雜糧早餐粉對砷致小鼠生殖毒性的緩解作用

儀慧蘭,王娜

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

雜糧早餐粉對砷致小鼠生殖毒性的緩解作用

儀慧蘭,王娜

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

以昆明種純系雄性小白鼠為受試動物,檢測雜糧早餐粉對砷(As)引發(fā)的生殖毒性的影響。As染毒組小鼠飲用水中含10 mg/L的As,干預(yù)組在As染毒的同時用雜糧早餐粉灌胃,6周后檢測小鼠睪丸組織的抗氧化指標(biāo),并對睪丸組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,統(tǒng)計(jì)精子畸形率。結(jié)果表明：通過飲用水?dāng)z入As能誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動物睪丸組織氧化脅迫,使超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性下降,還原型谷胱甘肽(GSH)含量下降,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量顯著(P<0.05)升高,睪丸組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理性改變,精子異常率顯著(P<0.05)升高;用雜糧早餐粉干預(yù)后,小鼠睪丸組織的SOD和CAT活性提高,GSH含量升高,MDA含量降低,睪丸組織結(jié)構(gòu)趨于正常,精子畸形率下降。上述結(jié)果表明,所用雜糧早餐粉能使砷染毒動物的睪丸組織結(jié)構(gòu)和功能趨于對照組,對促進(jìn)男性健康具有積極的作用。

雜糧早餐粉;亞砷酸鈉;生殖毒性;氧化損傷

在自然環(huán)境中砷(As)元素廣泛存在,人為因素或自然過程導(dǎo)致一些地區(qū)的大氣、水體和土壤中As含量超標(biāo)。As的急性毒性作用早就被人們所認(rèn)知,但As的慢性毒性作用在近50 a才逐漸被認(rèn)識。人群As暴露的主要途徑是通過飲用水?dāng)z入As化合物,包括三價(jià)As和五價(jià)As。長期飲用As含量較高的水(>10 μg/L)會導(dǎo)致慢性As中毒,其中原生高As地下水引起的慢性As中毒最為多見。高As地下水分布于亞洲、歐洲、美洲、非洲、大洋洲和太平洋島嶼等70多個國家,230多個區(qū)域。初步統(tǒng)計(jì),飲用As含量大于50 μg/L水體的人口達(dá)5 700萬,飲用As含量大于10 μg/L水體的人口達(dá)13 700萬,亞洲地區(qū)受影響人口達(dá)到1億以上[1]。As暴露會對機(jī)體健康產(chǎn)生多種不利影響,可誘發(fā)呼吸系統(tǒng)、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)等多組織器官的病變[2-3]。As是國際癌癥研究組織(IARC)確認(rèn)的致癌物[4-5],具有致畸、致突變、致癌作用。中國高As地下水主要分布在內(nèi)蒙古、新疆、山西、吉林、江蘇、安徽、山東、河南、湖南、云南、貴州、臺灣等省(自治區(qū))的40個縣(旗、市)。在新疆自流井水中As濃度為70～830 μg/L,山西省高As水主要分布于大同和晉中盆地,地下水As濃度最高達(dá)到2.0～1 300 μg/L,在湖北地下水中As的最大濃度可達(dá)2 010 μg/L[1]。為促進(jìn)人群健康,我國發(fā)布的GB 5749-2006 中飲用水As含量最高限值為0.01 mg/L[6],與世界衛(wèi)生組織(WHO)給出的飲水As含量指導(dǎo)值一致。

流行病學(xué)調(diào)查顯示,As暴露與雄性生殖毒性有關(guān),分析山西省朔州地區(qū)As暴露人群的精液發(fā)現(xiàn),環(huán)境As暴露能導(dǎo)致精子質(zhì)量降低[7]。動物實(shí)驗(yàn)表明,As暴露組大鼠睪酮水平降低,精子質(zhì)量下降,基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平改變,多條代謝途徑異常,與雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能相關(guān)的生物學(xué)途徑異常[8];進(jìn)入機(jī)體的As會在睪丸、附睪、精囊和前列腺中累積,引起睪丸組織退化萎縮、生精細(xì)胞損害,致使精子數(shù)量減少、質(zhì)量下降、功能異常[9-11]。

