• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    牙鲆NR4A1基因在甲狀腺素誘導(dǎo)仔魚變態(tài)中的表達調(diào)控分析

    2017-09-04 01:28:58付元帥
    海洋漁業(yè) 2017年4期
    關(guān)鍵詞:牙鲆仔魚硫脲

    施 楊,居 慧,喻 杰,付元帥

    牙鲆NR4A1基因在甲狀腺素誘導(dǎo)仔魚變態(tài)中的表達調(diào)控分析

    施 楊1,居 慧2,喻 杰2,付元帥2

    (1.上海市食品研究所,上海 200235;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

    NR4A1基因是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)早期通過對靶基因的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。從牙鲆(Paralichthys olivaceus)中克隆了NR4A1基因cDNA序列,檢測了其在牙鲆變態(tài)中和成魚各組織中的表達模式,分析了其在外源甲狀腺素(TH)以及硫脲(TU)處理仔魚中的表達變化。結(jié)果表明,牙鲆NR4A1 cDNA全長3264 bp,編碼568個氨基酸;牙鲆NR4A1基因與其它物種具有很高的同源性,在系統(tǒng)進化樹中與魚類聚為一支;牙鲆NR4A1基因在成魚心、肌肉和鰓中高表達;在變態(tài)過程中,NR4A1水平逐漸升高,且在25 dph達到最高,之后逐漸降低;TH組中的NR4A1基因水平在變態(tài)早期和高峰期顯著低于正常組,TU組的水平在變態(tài)中后期和結(jié)束期顯著高于正常組;TU組中變態(tài)被抑制的仔魚在正常海水和0.1 mg·L-1TH海水中飼養(yǎng)6 d后,能夠順利變態(tài),且NR4A1基因在拯救組(TU抑制變態(tài)仔魚在正常海水和0.1 mg·L-1TH海水中飼養(yǎng))中的表達水平與TU對照組相比顯著降低,與正常組中同時期的水平一致。結(jié)果表明,牙鲆NR4A1基因可能在仔魚變態(tài)調(diào)控中扮演著非常重要的角色。

    牙鲆;變態(tài)發(fā)育;NR4A1;基因表達

    NR4A家族屬于及早反應(yīng)基因家族,一些化學(xué)刺激(如生長因子、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等)和物理刺激(膜去極化、機械攪拌和磁場等)能夠在短時間內(nèi)誘導(dǎo)該家族基因快速表達[1]。NR4A1是NR4A家族中的一員,也是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子和一種響應(yīng)蛋白,通過對靶基因的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控,在信號傳導(dǎo)的早期發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[1]。NR4A1作為一種核受體,在接受刺激信號后,其分子構(gòu)象迅速發(fā)生改變,與靶基因的調(diào)控區(qū)發(fā)生特異性的識別和結(jié)合,發(fā)揮其對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,參與細胞周期、細胞凋亡、組織器官發(fā)育、腫瘤發(fā)生、機體免疫應(yīng)答以及內(nèi)分泌調(diào)控等各種生命活動[2]。NR4A1蛋白主要由6個保守的功能結(jié)構(gòu)域組成:AF-1結(jié)構(gòu)域(氨基端長度可改變的轉(zhuǎn)錄激活域,負責(zé)與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用)、DBD結(jié)構(gòu)域(包含兩個鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合域,與DNA識別元件結(jié)合,調(diào)控基因表達)、構(gòu)象可變的鉸鏈區(qū)、LBD結(jié)構(gòu)域(包含二聚化位點的配體結(jié)合域,是一分子開關(guān),與特異性配體結(jié)合改變核受體的分子構(gòu)象,激活轉(zhuǎn)錄)、AF-2結(jié)構(gòu)域(配體依賴的轉(zhuǎn)錄激活域)、未知功能的可變羧基端[2]。NR4A1廣泛存在于多種生物體中,如:人類(Homo sapiens)、家鼠(Musmusculus)、半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)、斑馬魚(Danio rerio)[3]、非洲爪蟾(Xenopus laevis)[4]等。目前為止,NR4A1基因在牙鲆(Paralichthys olivaceus)中未見報道。

    牙鲆屬鰈形目(Pleuronectiforms),牙鲆科(Paralichthyidae),牙鲆屬,是我國一種重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類。在牙鲆胚后從仔魚向稚魚的發(fā)育過程中有一劇烈的變態(tài)過程,稱為牙鲆的變態(tài)發(fā)育。在仔魚變態(tài)過程中,其右眼移向身體左側(cè),冠狀幼鰭消長,體位從側(cè)臥變?yōu)槠脚P,浮游生活變?yōu)榈讞?,同時這些過程也伴隨一系列生理學(xué)變化[5]。1985年日本學(xué)者INUI等[8]研究發(fā)現(xiàn)外源性甲狀腺激素(TH)能顯著加速牙鲆仔魚的變態(tài),而硫脲(TU)則造成牙鲆仔魚的變態(tài)抑制[6-9]。本研究采用同源克隆和RACE法得到牙鲆NR4A1基因cDNA全長,觀察了NR4A1在牙鲆變態(tài)發(fā)育各時期以及成魚的表達水平,檢測了外源TH和TU對NR4A1表達的影響及其在拯救實驗中的變化,初步闡釋了NR4A1基因在牙鲆變態(tài)發(fā)育過程中的表達調(diào)控以及可能扮演的重要角色,以期為進一步揭示牙鲆變態(tài)的分子機制提供重要的研究積累。

