌作用方式；當(dāng)細(xì)菌素濃度為2×MIC（0.116 μg/mL）時，敏感菌活菌數(shù)變化顯著（P＜0.05），但是處理24 h內(nèi)活菌數(shù)的下降值

不足3（lg（CFU/mL））（即致死率＜99.9%），說明2×MIC水平細(xì)菌素對該敏感菌的作用仍表現(xiàn)抑菌作用方式；當(dāng)細(xì)菌素質(zhì)量濃度為4×MIC（0.232 μg/mL）時，敏感菌活菌數(shù)變化顯著（P＜0.05），且在處理12 h后活菌數(shù)的下降已達(dá)3.13（lg（CFU/mL））（即致死率＞99.9%），說明4×MIC水平細(xì)菌素對該敏感菌表現(xiàn)為殺菌作用方式。以上結(jié)果表明，細(xì)菌素Bifidocin A對金黃色葡萄球菌CVCC 26112的抑制作用存在濃度依賴性。

2.2 抑菌機(jī)理研究

2.2.1 對敏感菌細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響

圖 2 細(xì)菌素Bifidocin A處理前后金黃色葡萄球菌細(xì)胞的SEM圖Fig. 2 SEM of Staphylococcus aureus cells treated with bifi docin A for 0 (A), 1 (B), 2 (C) and 3 (D) h

如圖2所示，可知未經(jīng)細(xì)菌素處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面光滑、外形規(guī)則；經(jīng)過細(xì)菌素處理至1 h左右的細(xì)胞表面出現(xiàn)少量粗糙及褶皺，形態(tài)輕微不規(guī)則；當(dāng)細(xì)菌素作用時間延長至2～3 h時，細(xì)胞表面粗糙加重、褶皺變多，出現(xiàn)嚴(yán)重塌陷且形態(tài)扭曲；并且出現(xiàn)少量細(xì)胞破洞。未經(jīng)細(xì)菌素作用的金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整、細(xì)胞表面光滑、外形規(guī)則，經(jīng)細(xì)菌素處理至1 h左右，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)少量塌陷、凹槽并伴有有褶皺；處理2 h后，細(xì)胞表面粗糙、有褶皺，并且出現(xiàn)大量塌陷；當(dāng)時間延長至3 h左右時，褶皺加深，塌陷加重。以上結(jié)果表明，細(xì)菌素的作用明顯改變了細(xì)胞外部形態(tài)。如圖3所示，可知未經(jīng)細(xì)菌素處理的細(xì)胞內(nèi)部原生質(zhì)體分布均勻、細(xì)胞完整；經(jīng)細(xì)菌素Bifidocin A處理1 h后細(xì)胞中原生質(zhì)無明顯變化；但是處理2 h后，細(xì)胞中原生質(zhì)團(tuán)聚、分布不均勻，有少量胞內(nèi)物質(zhì)流失；而當(dāng)處理時間延長至3 h時，內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞程度較嚴(yán)重，有大量胞內(nèi)物質(zhì)流失。以上均表明，細(xì)菌素Bifidocin A可改變敏感菌細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。對比圖2和圖3結(jié)果，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素作用后，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)與外部結(jié)構(gòu)在不同時間的變化程度有差異。

圖 3 細(xì)菌素Bifidocin A處理前后金黃色葡萄球菌細(xì)胞的TEM圖Fig. 3 Transmission electron micrographs of Staphylococcus aureus cells treated and not treated with bifi docin A

2.2.2 對敏感菌細(xì)胞膜通透性的影響

圖 4 細(xì)菌素Bifidocin A處理前后金黃色葡萄球菌細(xì)胞內(nèi)外K＋（A）、無機(jī)磷離子（B）及ATP（C）濃度變化Fig. 4 Changes in intracellular and extracellular K＋(A), inorganic phosphate (B) and ATP levels (C) in Staphylococcus aureus cells before and after treatment with bifi docin A