現(xiàn)有研究認(rèn)為,As毒性與As暴露引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過量活性氧自由基(ROS)有關(guān)[12],ROS包括超氧陰離子自由基(O2-·)、羥基自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等。高水平ROS使機(jī)體處于氧化脅迫狀態(tài),能損傷DNA、蛋白質(zhì)、膜脂等生物大分子,導(dǎo)致細(xì)胞生理和結(jié)構(gòu)異常,從而引發(fā)機(jī)體炎癥與疾病等。我們課題組以小米、大豆、核桃等為原料研制了一款雜糧早餐粉,發(fā)現(xiàn)其具有較高的體外抗氧化能力[13]?；谏轿魇《鄠€地區(qū)居民飲用水As含量超標(biāo)的現(xiàn)實(shí),本研究測試了雜糧早餐粉對As生殖毒性的干預(yù)效應(yīng),探索通過飲食調(diào)節(jié)降低人群健康風(fēng)險(xiǎn)的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理

選健康昆明種純系雄性小白鼠30只,體重23±2 g,由山西醫(yī)科大學(xué)提供。按體重將小鼠隨機(jī)分為3組,每組10只。第一組為正常對照組,其余兩組為As(NaAsO2)染毒組和雜糧早餐粉干預(yù)組。實(shí)驗(yàn)動物自由取食和飲水,喂食山西醫(yī)科大學(xué)提供的專用全價(jià)大顆粒飼料。染毒組小鼠自由飲用含10 mg/L As的 NaAsO2溶液,連續(xù)染毒6周(As組);干預(yù)組小鼠在As染毒次日開始給予雜糧早餐粉[13]50%樣液灌胃,每周2次(As+早餐粉組);對照組則自由飲用蒸餾水。

實(shí)驗(yàn)期間每天定量給食,并觀察小鼠狀況,記錄飲水量,每周測量1次體重。染毒結(jié)束前12 h禁食。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物解剖與取材

染毒結(jié)束后稱量小鼠體重,將小鼠麻醉、解剖,摘取左側(cè)睪丸于4%中性甲醛中固定,用于組織切片,右側(cè)睪丸于-80℃冰箱保存用于抗氧化指標(biāo)檢測,取雙側(cè)附睪用于精子標(biāo)本制備。

1.3 睪丸組織氧化指標(biāo)測定

取凍存睪丸組織,制備10%的組織勻漿液。丙二醛(MDA)含量測定用硫代巴比妥酸法[14]。SOD活性測定采用改進(jìn)的抗壞血酸(維生素C)終止法[15]。過氧化氫酶(CAT)的活性測定用高錳酸鉀滴定法[16]。還原型谷胱甘肽(GSH)含量用DNTB比色法測定[17]。蛋白含量測定用考馬斯亮藍(lán)比色法[18]。

1.4 精子標(biāo)本制備與觀察

參照GB 15193.7—2003[19],取附睪用生理鹽水制備精子懸液,涂片后伊紅染色。精子畸形以無鉤、香蕉頭、胖頭、不定型頭、雙頭、尾折疊、雙尾為判定標(biāo)準(zhǔn)。每只小鼠檢查結(jié)構(gòu)完整、無重疊的精子約1 000個,計(jì)算精子畸形率。

1.5 睪丸組織切片與觀察

取甲醛固定的睪丸組織,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋后切片,蘇木素-伊紅染色[20],光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

各組所得數(shù)據(jù)用均值±SE表示,采用 SPSS 15進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用單因素方差分析方法,以P<0.05 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著,圖1和表1中用不同字母表示。

2 結(jié)果

2.1 染毒小鼠一般情況

在整個實(shí)驗(yàn)期間,實(shí)驗(yàn)動物未出現(xiàn)死亡,毛發(fā)順齊,行走無異常,飲食正常,大便成形。在實(shí)驗(yàn)的6周時間內(nèi),小鼠體重逐漸增加,各組間無明顯差異。As組和As+早餐粉組小鼠的飲水量無明顯差異,根據(jù)飲水量計(jì)算As攝入量,兩組小鼠的As攝入量日均為2 mg/kg體重。