    1 材料與方法

    1.1 實驗魚和樣品采集

    牙鲆仔魚實驗主要在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站于2015年5月29日完成。將孵化后14 d(14 dph,days post hatching)的3 000 ind仔魚平均分為3個組:正常發(fā)育對照組(control),甲狀腺激素(TH,Sigma公司)處理組和硫脲(TU,Sigma公司)處理組,3組仔魚分別養(yǎng)在正常海水、TH處理的海水(0.1 mg·L-1)和TU處理的海水(30 mg·L-1)中,其它飼養(yǎng)條件相同,至正常仔魚變態(tài)結(jié)束。在變態(tài)抑制仔魚拯救實驗中,將35 dph TU組仔魚分成3組:TU組繼續(xù)用含30 mg·L-1TU的海水養(yǎng)殖;TU-NC組改用自然海水養(yǎng)殖;TU-TH組改用含0.1 mg· L-1的海水養(yǎng)殖,6 d后觀察各組仔魚變態(tài)情況。

    樣品采集根據(jù)MINAMI[10]的劃分方法結(jié)合實際養(yǎng)殖情況確定取樣時間點,即:16 dph(變態(tài)前,眼睛左右對稱)、21 dph(變態(tài)早期,右眼開始移位)、25 dph(變態(tài)中前期,右眼移至背側(cè)附近,從左眼側(cè)還無法看到右眼)、28 dph(變態(tài)高峰期,右眼到達背中線附近,可在左眼側(cè)看到右眼)、31 dph(變態(tài)后期,右眼到達背中線并開始向左側(cè)移動)、35 dph(變態(tài)結(jié)束期,右眼位于背中線左側(cè))和41 dph(變態(tài)完成,兩只眼睛均位于頭部左側(cè))。每個時間點均分別取正常對照組、TH組和TU組的3個生物學(xué)重復(fù)樣品,即n=3,DEPC水沖洗,放入RNAstore保存液(天根公司),置于-80℃保存?zhèn)溆茫?1]。

    牙鲆成魚購自上海市蘆潮港水產(chǎn)品市場,活體解剖后取其肌肉、腦、心臟、鰓、腎、胃、肝臟、腸、性腺組織等各3份(n=3),經(jīng)DEPC水清洗,置于液氮,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

    利用Trizol?Reaget(Invitrogen),根據(jù)該試劑的操作說明將上述采集樣品進行RNA提取。利用NANODROP 2000C測定總RNA OD260/OD280值及濃度(1.8~2.0范圍的RNA純度較好),再根據(jù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量(28SrRNA和18SrRNA條帶清晰可見,RNA質(zhì)量較好),所有RNA樣品均符合實驗要求后,置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    將上述RNA樣品用DNase I(Promega)處理后,在無RNase的離心管中加入2μg總RNA,1 μL Oligo dT Primer(50μmol·L-1),1μL dNTP Mixture(10 mmol·L-1each),補充RNase free ddH2O至10μL;然后65℃5min,冰上2min;再加入5×PrimeScript Buffer4μL,RNase Inhibitor(40 U·μL-1)0.5μL,PrimeScript RTase(200 U ·μL-1)1μL,補充RNase free ddH2O至20μL;然后進行反轉(zhuǎn)錄,25℃,10 min;37℃,60 min;95℃,5 min,最后冰上放置2 min,cDNA產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 牙鲆NR4A1基因的克隆

    根據(jù)NR4A1基因在物種中的序列比對結(jié)果,在保守區(qū)設(shè)計3對PCR引物(表1),用牙鲆的混合cDNA(不同時期和不同組織的cDNA)為模板,運用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸45 s,35個循環(huán);72℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分離純化后連接到pMDTM19-T Vector(Takara,日本),轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,37℃培養(yǎng)過夜,藍白斑篩選陽性克隆擴大培養(yǎng)后送上海生工生物工程有限公司測序。所得測序結(jié)果采用DNAman中的序列拼接程序進行拼接。

    在牙鲆NR4A1拼接序列的基礎(chǔ)上,設(shè)計RACE的特異性引物(表1),通過Full RACE Kit(Takara)試劑盒進行RACE PCR擴增,將產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,再回收目的片段進行連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序。

    表1 實驗中用到的引物序列Tab.1 Primers used in this study

    1.4 基因序列結(jié)構(gòu)和進化分析

    運用DNAMAN軟件將所得的牙鲆NR4A1片段序列進行重新拼接間,獲得基因全長。用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf)程序獲得NR4A1基因的開放閱讀框和氨基酸序列。運用BLAST program(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)對牙鲆和其它物種的NR4A1基因進行氨基酸序列比對分析,分析該基因的保守型。運用MEGA 5.0[12]軟件,采用NJ(Neighbor-Joining)法構(gòu)建進化樹。從GenBank數(shù)據(jù)庫提取的NR4A1氨基酸序列的代碼如下:[Homo sapiens](GI|48145525|);[Mus musculus](GI|71059903|);[Danio rerio](GI|182889142|);[Xenopus laevis](GI|33416666|);[Cynoglossus semilaevis](GI|657779658|);[Stegastes partitus](GI|657528683|);[Poecilia reticulata](GI|658859882|)。