由圖4可知，經(jīng)細(xì)菌素Bifidocin A作用后，敏感菌胞內(nèi)K＋、無機(jī)磷離子及ATP在短時間內(nèi)均發(fā)生一定程度的泄漏；處理2 h后胞內(nèi)K＋濃度明顯由64 μmol/L下降至17 μmol/L左右（圖4A）；處理至1.5 h時，其胞內(nèi)無機(jī)磷離子濃度明顯由72 μmol/L下降至22 μmol/L（圖4B）；處理1.5 h后，ATP濃度最初的180 μmol/L下降至78 μmol/L（圖4C）；同時，胞外的各類物質(zhì)濃度相應(yīng)提高。以上結(jié)果表明，細(xì)菌素Bifidocin A可增加敏感菌細(xì)胞膜的通透性，形成孔洞，使小分子物質(zhì)和大分子物質(zhì)同時泄漏。

2.2.3 對敏感菌細(xì)胞膜完整性的影響

圖 5 細(xì)菌素Bifidocin A處理前后金黃色葡萄球菌細(xì)胞胞外紫外吸收物質(zhì)的泄漏Fig. 5 Release of extracellular UV-absorbing materials from Staphylococcus aureus cells detected at 260 nm and 280 nm

如圖5所示，經(jīng)細(xì)菌素作用2 h左右，敏感菌胞外紫外吸收物質(zhì)濃度快速上升，與對照相比，OD260nm由0.03上升至0.590，而OD280nm則由0.02迅速增加至0.370。結(jié)果表明，該細(xì)菌素增加敏感菌細(xì)胞膜的通透性的同時，也破壞了其完整性。

圖 6 細(xì)菌素Bifidocin A處理前后金黃色葡萄球菌細(xì)胞的激光共聚掃描顯微鏡圖Fig. 6 Confocal laser scanning micrographs of Staphylococcus aureus cells not treated (A) and treated with bifi docin A for 1 (B), 2 (C), and 3 (D) h

如圖6所示，對照組和經(jīng)細(xì)菌素作用1 h左右的細(xì)胞中大部分細(xì)胞發(fā)綠色熒光，隨著處理時間延長，發(fā)綠色熒光的細(xì)胞逐漸減少，而發(fā)黃色或紅色熒光的細(xì)胞逐漸增多；當(dāng)處理時間延長到3 h時，絕大多數(shù)細(xì)胞都發(fā)紅色熒光或中間態(tài)的黃色熒光，且紅色熒光細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于中間態(tài)的黃色熒光及少數(shù)量的綠色熒光。以上表明，在未經(jīng)細(xì)菌素作用和短時間作用的樣品中大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，排斥PI，細(xì)胞主要顯示為綠色熒光；隨著作用時間的延長，PI逐漸進(jìn)入細(xì)胞與SYTO 9競爭取代結(jié)合位點(diǎn)，熒光顏色由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色或黃色，細(xì)胞膜受損程度增加，細(xì)菌素處理破壞了敏感菌細(xì)胞膜的完整性。

2.2.4 對敏感菌細(xì)胞膜PMF的影響

圖 7 細(xì)菌素Bifidocin A處理前后金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜上Δψ（A）和ΔpH（B）值的變化Fig. 7 Transmembrane electrical potential (Δψ) (A) and transmembrane pH gradient (ΔpH) (B) in Staphylococcus aureus cells

