球后Tenon囊下注射Bevacizumab對豚鼠脈絡膜新生血管的抑制作用研究

胡啟迪+朱冬青+易全勇+陳安穎+吳國海+鄔一楠

[摘要] 目的 比較Bevacizumab（貝伐單抗）球后Tenon囊下注射和玻璃體腔注射對氪激光誘導的豚鼠脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）生成及發(fā)育的影響。 方法 隨機數(shù)字表法將30只豚鼠右眼建立CNV模型后分為激光組、Tenon囊下組、玻璃體腔組，每組各10只。激光組僅進行光凝處理，Tenon囊下組和玻璃體腔組光凝后分別予以球后Tenon囊下和玻璃體腔注射Bevacizumab，21 d后全部行右眼吲哚菁綠血管造影（indocyanine green angiography，ICGA）、眼底彩照及HE染色觀察。 結果 ICGA檢查，各組激光斑CNV發(fā)生率分別為激光組（65.0%）、Tenon囊下組（58.0%）、玻璃體腔組（55.0%）；Tenon囊下組和玻璃體腔組CNV滲漏面積均比激光組減少（P<0.01），且兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；HE染色CNV最大中央厚度與ICGA檢查趨勢一致。 結論 Bevacizumab能夠抑制氪激光誘導的豚鼠CNV的發(fā)育，Bevacizumab球后Tenon囊下注射和玻璃體腔注射療效相近，為CNV的治療提供了新思路。

[關鍵詞] 貝伐單抗；玻璃體腔；Tenon囊；脈絡膜新生血管；豚鼠

[中圖分類號] R778.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）20-0036-04

[Abstract] Objective To compare the effects of retrobulbar Tenon subcapsular injection of bevacizumab and vitreous cavity injection on the formation and development of choroidal neovascularization（CNV） induced by krypton laser in guinea pigs. Methods CNV model was established in 30 right eyes of guinea pigs. The pigs were divided into three groups according to the random number table： laser group， Tenon subcapsular group and vitreous cavity group， with 10 pigs in each group. The laser group was only given photocoagulation. The Tenon subcapsular group and vitreous cavity group were given retrobulbar Tenon subcapsular injection and vitreous cavity injection of bevacizumab respectively after photocoagulation. After 21 days， indocyanine green angiography （ICGA）， fundus color photograph and HE staining were performed in all right eyes. Results ICGA examination showed that the number of laser spots showing fluorescence in each group（CNV incidence rate） were laser group（65.0%）， Tenon subcapsular group（58.0%）， vitreous cavity group （55.0%）； CNV leakage areas in the Tenon subcapsular group and vitreous cavity group were both less than the laser group（P<0.01）， and there was no statistically significant difference between the two groups（P>0.05）； CNV maximum central thickness by HE staining is consistent with the trend of ICGA examination. Conclusion Bevacizumab is able to inhibit the development of CNV induced by krypton laser in guinea pigs. Retrobulbar Tenon subcapsular injection and vitreous cavity injection of bevacizumab have a similar efficacy， providing a new thought for the treatment of CNV.

[Key words] Bevacizumab； Vitreous cavity； Tenon capsule； Choroidal neovascularization （CNV）； Guinea pigs

脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）是導致滲出型年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）、病理性近視、中心性滲出性脈絡膜視網(wǎng)膜炎、血管樣條紋癥、組織胞漿菌病綜合征等多種疾病視力嚴重下降的重要原因。目前國內(nèi)外學者對CNV發(fā)生、發(fā)展機制及其防治方法進行了大量深入的研究探索。Bevacizumab（貝伐單抗）是全長的人源化的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體，目前已有臨床研究顯示玻璃體腔內(nèi)注射Bevacizumab能促使多種原因[1-5]導致的CNV及特發(fā)性CNV[5，6]消退，黃斑水腫吸收[7，8]。但此種給藥方式可能會產(chǎn)生很多并發(fā)癥，如眼內(nèi)感染、眼內(nèi)出血、白內(nèi)障形成、視網(wǎng)膜脫離等[9]，危害嚴重，且該藥需反復注射，風險極高。球后Tenon囊下注射主要依靠藥物對后極部鞏膜的穿透而治療眼底病，幾乎無任何風險，可以頻繁注射。因此，本研究建立氪激光誘導的豚鼠CNV模型，通過比較玻璃體腔注射VEGF抑制劑Bevacizumab和球后Tenon囊下注射Bevacizumab的療效，以期發(fā)現(xiàn)療效好且并發(fā)癥少的治療方法，為CNV的治療提供新線索和新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