    1.5 熒光定量PCR

    NR4A1基因的定量分析在CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System(Bio-Rad,美國)上進行。首先制備目的基因和內(nèi)參基因(β-actin)的標(biāo)準曲線。然后對不同組織、不同變態(tài)階段、TH和TU處理以及拯救實驗中的仔魚,按照以下條件進行相對定量分析。反應(yīng)體系(20 μL):1.0μL cDNA,0.5μL NR4A1 qPCR-F(10 μM)和0.5μL NR4A1 qPCR-R(10μM),10.0μL 2×iQTM SYBR Green Supermix(Bio-Rad,USA)和8.0μL ddH2O;反應(yīng)條件:95℃1 min;95℃10 s,60℃20 s,40個循環(huán)。該實驗中,生物學(xué)重復(fù)n=3,技術(shù)重復(fù)2次,β-actin為參考基因;NR4A1基因和內(nèi)參基因的擴增效率(E)均介于95%~100%之間,R值均大于0.98,并且二者之間的E值相差小于0.1。

    上述NR4A1 mRNA結(jié)果,運用2-ΔΔCT方法[13]進行數(shù)據(jù)處理。運用Sigmaplot 12.0軟件進行作圖分析,數(shù)值采用平均值±標(biāo)準誤差(mean± SE)表示,n=3。不同樣品間的相對表達差異分析利用該軟件中的One-Way和Two-Way方差分析法(ANOVA)進行統(tǒng)計分析,P<0.05代表差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 NR4A1的克隆及結(jié)構(gòu)分析

    利用分子克隆方法,獲得了牙鲆NR4A1基因全長3264 bp,包括43 bp的5′-UTR、1517 bp的3′-UTR和1704 bp的CDS,預(yù)測其編碼568個氨基酸(圖1)。在NCBI中,NR4A1基因的氨基酸序列結(jié)構(gòu)比對分析結(jié)果顯示,其有6個高度保守的結(jié)構(gòu)域,分別為NR_DBD_NGFI-B、NR_LBD_NGFI-B、zf-C4、ZnF_C4、HOLI和Hormone_recep,這與其它已知物種中的NR4A1結(jié)構(gòu)相似(圖2)。

    2.2 NR4A1序列比對及進化樹構(gòu)建

    NR4A1基因系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示(圖3),牙鲆與其它魚類聚在一支,與深裂眶鋸雀鯛(Stegastes partitus)和半滑舌鰨的系統(tǒng)進化距離相對較近。多物種間NR4A1基因氨基酸序列同源性比對結(jié)果顯示,牙鲆與半滑舌鰨為78.13%,與斑馬魚為68.34%,與網(wǎng)紋鳉(Poecilia reticulate)為68.19%,與深裂眶鋸雀鯛為84.59%(圖4)。

    圖1 牙鲆NR4A1基因的cDNA和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 cDNA and deduced am ino acid sequences of Paralichthys olivaceus NR4A1 gene

    圖2 牙鲆NR4A1基因的6個保守性結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析Fig.2 Six conservative domains proghosis of Paralichthys olivaceus NR4A1 gene

    圖3 NR4A1基因在脊椎動物中的系統(tǒng)進化樹分析(Neighbor-joining,1 000 bootstrap)Fig.3 Phylogenetic tree analysis of NR4A1 in the vertebrate by the neighbor-joining method(1 000 bootstrap)

    2.3 牙鲆NR4A1基因在變態(tài)發(fā)育階段和成魚各組織中的表達

    定量PCR結(jié)果顯示(圖5):牙鲆NR4A1基因在成魚各組織中均有表達到,但肌肉、心臟和鰓中表達量較高,在心臟中最高;牙鲆NR4A1基因在仔魚變態(tài)發(fā)育的各個階段均有表達,并且表達變化趨勢與變態(tài)發(fā)育進展相符,即出膜后第16天(16 dph)時,牙鲆NR4A1基因的表達較低,到21 dph時有增長,但與16 dph無顯著差異,在25 dph時其表達水平達到頂峰(約為16 dph的8倍,差異顯著),之后逐漸降低,到35 dph和41 dph時降至最低。

    2.4 甲狀腺激素(TH)及硫脲(TU)處理后NR4A1的表達

    通過定量PCR方法分析NR4A1基因在TH和TU處理仔魚中的表達變化,結(jié)果顯示:在變態(tài)早期和變態(tài)高峰期的TH組仔魚中,其NR4A1水平顯著低于正常發(fā)育組(control),而在變態(tài)中后期至變態(tài)結(jié)束的TU組仔魚中,NR4A1水平顯著高于正常發(fā)育組,這些結(jié)果表明NR4A1基因的表達直接或間接的受到TH的調(diào)控(圖6)。外源甲狀腺激素(TH)加速牙鲆仔魚變態(tài),而硫脲(TU)則抑制其變態(tài)。