1.0 μmol/L的K＋/H＋離子交換劑Nigericin可以迅速破壞胞內(nèi)外ΔpH值，導(dǎo)致胞內(nèi)外界pH值相同。為了確定ΔpH值是唯一變量，加入1.0 μmol/L的K＋離子載體Valinomycin將Δψ轉(zhuǎn)化為最大ΔpH值。由圖7A可以看出，菌懸液細(xì)胞經(jīng)Valinomycin處理與對照相比，熒光強(qiáng)度較接近，表明pH值維持在正常水平，未受到破壞；而細(xì)菌素Bifidocin A處理可導(dǎo)致敏感菌胞內(nèi)熒光強(qiáng)度2 min內(nèi)迅速上升至782左右水平，處理至4 min時，熒光強(qiáng)度變化趨于平穩(wěn)狀態(tài)并保持穩(wěn)定（圖7A）；細(xì)菌素作用與Nigericin處理相比，敏感菌經(jīng)細(xì)菌素作用所引起熒光強(qiáng)度增加程度均低于Nigericin作用效果，可見，細(xì)菌素Bifidocin A處理引起敏感菌細(xì)胞氫離子的部分耗散，而不是完全喪失。

采用熒光探針DISC3(5)來定量測定敏感菌細(xì)胞膜Δψ，如果膜受到破壞，膜電勢將耗散，DISC3(5)將釋放到培養(yǎng)基中，引起熒光強(qiáng)度上升。在1.0 μmol/L Nigericin存在情況下，敏感菌細(xì)胞可以維持最大的Δψ，而1.0 μmol/L的Valinomycin可以完全破壞Δψ。由圖7B可知，和對照相比，細(xì)菌素Bifidocin A的添加可引起熒光強(qiáng)度的迅速上升，最初4 min內(nèi)熒光強(qiáng)度即由106上升至577，非常接近Valinomycin的破壞效果，隨著時間的延長，熒光強(qiáng)度變化趨于平穩(wěn)。這些結(jié)果表明，細(xì)菌素Bifidocin A作用引起敏感菌細(xì)胞Δψ的幾乎完全耗散。

3 討論與結(jié)論

首先研究了雙歧桿菌細(xì)菌素Bifidocin A對金黃色葡萄球菌的抑菌作用，確定其MIC為0.058 μg/mL，發(fā)現(xiàn)其MIC維持在相對較低的質(zhì)量濃度范圍，且明顯低于已報(bào)道的Bifidocin B[22]、Bifidin I[23]等其他雙歧桿菌細(xì)菌素，說明該細(xì)菌素的抑菌活性較強(qiáng)，有較大的應(yīng)用潛力；同時發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌CVCC 26112的抑制作用存在濃度依賴性，所獲研究數(shù)據(jù)可為將來的工業(yè)化應(yīng)用添加質(zhì)量濃度的選擇提供直接參考依據(jù)。

其次，重點(diǎn)從細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜的通透性、細(xì)胞膜的完整性以及細(xì)胞膜質(zhì)子移動勢的變化4 個角度分別探討了細(xì)菌素Bifidocin A對金黃色葡萄球菌的抑菌作用機(jī)制。結(jié)果表明，和其他乳酸菌細(xì)菌素一樣，雙歧桿菌細(xì)菌素Bifidocin A作用的主要部位同樣是在敏感菌細(xì)胞膜上，其抑菌機(jī)制主要是通過耗散細(xì)胞膜質(zhì)子移動勢，增加細(xì)胞膜通透性，形成孔洞，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜完整性，并最終瓦解細(xì)胞。綜合細(xì)胞膜通透性及質(zhì)子移動勢測定指標(biāo)，推測質(zhì)子動力勢的成分Δψ和ΔpH值的消耗可以幫助細(xì)菌素插入敏感菌細(xì)胞膜形成孔洞并導(dǎo)致包內(nèi)物質(zhì)泄漏，這與Moll[24]、Sharma[25]以及Zhou Kang[26]等研究結(jié)論一致。然而，與已報(bào)道的Piscicocin CS526[27]、Lacticin 3147[28]等細(xì)菌素抑菌機(jī)制所不同的是，這些細(xì)菌素作用后形成的是只能通過小分子的選擇性孔洞，而雙歧桿菌細(xì)菌素Bifidocin A作用后形成的是無選擇性孔洞，它可使小分子物質(zhì)（K＋和無機(jī)磷離子）和大分子物質(zhì)（ATP）同時泄漏。結(jié)合SEM和TEM分析結(jié)果，可以看出，在敏感菌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重形態(tài)變化前細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞，表明與敏感菌外部形態(tài)相比，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)（包括蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞器如核糖體等）對細(xì)菌素的作用表現(xiàn)得更加敏感。結(jié)合激光共聚焦顯微鏡分析結(jié)果，可以推測在細(xì)菌素處理后，存在一些細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相對完整但是內(nèi)部組織破壞嚴(yán)重且已不可被培養(yǎng)的細(xì)胞。

