吸入用七氟烷的微生物穩(wěn)定性考察

張靜，張春華，鄧維，鐘振華，陳珍珍，劉緒平

江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點(diǎn)實(shí)驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

吸入用七氟烷為鹵代吸入性全身麻醉藥，目前廣泛用于兒童及成人誘導(dǎo)麻醉和維持麻醉，對嚴(yán)重缺血性心臟病而施行高危心臟手術(shù)者尤為適合。制劑由七氟烷原料直接分量灌裝而成，不含任何添加劑或化學(xué)穩(wěn)定劑，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)收載于《中國藥典》2015 年版二部［1］。吸入用七氟烷通過呼吸道進(jìn)入肺部從而產(chǎn)生麻醉作用，必須對制劑的微生物指標(biāo)進(jìn)行控制，且應(yīng)該將微生物指標(biāo)作為質(zhì)量控制的指標(biāo)之一，但是參考《中國藥典》2015 年版四部［2］通則0111 吸入制劑類中的4 類制劑，并無適合吸入用七氟烷微生物檢查的限度要求，所以該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并沒有對微生物限度進(jìn)行控制。因此，本研究依據(jù)《中國藥典》（2015 年版）四部通則1105、1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法建立吸入用七氟烷的微生物限度檢查方法，并參考四部通則0111 吸入制劑及1107 非無菌樣品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，對45 批次樣品進(jìn)行微生物檢測并做出結(jié)果判定。

選取4 家生產(chǎn)企業(yè)共45 批次吸入用七氟烷進(jìn)行微生物穩(wěn)定性考察，建立微生物限度檢查方法［3-5］，并參照《中國藥典》（2015 年版）四部通則1121 抑菌效力檢查法對其進(jìn)行抑菌效力考察，以評價吸入用七氟烷對微生物污染的防控能力。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

YXQ-LS-50S Ⅱ型高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)醫(yī)療器械有限公司）；SW-CJ-2D 凈化工作臺（蘇州凈化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；PYX-DHS 細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；KB400 霉菌培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司）；HH.W21.600S 電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；FE20K pH 計（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Sartorious T601-L 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

吸入用七氟烷樣品來源于4 家企業(yè)共45 批次。

pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基；胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基均購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。培養(yǎng)基適用性檢查實(shí)驗結(jié)果均符合《中國藥典》2015 年版要求［6-7］。

1.3 實(shí)驗菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）［CMCC（B）26003］、大腸埃希菌（Escherichia coli）［CMCC（B）44102］、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）［CMCC（B）10104］、白色念珠菌（Candida albicans）［CMCC（F）98001］、黑曲霉（Aspergillus niger）［CMCC（F）98003］，以上菌種0 代均源自中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心，試驗所用菌株均為第2 代。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法適用性試驗

2.1.1 菌懸液制備金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌于胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)18～24 h；白色念珠菌采用沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h。取上述新鮮培養(yǎng)物，用0.9 %無菌氯化鈉溶液10 倍稀釋至每1 mL 含菌數(shù)為108cfu 的菌懸液，備用；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)1 周，加入5 mL含0.05 %聚山梨酯80的0.9 %無菌氯化鈉溶液，并用塞入無菌脫脂棉的吸管洗脫孢子，用含0.05 %聚山梨酯80 的0.9 %無菌氯化鈉溶液采用比濁法制成每1 mL 含孢子數(shù)為107cfu 的孢子懸液，備用。

2.1.2 方法適用性考察取本品10 mL 置滅菌錐形瓶中，加入含2%聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀3 000r/min 勻漿五分鐘，制成1∶10 供試液。取1∶10 供試液10 mL，加入含2%聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至20 mL，搖勻，制成1∶20 供試液。

對樣品進(jìn)行方法適用性考察，以確定在該方法下，能有效檢查出供試品中的菌落，方法適用性結(jié)果的回收率=（試驗組菌落數(shù)－供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)×100%。經(jīng)過驗證，吸入用七氟烷可使用平皿法（取1∶20 的供試液，每皿1 mL）測定需氧菌總數(shù)，取1∶10 供試液10 mL 按薄膜過濾法，全量通過濾膜后，測定霉菌和酵母菌總數(shù)，回收率均大于80 %，符合《中國藥典》（2015 年版）的要求。取1∶10 供試液10 mL 至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，檢查大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌；取1∶10 供試液10 mL 至200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，檢查銅綠假單胞菌；取供試品10 mL，加入含2%聚山梨酯80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀3 000 r/min 勻漿五分鐘，經(jīng)25℃培養(yǎng)2 h 后，取供試液1 mL，加入15 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，檢查耐膽鹽革蘭陰性菌。

2.1.3 樣品微生物檢測根據(jù)樣品性質(zhì)［8］（通過呼吸道進(jìn)入肺產(chǎn)生麻醉作用），限度指標(biāo)參照呼吸道吸入給藥制劑：需氧菌總數(shù)≤102cfu/mL，霉菌和酵母菌總數(shù)≤101cfu/mL，不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、耐膽鹽革蘭陰性菌（1 mL）。使用上述方法對45 批次吸入用七氟烷進(jìn)行微生物檢驗，微生物限度均在合格范圍內(nèi)。

2.2 防腐效力考察

按照《中國藥典》（2015 年版）四部通則1121抑菌效力檢查法取樣品5 份，每份直接接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單孢菌、白色念珠菌和黑曲霉孢子懸液1.0 mL，使接種后供試液染菌量為106～107cfu/mL，充分混勻后置25 ℃避光貯存。在接種后的0 d、14 d、28 d 取樣，對菌落數(shù)量進(jìn)行測定。防腐效力挑戰(zhàn)實(shí)驗未通過，考察結(jié)果見表1。

表1 防腐效力檢測結(jié)果

3 討論

吸入用七氟烷是由七氟烷制成的吸入劑，在生產(chǎn)和使用中，容易帶入微生物污染風(fēng)險［9,10］。吸入制劑通過呼吸道，參照《中國藥典》2015 年版四部通則0111 吸入制劑類，應(yīng)照非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查或吸入液體制劑按照無菌檢查法檢查。根據(jù)樣品性質(zhì)（通過呼吸道進(jìn)入肺產(chǎn)生麻醉作用），建議增加微生物限度檢查，限度指標(biāo)參照呼吸道吸入給藥制劑：需氧菌總數(shù)≤102cfu/mL，霉菌和酵母菌總數(shù)≤101cfu/mL，不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、耐膽鹽革蘭陰性菌（1 mL）。

對4 個生產(chǎn)企業(yè)的45 批次樣品進(jìn)行微生物檢查，均符合要求。但是抑菌效力實(shí)驗發(fā)現(xiàn)吸入用七氟烷本身不利于細(xì)菌滋長，但也不會殺滅細(xì)菌，該制劑不能通過抑菌效力挑戰(zhàn)實(shí)驗。經(jīng)過企業(yè)調(diào)查得知國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)的吸入用七氟烷均是在D 級環(huán)境下將七氟烷原料分量灌裝的，因此吸入用七氟烷有被微生物污染的可能。結(jié)合樣品的生產(chǎn)環(huán)境，根據(jù)樣品性質(zhì)（通過呼吸道進(jìn)入肺產(chǎn)生麻醉作用），建議增加微生物限度檢查。