    2.5 硫脲處理組牙鲆的變態(tài)拯救實驗

    為了探討硫脲(TU)抑制變態(tài)的仔魚能否被拯救(TU抑制變態(tài)的仔魚完成變態(tài)過程),我們將35 dph TU組仔魚分別放入自然海水中(TUNC組)和含0.1 mg·L-1TH的海水中(TU-TH組)飼養(yǎng)。經(jīng)過6 d的拯救實驗后,從外型判斷TU-TH組和TU-NC組仔魚均完成變態(tài)(圖7),而TU對照組仔魚變態(tài)依然被抑制。同時分析了NR4A1基因在仔魚變態(tài)拯救前后的表達變化,結(jié)果顯示:NR4A1在TU-NC組和TU-TH組中的表達水平相對TU對照組顯著降低,與正常發(fā)育組以及TH處理組41 dph時的表達水平相近(圖9),這些結(jié)果表明NR4A1基因可能在牙鲆仔魚變態(tài)中發(fā)揮重要的作用。

    圖4 NR4A1基因在牙鲆和其它物種間的氨基酸序列對比Fig.4 Am ino acid sequences for NAR4AI alignment of Paralichthys olivaceus and other species

    圖5 牙鲆NR4A1在成魚組織和變態(tài)階段的表達模式(A:成魚組織;B:變態(tài)發(fā)育)Fig.5 Relative expression of NR4A1 m RNA in adult fish tissues and metamorphic stages of Paralichthys olivaceus(A:adult tissues,B:metamorphosis)

    圖6 NR4A1 m RNA在正常、TH和TU組仔魚變態(tài)過程中的相對表達Fig.6 Relative expression of NR4A1 mRNA in the control,TH-treated and TU-treated larvae duringmetamorphosis

    3 討論

    已有研究表明,NR4A1基因在細胞信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用,參與了一系列發(fā)育和代謝相關(guān)的生命活動[1,14]。本研究中,我們克隆了牙鲆NR4A1基因序列,并分析了該基因在物種間的系統(tǒng)進化、同源性以及保守性,NR4A1基因在牙鲆與其它物種間具有很高的同源性和保守性,這為進一步分析其在牙鲆發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。同時,NR4A1基因在牙鲆變態(tài)過程中的表達分析表明,它的表達水平隨著變態(tài)發(fā)育逐漸增長,在變態(tài)高峰期達到峰值,隨后逐漸降低至變態(tài)結(jié)束。這些結(jié)果顯示,NR4A1的表達變化與牙鲆的變態(tài)發(fā)育進程是呈正相關(guān)的,可能在牙鲆變態(tài)過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在成魚中的組織分布表明,NR4A1基因可能在肌肉、心臟和鰓的發(fā)育以及生理代謝中發(fā)揮著重要作用。

    牙鲆的變態(tài)發(fā)育受到許多激素的調(diào)控,而甲狀腺激素和其受體在其變態(tài)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)控作用,控制著仔魚變態(tài)的進程以及成?。?5-17],JANSEN等[18]以及BISBAL等[19]對牙鲆眼睛移位的研究結(jié)果揭示,牙鲆眼睛的移位是受TH控制的,且在此過程中,甲狀腺激素的水平有大幅度的增加,它的濃度分布有著組織性和時間上的特異性[20]。研究表明,外源性的TH能夠加速牙鲆仔魚的變態(tài)過程[8],而與之相反的是,用甲狀腺素抑制劑硫脲(TU)處理后會導(dǎo)致牙鲆仔魚的變態(tài)停滯[7-8,21-22]。本次實驗使用外源性的TH和TU處理牙鲆尚未開始變態(tài)的仔魚,以研究TH和TU對NR4A1基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在牙鲆變態(tài)過程中,NR4A1基因的mRNA水平明顯受TH和TU的影響,并且二者對NR4A1的表達幾乎具有相反的調(diào)節(jié)作用。在變態(tài)前期和高峰期,外源性TH顯著抑制了NR4A1基因的表達水平;在變態(tài)高峰期和后期,TU組仔魚體內(nèi)的TH水平被抑制,導(dǎo)致NR4A1基因一直處于高水平,這些結(jié)果顯示NR4A1基因表達受到TH直接或間接的調(diào)控,并且在仔魚變態(tài)調(diào)控中可能起著負調(diào)控的作用。因此我們推測TH通過抑制NR4A1基因的表達水平,從而間接地減少仔魚變態(tài)負調(diào)控基因的表達,控制仔魚正常變態(tài)的進程;外源TH的加入,提升了體內(nèi)TH的水平,更快更早的抑制了NR4A1基因的表達,造成變態(tài)抑制基因更早的被抑制,促使仔魚變態(tài)的加速。

    圖7 NR4A1基因在TU抑制變態(tài)仔魚拯救中的表達變化(A:變態(tài)抑制拯救前后的形態(tài)變化;B:NR4A1在變態(tài)抑制仔魚拯救前后的表達變化)Fig.7 Relative expression levels of NR4A1 mRNA in the rescued larvae inhibited by TU(A:morphologic changes before and after rescue;B:relative levels of NR4A1 m RNA before and after rescue)

    為了進一步探究NR4A1基因在牙鲆變態(tài)中的作用,筆者設(shè)計了TU抑制組仔魚的拯救實驗。實驗結(jié)果證明,TU組變態(tài)抑制的仔魚在去除TU抑制即放入正常海水和TH處理的海水,仍能快速地完成仔魚的變態(tài);同時我們檢測了NR4A1基因的表達變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與TU對照組相比,拯救組中的NR4A1基因水平顯著降低,這可能是因為被TU抑制變態(tài)仔魚體內(nèi)TH去抑制的結(jié)果,這進一步表明NR4A1基因的表達直接或間接地受TH調(diào)節(jié),并可能在仔魚的變態(tài)中通過負調(diào)控的方式發(fā)揮著重要的作用。

    [1] MARUYAMA K,TSUKADA T,OHKURA N,etal.The NGFI-B subfamily of the nuclear receptor superfamily[J].International Journal of Oncology,1998,12(6):1237-1280.