2.2 As對小鼠睪丸組織的氧化損傷及早餐粉干預(yù)效應(yīng)(見圖1)

與蒸餾水對照組相比,As組睪丸組織的SOD和CAT活性顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.05),顯示As對實(shí)驗(yàn)動物睪丸組織存在氧化損傷效應(yīng)。早餐粉干預(yù)組的SOD和CAT活性顯著高于As組,MDA含量明顯低于As組(P<0.05),說明給予早餐粉干預(yù)能降低As對實(shí)驗(yàn)動物的氧化脅迫,減緩As引發(fā)的睪丸組織氧化損傷。

與蒸餾水對照組相比,As組睪丸組織中還原型GSH含量顯著降低(P<0.05),顯示As對實(shí)驗(yàn)動物抗氧化能力存在抑制作用；而早餐粉干預(yù)組的GSH含量明顯高于As組(P<0.05),說明早餐粉干預(yù)能降低As對實(shí)驗(yàn)動物的氧化脅迫,提高還原型GSH的水平。

Fig.1 Antioxidative index of testicular tissue in mice注:圖中a、b、c不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 小鼠睪丸勻漿液的抗氧化指標(biāo)

2.3 As對小鼠精子形態(tài)的影響及早餐粉干預(yù)效應(yīng)

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),As組精子畸形率顯著高于對照組(P<0.05),約為對照組的2倍,說明As能誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動物的精子畸形(表1)。在統(tǒng)計(jì)的7種精子畸形類型中,不同畸形占比順序?yàn)?尾折疊>胖頭>不定型頭>香蕉頭>無鉤>雙頭>雙尾。早餐粉干預(yù)組的精子畸形率顯著低于As單獨(dú)處理組。

2.4 As對小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)的影響及早餐粉干預(yù)效應(yīng)

睪丸是雄性動物的生殖器官,精子在其中生成。在光學(xué)顯微鏡下(見圖2),對照組小鼠生精小管形態(tài)規(guī)則,管壁生精上皮有5-8層細(xì)胞,各級生精細(xì)胞排列有序,生精小管之間間隙較小,管腔內(nèi)成熟精子比較多。As組的生精細(xì)胞排列紊亂,基膜破損,生精小管間隙增大,生精細(xì)胞層變薄,管腔內(nèi)成熟精子較少。As+早餐粉組的生精細(xì)胞排列比較規(guī)整,管腔內(nèi)成熟精子多于As組,睪丸組織結(jié)構(gòu)趨于正常,說明早餐粉能阻止As引發(fā)的睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷。

表1 小鼠精子畸形率 (x±s,%)

Fig.2 Structure of testicular tissue in mice圖2 小鼠睪丸組織切片

3 討論

本研究表明通過飲用水?dāng)z入As能誘發(fā)實(shí)驗(yàn)小鼠睪丸組織氧化脅迫和睪丸結(jié)構(gòu)的損傷,As暴露造成的這些毒性效應(yīng)可被雜糧早餐粉阻止。前期關(guān)于As毒性的研究認(rèn)為As毒性源自ROS的生成,As誘導(dǎo)的ROS除了O2-·、H2O2、·OH外,還有(CH3)2AsOO·,均能破壞DNA分子[1,9,21]?；钚缘?RNS)也參與了As對DNA的損傷[22]。研究表明,亞砷酸鈉暴露可降低小鼠睪丸組織的抗氧化能力,使抗氧化酶活性降低,細(xì)胞代謝抑制,提高睪丸中的砷含量,脂質(zhì)過氧化、蛋白羰基化水平提高,氧化型谷胱甘肽水平提高[7,10],即As的生殖毒性也是體內(nèi)氧化還原平衡破壞的結(jié)果。

細(xì)胞抗氧化防御的第二條主線是GSH抗氧化系統(tǒng)。GSH是體內(nèi)重要的抗氧化劑,參與防御、解毒及損傷修復(fù),在對As的解毒過程中發(fā)揮了重要作用[11,23]。本研究中As暴露組動物的還原型GSH水平下降,氧化還原平衡破壞,用雜糧早餐粉干預(yù)后實(shí)驗(yàn)動物睪丸組織中還原型GSH水平回升,從另一方面說明雜糧早餐粉對As誘發(fā)的氧化脅迫具有緩解作用。

MDA作為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的水平,從而間接反映細(xì)胞氧化損傷程度。本研究中As組小鼠睪丸組織MDA含量顯著升高,說明As暴露造成了組織內(nèi)自由基的堆積,引起睪丸組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng),消耗了過多的內(nèi)源性抗氧化酶,從而使機(jī)體抗自由基能力下降,組織損傷加重。與As組比較,早餐粉干預(yù)組MDA含量顯著下降,說明早餐粉對As暴露引發(fā)的睪丸氧化損傷具有明顯的緩解作用。