此外，已有研究報(bào)道部分細(xì)菌素對敏感菌的抑菌作用還可能與其細(xì)胞內(nèi)能量代謝及糖類轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等部分相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)[29]。如Ramnath等[30]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌素Mesentericin Y105對單增李斯特菌的抑制作用與受體細(xì)胞中甘露糖特定磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)有關(guān)。Bendali等[19]通過十二烷基硫酸鈉-聚乙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌細(xì)菌素處理后李斯特菌細(xì)胞內(nèi)少數(shù)蛋白表達(dá)量明顯下降，但未對這些蛋白進(jìn)行鑒定，對造成這種現(xiàn)象的原因也未給出合理解釋。基于此，未來將考慮采用差異蛋白組學(xué)技術(shù)分析細(xì)菌素Bifidocin A對敏感菌細(xì)胞膜蛋白組成及表達(dá)的影響。

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Antibacterial Activity and Mechanism of Bifidocin A against Staphylococcus aureus

LIU Guorong1, GAO Yakun1, WANG Xin1,2, LIU Yujie1, CAO Jilin1, WANG Chengtao1,*
(1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

Bifidocin A, produced by Bifidobacterium animalis BB04, is a novel bacteriocin with antimicrobial activity against a wide range of foodborne bacteria. The objective of this study was to investigate the antibacterial activity and mechanism of action of bifidocin A against Staphylococcus aureus. The minimum inhibitory concentration (MIC) of bifi docin A for Staphylococcus aureus CVCC 26112 was 0.058 μg/mL. Time-kill assays showed that bifi docin A effectively inhibited the growth of Staphylococcus aureus CVCC 26112 in a time- and concentration-dependent manner. Results also suggested that bifi docin A exerted its anti-Staphylococcus aureus effect through the dissipation of the cytoplasmic membrane proton motive force (PMF), increased membrane permeability, and the formation of cell membrane pores, leading to the destruction of membrane integrity and ultimately complete disintegration of the cells.

bacteriocin; Bifi dobacterium spp.; Staphylococcus aureus; antibacterial activity; antibacterial mechanism

10.7506/spkx1002-6630-201717001

TS201.3

A

1002-6630（2017）17-0001-07

劉國榮, 郜亞昆, 王欣, 等. 雙歧桿菌細(xì)菌素Bifidocin A對金黃色葡萄球菌的抑菌作用及其機(jī)制[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 1-7. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717001. http://www.spkx.net.cn

LIU Guorong, GAO Yakun, WANG Xin, et al. Antibacterial activity and mechanism of bifi docin A against Staphylococcus aureus[J]. Food Science, 2017, 38(17): 1-7. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717001. http://www.spkx.net.cn

2016-11-12

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31671832）；北京市屬高校高水平教師隊(duì)伍建設(shè)支持計(jì)劃青年拔尖人才培育計(jì)劃項(xiàng)目（CIT&TCD201704034）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31201407）

劉國榮（1983—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槿樗峋捌浠钚源x產(chǎn)物的理論與應(yīng)用。E-mail：liuguorong@th.btbu.edu.cn

*通信作者：王成濤（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c發(fā)酵技術(shù)。E-mail：wangchengtao@th.btbu.edu.cn