    [2] 谷亞龍,張新東,金保方.核受體NR4A1功能及調(diào)控的研究進展[J].中華臨床醫(yī)師雜志,2014,8(8):1507-1511.

    [3] CHENG Y Y,TAOW J,CHEN JL,etal.Genomewide identification,evolution and expression analysis of nuclear receptor superfamily in Nile tilapia,Oreochromis niloticus[J].Gene,2015,569(1):141-152.

    [4] KLEIN S L,STRAUSBERG R L,WAGNER L,et al.Genetic and genomic tools for Xenopus research:The NIH Xenopus initiative[J].Developmental Dynamics,2002,225(4):384-391.

    [5] FUKUHARA O.Morphological and functional development of Japanese flounder in early life stage[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1986,52(1):81-91.

    [6] TANANGONAN JB,TAGAWA M,TANAKA M,et al.Changes in tissue thyroxine level of metamorphosing Japanese flounder Paralichthys olivaceus reared at different temperatures[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1989,55(3):485-490.

    [7] MIWA S,TAGAWA M,INUIY,et al.Thyroxine surge in metamorphosing flounder larvae[J].General and Comparative Endocrinology,1988,70(1):158-163.

    [8] INUI Y,MIWA S.Thyroid hormone induces metamorphosis of flounder larvae[J].General and Comparative Endocrinology,1985,60(3):450-454.

    [9] DE JESUS EG,HIRANO T,INUIY.Changes in cortisol and thyroid hormone concentrations during early development and metamorphosis in theJapanese flounder,Paralichthys olivaceus[J].General and Comparative Endocrinology,1991,82(3):369-376.

    [10] MINAMI T.The early life history of a flounder Paralichthys olivaceus[J].Nippon Suisan Gakkaishi,1982(48):1581-1588.

    [11] ZHAIW,ZHANG J,SHI Z,et al.Identification and expression analysis of IGFBP-1 gene from Japanese flounder(Paralichthys olivaceus)[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2012,161(4):413-420.

    [12] TAMURA K,PETERSON D,PETERSON N,et al.MEGA5:Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods[J].Molecular Biology and Evolution,2011,28(10):2731-2739.

    [13] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod[J].Methods,2001,25(4):402-408.

    [14] KIM BY,KIM H,CHO E J,etal.Nur77 upregulates HIF-αby inhibiting pVHL-mediated degradation[J].Experimental and Molecular Medicine,2008,40(1):71-83.

    [15] Schreiber A M,Specker J L.Metamorphosis in the summer flounder(Paralichthys dentatus):stagespecific developmental response to altered thyroid status[J].General and Comparative Endocrinology,1998,111(2):156-166.

    [16] GALAY BURGOSM,POWER D M,LLEWELLYN L,et al.Thyroid hormone receptor expression during metamorphosis of Atlantic halibut(Hippoglossus hippoglossus)[J].Molecular and Cellular Endocrinology,2008,281(1):56-63.

    [17] LAUDET V.The origins and evolution of vertebrate metamorphosis[J].Current Biology,2011,21(18):R726-R737.

    [18] JANSEN J,ENGER P.NADPH diaphorase activity is asymmetrically distributed in the optic tectum during the period of eye migration in turbots[J].Acta physiologica scandinavica,1996,157(4):515-517.

    [19] BISBALG A,BENGTSON D A.Reversed asymmetry in laboratory-reared summer flounder[J].The Progressive Fish-culturist,1993,55(2):106-108.

    [20] TAGAWA M,MIWA S,INUIY,et al.Changes in thyroid hormone concentrations during early development and metamorphosis of the flounder,Paralichthys olivaceus[J].Zoological Science,1990,7(1):93-96.

    [21] INUIY,YAMANO K,MIWA S.The role of thyroid hormone in tissue development in metamorphosing flounder[J].Aquaculture,1995,135(1):87-98.

    [22] 蘇艷芳,付元帥,施志儀,等.牙鲆SRF基因的克隆及真核表達載體的構(gòu)建[J].海洋漁業(yè),2015,37(4):331-340.

    SU Y F,F(xiàn)U Y S,SHI Z Y,et al.Cloning of SRF from Paralichthys olivaceus and eukargotic expression veetor construction[J].Marine Fisheries,2015,37(4):331-340.

