轉(zhuǎn)基因植物的篩選與鑒定

王迪

摘 要：隨著植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷進(jìn)步，它對(duì)于分子遺傳學(xué)研究和植物改良都具有特別重要的意義。轉(zhuǎn)基因植株的篩選在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中起著關(guān)鍵性的作用。將含有35S啟動(dòng)子的基因載體PMDC150經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，利用農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序的方法轉(zhuǎn)入擬南芥后得到T1代種子。文章通過組織培養(yǎng)來篩選含有Kan抗性的轉(zhuǎn)基因植株。

關(guān)鍵詞：擬南芥；轉(zhuǎn)基因植物；篩選

中圖分類號(hào)：Q943 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2017）24-0087-02

1 文獻(xiàn)綜述

1.1 轉(zhuǎn)基因植物的研究進(jìn)展

植物的遺傳轉(zhuǎn)化是指利用重組DNA，細(xì)胞組織培養(yǎng)等方法，將外源基因?qū)氲街参锏慕M織或細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)[1]。從轉(zhuǎn)基因植株成功之后，轉(zhuǎn)基因技術(shù)飛速發(fā)展，如今，植物在抗病、抗蟲和抗藥等方面都有了轉(zhuǎn)基因植株。這種技術(shù)對(duì)改進(jìn)農(nóng)作物品質(zhì)、提高產(chǎn)量等方面都有非常大的幫助。

1.2 基因轉(zhuǎn)化技術(shù)

隨著人們對(duì)基因轉(zhuǎn)化技術(shù)不斷地深入研究和探索，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種基因轉(zhuǎn)化的方法，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化、花粉管通道法等。相比較其他植物基因的轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法有著減少成本、容易操作等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)宿主細(xì)胞有著嚴(yán)格的要求。每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，所以根據(jù)植物的不同種類，我們要選擇合理的轉(zhuǎn)化方法，達(dá)到理想的轉(zhuǎn)化效果。

1.3 本論文的目的和意義

植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)日新月異迅速發(fā)展，已經(jīng)成為許多國家重點(diǎn)發(fā)展的新目標(biāo)新領(lǐng)域，它所產(chǎn)生的巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益促使各個(gè)國家對(duì)其進(jìn)行更加深入的研究，由其產(chǎn)生的巨大的生產(chǎn)潛能一定會(huì)推動(dòng)社會(huì)的進(jìn)步，改善人類現(xiàn)有的生產(chǎn)、生活質(zhì)量以及健康水平。

本文以擬南芥為主要研究對(duì)象，通過轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序的方法及組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因植物的篩選。借由本次實(shí)驗(yàn)研究，可深入了解基因工程等相關(guān)領(lǐng)域的理論，可熟練掌握相關(guān)技術(shù)例如無菌操作技術(shù)、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)、植物組織培養(yǎng)技術(shù)等等。

2 轉(zhuǎn)基因植物的篩選與鑒定

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 植物材料

擬南芥

2.1.2 載體與菌株

重組表達(dá)載體PMDC150-35S（由實(shí)驗(yàn)室提供）、農(nóng)桿菌菌株GV3101

2.1.3 主要試劑

75%酒精、84消毒液、侵染緩沖液、限制性內(nèi)切酶、卡那霉素、壯觀霉素（重組表達(dá)載體含有的抗性）、利福平

2.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L瓊脂（只固體培養(yǎng)基添加）

1/2MS培養(yǎng)基

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 擬南芥種植：將種子放在浸過水的濾紙上，放在4℃的冰箱中，不見光培養(yǎng)24小時(shí)，然后取出種子種在營養(yǎng)土里，在光照強(qiáng)度8000Lux，溫度25℃的培養(yǎng)箱中經(jīng)過光照16小時(shí)/黑暗8小時(shí)培養(yǎng)[2]。

2.2.2 電轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌

電轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備：準(zhǔn)備好要轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，將農(nóng)桿菌細(xì)胞處于感受態(tài)，并放在冰上解凍（約3-5min）。