英國屬三色豚鼠30只，雌雄各半，年齡約3周齡，體質(zhì)量（150±10）g，購于北京維通利華動物實驗有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2014-2015。寧波大學實驗動物中心清潔級動物房飼養(yǎng)，自由進食飲水。所有動物的使用均遵照國家科學技術委員會于1988年頒布的《實驗動物管理條例》，并通過寧波市眼科醫(yī)院動物使用倫理委員會審核。

1.2 主要試劑和儀器設備

Bevacizumab（上海武昊經(jīng)貿(mào)有限公司），注射用吲哚菁綠（丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責任公司），海德堡眼底血管造影儀（HRA-2），多波長氪激光系統(tǒng)（Novus Omni； Lumenis Inc.），光學顯微鏡（Olympus BX51）。

1.3 模型建立方法

實驗前乙醚吸入麻醉動物，右眼復方托吡卡胺眼液充分散瞳，90 D前置鏡觀察眼底，用波長532 nm的氪激光在靠近視盤上方處進行光凝，光斑直徑50 μm，曝光時間100 ms，激光輸出功率140 mW，共10個點，分成2排，每排5個點，以光凝時氣泡感為Bruch膜破裂標志，出血或Bruch膜未破裂則計為無效點，每眼共光凝10個有效點。

1.4 動物分組和給藥

隨機數(shù)字表法將30只豚鼠建立CNV模型后分為激光組、Tenon囊下組、玻璃體腔組，每組各10只，雌雄各半。激光組只進行造模處理，Tenon囊下組和玻璃體腔組分別由球后Tenon囊下和玻璃體腔注射Bevacizumab（20 μL和5 μL）。Bevacizumab球后Tenon囊下注射方法：豚鼠取仰臥位，眼部皮膚用2%碘伏消毒，局部滴0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，在顳上方11：30 位角鞏膜緣后約1 mm處剪開球結膜和Tenon囊，切口長約1 mm，暴露出鞏膜，把彎曲成弧形的鈍性針頭（淚道沖洗針頭自制）沿鞏膜面進入赤道后部注藥，注射完成后結膜囊內(nèi)涂氧氟沙星眼膏。

1.5 觀察指標

（1）眼底照相及吲哚菁綠血管造影（indocyanine green angiography，ICGA）于光凝后21 d對各組豚鼠麻醉、散瞳、右眼拍攝眼底彩照。然后，自耳緣靜脈注入吲哚菁綠注射液（6 mg/kg），行ICGA檢查，測量CNV熒光素滲漏的面積。（2）視網(wǎng)膜HE染色 各組于ICGA結束后取右眼球進行視網(wǎng)膜HE染色，方法如下：應用過量乙醚麻醉處死豚鼠，迅速摘除右眼球，置于眼球固定液中，室溫過夜，自來水沖洗掉殘余的固定液后進行酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋后，以與視神經(jīng)矢狀軸平行連續(xù)切片，厚度4 μm，烘片烤片后，常規(guī)脫蠟，接著依次于100%、95%、80%和70%酒精2 min復水，最后HE染色10 min，自來水洗凈殘余蘇木素，鹽酸分化酒精10 s，1%氨水返藍，1%伊紅染色劑，脫水、透明、封片，并于光學顯微鏡下觀察。選取包含滿意激光斑的切片，量取CNV最大中央厚度，每個標本取3張切片進行統(tǒng)計學分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

成組設計實驗研究。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析處理，三組之間采用完全隨機設計資料的方差分析（單因素ANOVA），兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CNV的發(fā)生率

ICGA檢查結果顯示各組出現(xiàn)熒光的激光斑個數(shù)比例（CNV發(fā)生率）從高到低分別為：激光組（65.0%）、Tenon囊下組（58.0%）、玻璃體腔組（55.0%），見表1。

2.2 各組豚鼠CNV滲漏面積比較

光凝后第21天，各組眼底彩照示光凝區(qū)邊界清晰，無明顯水腫，中央呈火山口樣凹陷（封三圖4A）。激光組ICGA早期顯示邊界不甚清晰的花環(huán)樣CNV輪廓，CNV周圍無灌注區(qū)邊界亦不甚清晰（封三圖4B），Tenon囊下組和玻璃體腔組ICGA早期顯示CNV花環(huán)樣輪廓，CNV周圍無灌注區(qū)可見（封三圖4C、4D）。定量分析顯示Tenon囊下組和玻璃體腔組CNV滲漏面積與激光組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而前兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（封三圖4E）。