    Expression regulation of Paralichthys olivaceus NR4A1 gene in themetamorphic larvae induced by thyroid hormone

    SHIYang1,JU Hui2,YU Jie2,F(xiàn)U Yuan-shuai2
    (1.Shanghai Food Research Institute,Shanghai 200235,China;2.ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

    NR4A1 gene,an important transcription factor,regulates the specific expression of targetgenes and plays a key role in the early signal transduction.In this study,the full-length cDNA of Paralichthys olivaceus NR4A1 gene was cloned,and its structure was analyzed by the bioinformaticsmethod,while its expression patterns during the metamorphosis and in different tissues of adult fish were detected using the real-time quantitative PCR technology.The expression responses of NR4A1 to exogenous thyroid hormone(TH)and thiourea(TU)during themetamorphosiswere also detected.Finally,a rescue assay was performed and the changes of NR4A1 during the rescuewere detected.The results showed that NR4A1 contained 3 264 bp cDNA sequence and encoded 568 amino acids.NR4A1 of Japanese flounder showed high homology compared to the other reported species.NR4A1 of Japanese flounder wasmainly expressed in heart,muscle and gill.During themetamorphosis,the expression level of NR4A1 increased gradually,and reached the peak at 25 dph,subsequently declined gradually.In the TH group,the expression levels were significantly lower than the control at the pre-metamorphosis and the climaxmetamorphosis period(P<0.05).While in the TU group the experssion levelswere higher than the control in the latemetamorphosis period.Themetamorphic inhibition of 35 dph TU larvae can be rescued in the normal seawater and the TH-treated seawater(P<0.05),and NR4A1 was significantly down-regulated in the rescued larvae compared with the TU-treated larvae(P<0.05).These results demonstrate that NR4A1 plays a key role in regulatingmetamorphosis in the Japanese flounder.

    Paralichthys olivaceus;metamorphosis;NR4A1;gene expression

    Q 959.468

    A

    1004-2490(2017)04-0433-10

    2016-06-15

    國家自然科學(xué)基金(41506159);上海市自然科學(xué)基金(15ZR1420600);中科院海洋所海洋生物學(xué)重點實驗室開放課題(KF2015No.01)