（1）將放有感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞的冰桶轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)，用移液器將質(zhì)粒DNA和農(nóng)桿菌細(xì)胞混合，并用移液器上下吹吸使其混勻。放于冰上3min。（2）將混合液轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯。（3）用電轉(zhuǎn)電擊3-5s。（4）取出電轉(zhuǎn)杯，加入800l的LB液體培養(yǎng)基，混勻并轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中。（5）放于28℃下，振蕩培養(yǎng)3h。（6）在此期間，配置添加有100g/ml壯觀霉素抗性的LB固體平板，約15min培養(yǎng)基凝固后蓋好蓋，倒置放置。（7）將（5）的懸液離心。取出上上清液，放入800l LB培養(yǎng)基再培養(yǎng)。50min后涂板。（8）取20l LB培養(yǎng)基和30l轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌分別先后加入到平板。（9）放于28℃下培養(yǎng)兩天。

2.2.3 質(zhì)粒提取及鑒定

將以上轉(zhuǎn)化出的菌斑挑取培養(yǎng)，在28℃下培養(yǎng)24h。

質(zhì)粒用質(zhì)粒提取試劑盒提取，并經(jīng)酶切鑒定[3]

酶切體系（20L）：

DdH2O 14.9L

10×buffer 2L

質(zhì)粒 3L

內(nèi)切酶 0.1L

（37℃酶切0.5個(gè)小時(shí)）

2.2.4 農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序

侵染緩沖液的配置：200ml滅菌水、5g蔗糖、40L有機(jī)硅：（1）將經(jīng)擴(kuò)增的陽性菌株離心進(jìn)行收集，棄去上清液。（2）將收集到的菌株沉淀懸浮于緩沖液中，并使其混合均勻。（3）用移液槍將上述混勻的懸浮液加入到擬南芥的花苞上，避光處理20分鐘，等到菌液快干時(shí)再取些懸浮液滴到花苞上，最后將侵染后的擬南芥用保鮮膜包好，放在避光處過夜，次日揭掉保鮮膜，將侵染后的花苞暴露在日光下使其正常生長[2]。（4）培養(yǎng)一段時(shí)間后，獲得成熟的擬南芥種子。

2.2.5 組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株

（1）種子的消毒處理：將擬南芥種子（T1）經(jīng)75%酒精進(jìn)行表面消毒2分鐘，再用滅菌水清洗2次，然后加入84消毒液、滅菌水、Trition放在搖床上搖30分鐘，最后用滅菌水清洗2-3次。（2）將滅菌后的種子用一定的瓊脂懸浮均勻，用移液槍將懸浮好的擬南芥種子接種于添加50mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，封口膜封好，并做好標(biāo)記[4]。于4℃冰箱中黑暗處理24h，后置于培養(yǎng)箱，條件為光照16小時(shí)/黑暗8小時(shí)，光照強(qiáng)度8000Lux，溫度23℃[5]。（3）觀察各種子的生長情況。黃化的子葉逐漸枯萎，綠色的子葉繼續(xù)生長，即為轉(zhuǎn)化成功。（4）當(dāng)綠苗長到一定程度后，再移到營養(yǎng)土中培養(yǎng)。

3 結(jié)果與分析endprint

3.1 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化鑒定

對(duì)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示。

BamHI單酶切質(zhì)粒，所得正確條帶大小為：11000bp，10500bp，1400bp，521bp

第一條：重組表達(dá)載體PMDC150-35S，為正確條帶。

第二條：PMDC150酶切對(duì)照

第三條：Marker

由轉(zhuǎn)化鑒定圖可以看出，酶切片段的大小和重組表達(dá)載體的大小幾乎一致。結(jié)果表明農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功。

3.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行篩選，在其他條件都相同的情況下，在分別含有37.5mg/L，40mg/L，50mg/L，60mg/L，70mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)篩選，結(jié)果如下表1：

表中數(shù)據(jù)表明，篩選的最適濃度為50mg/L。

因此選用含有50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基來培養(yǎng)植株，成活率最高，且非轉(zhuǎn)基因幼苗會(huì)變黃而逐漸死亡，綠色的轉(zhuǎn)基因植株得以存活。

4 結(jié)論

將含有35S啟動(dòng)子的基因載體PMDC150轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后，再用轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌侵染擬南芥花序，培養(yǎng)后得到T1代種子，再用特定培養(yǎng)基篩選出綠色的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。

由實(shí)驗(yàn)過程可以看出，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有較低成本、容易操作而轉(zhuǎn)化成功率高等優(yōu)點(diǎn)，但卻受宿主細(xì)胞基因型的限制[6]。所以，根據(jù)植物的不同種類，我們要選擇合理的轉(zhuǎn)化方法，以達(dá)到理想的轉(zhuǎn)化效果。

參考文獻(xiàn)：

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