組織學(xué)分析顯示,As暴露引起了睪丸表皮細(xì)胞壞死、生精小管降解,采用早餐粉干預(yù)可以使As暴露組動物的睪丸組織和功能更接近對照組。

本課題組研制的即食型雜糧早餐粉,在體外實(shí)驗(yàn)中50%樣液的ABTS+·清除率為48.64%,羥基自由基清除率為98.54%[13],表現(xiàn)了較高的抗氧化能力。本研究證實(shí)雜糧早餐粉對As暴露條件下實(shí)驗(yàn)動物體內(nèi)抗氧化能力的保護(hù)作用,并從睪丸組織結(jié)構(gòu)特征和精子形態(tài)兩方面展示了早餐粉的保護(hù)作用。外源抗氧化劑Vc可以降低As誘發(fā)的生殖毒性[12],可能與Vc具有還原性有關(guān)。而相較于Vc和維生素E等單一抗氧化劑,我們研制的雜糧早餐粉含有蛋白質(zhì)、糖類、礦物質(zhì)、黃酮類、花色素、多種維生素等均衡營養(yǎng)成分。其中,黃酮類、花色素等具有強(qiáng)抗氧化作用,進(jìn)入人體后通過血液循環(huán)到達(dá)各組織器官,被機(jī)體組織吸收,因其分子結(jié)構(gòu)上有多個酚羥基,可以通過自身氧化釋放電子,直接清除各種自由基,還能保護(hù)細(xì)胞膜上的脂質(zhì)不被氧化[24];蛋白、肽鏈和氨基酸能提供SH-,SH-可與As(Ⅲ)螯合從而降低As的移動性及其與細(xì)胞其它組分接觸的幾率,從而降低As的毒性。此外,早餐粉提供的均衡營養(yǎng)成分對機(jī)體抗氧化和代謝解毒過程具有重要作用,它們?yōu)榭寡趸父咝П磉_(dá)、非酶抗氧化分子快速合成提供了物質(zhì)基礎(chǔ),可使機(jī)體的抗氧化防御能力提高,保護(hù)機(jī)體免于氧化損傷。

總之,雜糧早餐粉對As引發(fā)的睪丸氧化脅迫有顯著的緩解作用,其效應(yīng)與早餐粉含有的天然抗氧化活性成分有關(guān),還與早餐粉提高As暴露動物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)功能有直接關(guān)系,其詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Antagonistic Effects of Grain Breakfast Powder on Arsenic-induced Male Reproductive Toxicity in Mice

YI Huilan,WANG Na

(School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

The antagonistic effects of grain breakfast powder on arsenic-induced reproductive toxicity were analyzed in male Kunming mice. The male mice were exposed to 10 mg/L As (sodium arsenite solution) for 6 weeks by drinking water. The mice of antagonistic group were given grain breakfast powder by gastric perfusion twice a week during As exposure. The present results showed that the superoxide dismutase (SOD) and catase (CAT) activities as well as glutathione (GSH) content in testicular tissue were decreased in As-treated mice,accompanied with the malondialdehyde (MDA) content increases(P<0.05),abnormal sperm and testicular structure damage(P<0.05). However,the SOD and CAT activities were increased after the mice were exposed to both As and the grain breakfast powder. GSH content was also increased,but MDA content was declined in testicular tissue of mice exposed to As together with the grain breakfast powder. Moreover,the abnormal sperm,and the damage to testicular structure caused by As intake was significant decreased. The results suggested that grain breakfast powder has significant protective effects on As-induced oxidative damage to testis and on male reproductive capability.

grain breakfast powder; sodium arsenite; reproductive toxicity; oxidative damage

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.03.028

2017-06-12；

2017-06-28

國家自然科學(xué)基金(30870454；30470318；31371868);優(yōu)秀人才科技創(chuàng)新項(xiàng)目(201605D211031)

儀慧蘭(1963-),女,山西新絳人,博士，教授,研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與功能食品。E-mail:yihl@sxu.edu.cn

TS201.2

A

0253-2395(2017)03-0609-06