    施 楊(1988-),男,助理工程師,研究方向為食品分子檢測。E-mail:602483415@qq.com

    付元帥(1981-),講師。E-mail:ysfu@shou.edu.cn

    猜你喜歡
    牙鲆仔魚硫脲
    北戴河站在牙鲆幼魚培育光色選擇研究方面取得新進展
    饑餓對似魚句早期仔魚發(fā)育、攝食及生長的影響
    硫脲的危險性及安全管理措施研究
    化工管理(2021年7期)2021-05-13 00:45:38
    雌核發(fā)育、野生及養(yǎng)殖牙鲆形態(tài)差異分析
    1-[(2-甲氧基-4-乙氧基)-苯基]-3-(3-(4-氧香豆素基)苯基)硫脲的合成
    硫脲νN-C=S紅外光譜研究
    斑鱖仔魚饑餓試驗及不可逆點的確定
    饑餓對半刺厚唇魚(Acrossocheilius hemispinus)仔魚早期發(fā)育的主要影響
    不同生長環(huán)境褐牙鲆的外觀性狀與肌肉營養(yǎng)成分的比較分析
    Alice臺風(fēng)對東海鮐魚魚卵仔魚的輸運和存活率的影響
    亚洲最大成人中文| 丰满的人妻完整版| 这个男人来自地球电影免费观看| 成人国语在线视频| 黑人操中国人逼视频| 一边摸一边做爽爽视频免费| 99热只有精品国产| 午夜福利在线观看吧| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 全区人妻精品视频| 精品乱码久久久久久99久播| 在线观看免费日韩欧美大片| 怎么达到女性高潮| 午夜福利高清视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美久久黑人一区二区| 免费在线观看影片大全网站| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲五月婷婷丁香| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 全区人妻精品视频| 国产av不卡久久| 欧美黑人巨大hd| 精品日产1卡2卡| 午夜日韩欧美国产| 好男人电影高清在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 制服人妻中文乱码| 麻豆成人av在线观看| 日本 av在线| а√天堂www在线а√下载| 很黄的视频免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 他把我摸到了高潮在线观看| 国模一区二区三区四区视频 | 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲男人天堂网一区| 亚洲国产精品成人综合色| 又爽又黄无遮挡网站| 9191精品国产免费久久| 久久精品人妻少妇| 舔av片在线| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费高清视频大片| 热99re8久久精品国产| 欧美一级a爱片免费观看看 | 精品无人区乱码1区二区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品一及| 亚洲五月婷婷丁香| 脱女人内裤的视频| 国产精品久久久久久久电影 | 成人三级黄色视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 他把我摸到了高潮在线观看| 久9热在线精品视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久国产精品影院| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| a级毛片在线看网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 又黄又爽又免费观看的视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 制服丝袜大香蕉在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| www国产在线视频色| 日本在线视频免费播放| 欧美3d第一页| 级片在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 国产91精品成人一区二区三区| 国产成人影院久久av| 国产人伦9x9x在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 舔av片在线| 亚洲免费av在线视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 婷婷六月久久综合丁香| 久99久视频精品免费| 真人做人爱边吃奶动态| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲电影在线观看av| 天堂动漫精品| e午夜精品久久久久久久| 国产伦在线观看视频一区| 在线视频色国产色| 午夜免费激情av| 中文字幕久久专区| www.自偷自拍.com| 日韩欧美免费精品| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 狂野欧美激情性xxxx| 岛国在线观看网站| 男女床上黄色一级片免费看| netflix在线观看网站| 日韩免费av在线播放| 视频区欧美日本亚洲| 午夜老司机福利片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久天堂一区二区三区四区| 国产成人av教育| 亚洲专区字幕在线| 黄片小视频在线播放| 1024手机看黄色片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 日本一二三区视频观看| 国产av麻豆久久久久久久| 免费看a级黄色片| 香蕉丝袜av| 成人亚洲精品av一区二区| av福利片在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 可以在线观看的亚洲视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产激情久久老熟女| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久精品影院6| av片东京热男人的天堂| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 99久久精品热视频| 黄色片一级片一级黄色片| 一本大道久久a久久精品| 久久亚洲精品不卡| 午夜激情福利司机影院| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一区福利在线观看| 国产成人aa在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲,欧美精品.| 日韩有码中文字幕| 亚洲色图av天堂| 黄片小视频在线播放| 国产成人av教育| 757午夜福利合集在线观看| 99久久精品热视频| 国产视频内射| 妹子高潮喷水视频| 成在线人永久免费视频| www.熟女人妻精品国产| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲七黄色美女视频| 国产高清videossex| 亚洲成人久久性| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲av成人精品一区久久| 精品人妻1区二区| 日本a在线网址| 色尼玛亚洲综合影院| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 丁香欧美五月| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜激情av网站| 国产黄a三级三级三级人| 首页视频小说图片口味搜索| 日本黄大片高清| 久久精品影院6| 国产成人欧美在线观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 母亲3免费完整高清在线观看| 脱女人内裤的视频| 在线视频色国产色| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 18禁国产床啪视频网站| 老司机午夜十八禁免费视频| 全区人妻精品视频| 中文字幕熟女人妻在线| 91老司机精品| 亚洲美女视频黄频| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产精品电影一区二区三区| 欧美午夜高清在线| 黄色片一级片一级黄色片| 成年版毛片免费区| 叶爱在线成人免费视频播放| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 麻豆成人午夜福利视频| av免费在线观看网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 特大巨黑吊av在线直播| 国产精品综合久久久久久久免费| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久精品国产清高在天天线| 色av中文字幕| 亚洲精品在线观看二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲中文av在线| √禁漫天堂资源中文www| 午夜福利高清视频| 青草久久国产| 欧美不卡视频在线免费观看 | 成人国产综合亚洲| 精品久久久久久久毛片微露脸| 伦理电影免费视频| 此物有八面人人有两片| 香蕉国产在线看| 又黄又粗又硬又大视频| 国产三级黄色录像| xxx96com| 精品久久久久久,| 一本久久中文字幕| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲欧美日韩东京热| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久99久视频精品免费| 欧美大码av| 欧美日韩精品网址| 亚洲美女视频黄频| 日日干狠狠操夜夜爽| 狂野欧美激情性xxxx| 波多野结衣巨乳人妻| 97碰自拍视频| 波多野结衣高清作品| 制服诱惑二区| 一本精品99久久精品77| 日本成人三级电影网站| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 岛国在线免费视频观看| 精品久久蜜臀av无| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久九九热精品免费| 国产亚洲精品av在线| 欧美在线黄色| 午夜福利在线观看吧| 可以在线观看毛片的网站| 日韩精品青青久久久久久| 欧美在线一区亚洲| 99热这里只有是精品50| 波多野结衣高清无吗| 久久中文字幕一级| 国产久久久一区二区三区| 少妇粗大呻吟视频| 搡老岳熟女国产| av在线天堂中文字幕| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲欧美日韩东京热| АⅤ资源中文在线天堂| tocl精华| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲全国av大片| 一夜夜www| 99热这里只有是精品50| 午夜影院日韩av| 久久精品国产亚洲av高清一级| www.熟女人妻精品国产| 大型黄色视频在线免费观看| 淫秽高清视频在线观看| 国产区一区二久久| 日本熟妇午夜| 90打野战视频偷拍视频| 99精品在免费线老司机午夜| 免费av毛片视频| 最新在线观看一区二区三区| 日本五十路高清| 香蕉国产在线看| 曰老女人黄片| 久久久久久久精品吃奶| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av有码第一页| 脱女人内裤的视频| 长腿黑丝高跟| 国产av一区在线观看免费| 精品久久久久久,| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲中文字幕日韩| 色精品久久人妻99蜜桃| 激情在线观看视频在线高清| 美女黄网站色视频| 在线观看日韩欧美| 成人永久免费在线观看视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲电影在线观看av| 一二三四社区在线视频社区8| 国产成人欧美在线观看| 免费看a级黄色片| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 超碰成人久久| 久久久久久久午夜电影| 亚洲精品av麻豆狂野| 99热只有精品国产| 黄色丝袜av网址大全| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一进一出抽搐gif免费好疼| 中亚洲国语对白在线视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 听说在线观看完整版免费高清| 免费一级毛片在线播放高清视频| 床上黄色一级片| 欧美久久黑人一区二区| 国产精品,欧美在线| 欧美中文综合在线视频| 在线观看一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| av中文乱码字幕在线| bbb黄色大片| 999久久久精品免费观看国产| a级毛片在线看网站| 日本熟妇午夜| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲欧美日韩东京热| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲精品粉嫩美女一区| 脱女人内裤的视频| 麻豆国产97在线/欧美 | 香蕉av资源在线| 中出人妻视频一区二区| 一a级毛片在线观看| 国产日本99.