2.3 各組豚鼠CNV最大中央厚度比較

光凝后21 d，各組視網(wǎng)膜HE染色示CNV激光光斑處瘢痕組織牽拉視網(wǎng)膜，使其凹陷。CNV斑塊內(nèi)，色素性巨噬細胞、成纖維細胞、膠原纖維增多，并可見遷移增殖的視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和由血管內(nèi)皮細胞圍成的新生血管腔。三組CNV斑塊內(nèi)細胞成分類似（封三圖5A～5C）。定量分析顯示Tenon囊下組和玻璃體腔組CNV最大中央厚度與激光組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而前兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（封三圖5D）。

3 討論

CNV的發(fā)生機制尚未完全研究清楚，目前認為其是一種由多因素引起的病變，其病因分為眼局部因素和全身因素。眼局部因素方面，目前比較公認的是缺氧學說。該學說認為由于血循環(huán)異常、氧化損傷及炎癥反應等引起組織缺血缺氧，導致局部釋放出多種促血管生長因子，在促血管生長因子的作用下，異常生長的脈絡膜血管突破Bruch膜進入RPE或神經(jīng)上皮下生長[10]。全身因素包括動脈硬化、高血壓、吸煙和陽性家族史等，紫外線和飲食則是可疑因素[11]。本研究利用氪激光作用于豚鼠RPE和脈絡膜，或直接破壞Bruch膜或通過慢性炎癥作用逐漸溶解Bruch膜，而引發(fā)脈絡膜的損傷修復反應形成CNV。這一過程與人類CNV性疾病的病理發(fā)展過程是相似的[12]，因此氪激光誘導的CNV可以作為較理想的人類CNV性疾病模型。在此基礎上，應用Bevacizumab球后Tenon囊下注射進行干預治療，于光凝后21 d觀察CNV形成情況，并與玻璃體腔注射組進行比較。ICGA檢查結果顯示，Tenon囊下組和玻璃體腔組CNV發(fā)生率均低于單純激光造模組，CNV滲漏面積亦較激光組減少（P<0.01），且兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。同樣，通過HE染色比較三組CNV最大中央厚度結果也是如此。說明Bevacizumab能夠抑制氪激光誘導的豚鼠CNV的發(fā)育，Bevacizumab球后Tenon囊下注射和玻璃體腔注射療效相近。

球后Tenon囊下注射是眼科常用的給藥途徑，主要用于眼后節(jié)疾病的治療，依靠藥物對鞏膜的穿透性而達眼內(nèi)發(fā)揮作用。一系列研究表明，曲安奈德不僅在眼內(nèi)注射具有較好的效果，在鞏膜外應用也顯示了良好的治療黃斑水腫和CNV的作用[13-15]。我們的前期研究也顯示，球后Tenon囊下注射Bevacizumab可以獲得較高的眼內(nèi)治療濃度（>500 ng/mL），且和常規(guī)玻璃體腔注射給藥相比，全身血藥濃度并無顯著差異[16]。近年來亦有Bevacizumab鞏膜外給藥對視網(wǎng)膜新生血管作用的報道。劉德林等[17]通過建立早產(chǎn)高氧鼠視網(wǎng)膜病變大鼠模型，比較Bevacizumab球周注射和玻璃體腔注射對早產(chǎn)鼠視網(wǎng)膜病變的影響，發(fā)現(xiàn)兩者療效相近，但前者比后者更安全，這與本研究的結果是一致的。

雖然目前的研究幾乎一致表明玻璃體內(nèi)注射Bevacizumab可使眼部新生血管性疾病患者視力有明顯提高，大幅度提高患者的生活質(zhì)量，但如何避免因玻璃體內(nèi)注射藥物所引起的相關并發(fā)癥以及長期臨床使用安全性及有效性[18-20]仍需進一步探討。本研究以氪激光誘導的豚鼠CNV為研究對象，其與人的CNV病理過程畢竟不盡相同，豚鼠眼與人眼鞏膜對藥物的屏障作用也存在差異，因此本研究所得出的結論有一定局限性，但仍可為Bevacizumab球后Tenon囊下注射的臨床應用提供初步的實驗依據(jù)。在此基礎上開發(fā)通過鞏膜的緩釋裝置可減少注射次數(shù)，使患者長期維持有用視力，從而減輕家庭與社會負擔。因此對這一給藥途徑的應用作進一步研究有重要的臨床意義及潛在的經(jīng)濟效益和社會效益。

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（收稿日期：2017-03-27）