免费观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美日韩国产亚洲二区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 看片在线看免费视频| 无遮挡黄片免费观看| 色在线成人网| 国产精品一及| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲国产欧美网| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一本一本综合久久| 色av中文字幕| 久久国产精品影院| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 在线观看免费日韩欧美大片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美在线一区亚洲| www国产在线视频色| 老司机靠b影院| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美3d第一页| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩精品青青久久久久久| 一级作爱视频免费观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 女警被强在线播放| 嫩草影视91久久| 99热6这里只有精品| 欧美一区二区精品小视频在线| 在线观看日韩欧美| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 少妇粗大呻吟视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲 国产 在线| 午夜激情福利司机影院| 欧美+亚洲+日韩+国产| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品综合久久久久久久免费| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产一区二区三区视频了| 后天国语完整版免费观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 一本一本综合久久| 不卡一级毛片| 国产成人av教育| 久久久久久人人人人人| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品影院久久| 成人国语在线视频| 在线观看一区二区三区| www.熟女人妻精品国产| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产99久久九九免费精品| 变态另类丝袜制服| 欧美日本视频| 18禁美女被吸乳视频| 激情在线观看视频在线高清| 国产精品久久视频播放| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 嫩草影院精品99| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 免费观看精品视频网站| 黄色视频不卡| 免费一级毛片在线播放高清视频| 免费看美女性在线毛片视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩大码丰满熟妇| 我的老师免费观看完整版| 一进一出抽搐动态| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久草成人影院| 午夜a级毛片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲中文av在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 制服丝袜大香蕉在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品电影一区二区三区| 淫秽高清视频在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 久久国产精品影院| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 黄色毛片三级朝国网站| 舔av片在线| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 午夜福利免费观看在线| 搞女人的毛片| 中国美女看黄片| 999精品在线视频| 女警被强在线播放| 美女免费视频网站| www.熟女人妻精品国产| 欧美黑人欧美精品刺激| 中文字幕av在线有码专区| 精品国产乱码久久久久久男人| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 色精品久久人妻99蜜桃| 少妇粗大呻吟视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 午夜福利在线在线| 很黄的视频免费| 国产一区二区在线观看日韩 | 亚洲五月婷婷丁香| 18禁观看日本| 免费看日本二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产99久久九九免费精品| 视频区欧美日本亚洲| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲色图av天堂| 十八禁人妻一区二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 欧美色欧美亚洲另类二区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 午夜视频精品福利| 狂野欧美激情性xxxx| 两个人免费观看高清视频| 怎么达到女性高潮| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲一区中文字幕在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一区二区三区高清视频在线| 久久久久性生活片| av在线播放免费不卡| 久久热在线av| 国产午夜精品久久久久久| 一本综合久久免费| 麻豆av在线久日| 久久久久久九九精品二区国产 | 国产精品久久久久久精品电影| 黄色a级毛片大全视频| 午夜福利免费观看在线| 欧美日韩精品网址| av福利片在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产片内射在线| 哪里可以看免费的av片| 超碰成人久久| 两性夫妻黄色片| 91字幕亚洲| 国产单亲对白刺激| 丰满的人妻完整版| 看黄色毛片网站| av视频在线观看入口| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美色视频一区免费| 国产三级在线视频| 正在播放国产对白刺激| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 又黄又粗又硬又大视频| 99riav亚洲国产免费| 男人舔奶头视频| 午夜成年电影在线免费观看| 88av欧美| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 在线观看午夜福利视频| av天堂在线播放| 亚洲第一电影网av| 九色成人免费人妻av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日韩高清综合在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 成人18禁在线播放| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美色视频一区免费| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品久久久久久久久久免费视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲精品在线美女| aaaaa片日本免费| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产精品电影一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 一区二区三区高清视频在线| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩三级视频一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 青草久久国产| 美女免费视频网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线a可以看的网站| 亚洲人与动物交配视频| 黄色女人牲交| 欧美最黄视频在线播放免费| а√天堂www在线а√下载| 国产午夜福利久久久久久| 欧美中文日本在线观看视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲国产精品sss在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美日韩乱码在线| 国产一级毛片七仙女欲春2| 免费看日本二区| 长腿黑丝高跟| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产av又大| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本a在线网址| 色哟哟哟哟哟哟| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日韩国内少妇激情av| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜福利欧美成人| 日日摸夜夜添夜夜添小说| a级毛片在线看网站| www.自偷自拍.com| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 黄色视频,在线免费观看| 熟女电影av网| 狂野欧美激情性xxxx| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品国产高清国产av| 精品熟女少妇八av免费久了| 日本 av在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产99久久九九免费精品| 老鸭窝网址在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜久久久久精精品| 露出奶头的视频| 亚洲电影在线观看av| 午夜福利成人在线免费观看| av有码第一页| 熟女电影av网| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产黄a三级三级三级人| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 美女 人体艺术 gogo| 日韩欧美三级三区| 日本熟妇午夜| 欧美日韩福利视频一区二区| 一进一出好大好爽视频| 日韩国内少妇激情av| 国产真实乱freesex| 国产精品久久久久久精品电影| 国产成+人综合+亚洲专区| 真人一进一出gif抽搐免费| 日本 av在线| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久九九热精品免费| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 91九色精品人成在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 韩国av一区二区三区四区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 人人妻人人看人人澡| 香蕉国产在线看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产亚洲精品av在线| 久久香蕉激情| 欧美午夜高清在线|