高濃度CO2對(duì)熱脅迫條件下高羊茅生長(zhǎng)和抗氧化系統(tǒng)的影響

于景金，范寧麗，李冉，楊志民

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京210095)

高濃度CO2對(duì)熱脅迫條件下高羊茅生長(zhǎng)和抗氧化系統(tǒng)的影響

于景金，范寧麗，李冉，楊志民*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京210095)

大氣CO2濃度及溫度逐年上升是當(dāng)前全球范圍內(nèi)主要的兩大氣候特征，但不斷升高的大氣CO2濃度可以緩解高溫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育帶來(lái)的負(fù)面影響。為了探究高濃度CO2在多年生禾草生長(zhǎng)和抗氧化系統(tǒng)方面對(duì)熱脅迫的響應(yīng)，本試驗(yàn)以高羊茅(Festucaarundinaceacv. ‘Barlexas’)為材料，進(jìn)行CO2[當(dāng)前濃度(400 μmol/mol)和高濃度(800 μmol/mol)]和溫度[(最適生長(zhǎng)溫度(25/20 ℃)和熱脅迫溫度(35/30 ℃)]處理。結(jié)果表明，高溫導(dǎo)致高羊茅的生長(zhǎng)速率(Gr)、凈光合速率(Pn)、光化學(xué)效率(Fv/Fm)、綠葉數(shù)、活性氧清除物質(zhì)[超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)]活性等顯著下降，葉片黃綠比、電解質(zhì)滲漏率(EL)、丙二醛(MDA)、活性氧[過(guò)氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-·)]顯著上升；熱脅迫處理28 d時(shí)，高濃度CO2較正常CO2濃度使細(xì)胞膜穩(wěn)定性增強(qiáng)(EL、MDA分別降低72%和39%)，光合能力提高(Pn、Fv/Fm、綠葉數(shù)分別升高174%、17%和165%)，活性氧積累減少(H2O2、O2-·含量分別下降46%和31%)。以上結(jié)果說(shuō)明：高濃度CO2通過(guò)提高高羊茅在熱脅迫下的光合能力，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定以及減少體內(nèi)活性氧的積累減弱了熱脅迫對(duì)植株的傷害，從而提高了高羊茅的抗熱性。

高羊茅；高溫脅迫；高濃度CO2；抗氧化系統(tǒng)

工業(yè)革命以來(lái)，大氣CO2濃度逐年上升已經(jīng)成為當(dāng)前全球氣候變化的重要特征，大氣CO2濃度上升帶來(lái)的全球生態(tài)環(huán)境的改變成為科學(xué)家們最為關(guān)注的問(wèn)題。有報(bào)道稱[1]，大氣CO2濃度已經(jīng)由工業(yè)革命之前的280 μmol/mol增長(zhǎng)到目前的接近400 μmol/mol，增幅達(dá)到41%。據(jù)預(yù)測(cè)，到21世紀(jì)末大氣中CO2濃度可能上升到700 μmol/mol左右。CO2是植物光合作用的碳源，陸生植物光合所需CO2絕大部分來(lái)自大氣，CO2主要通過(guò)擴(kuò)散的方式從大氣到達(dá)葉綠體內(nèi)的羧化部位，擴(kuò)散動(dòng)力即為CO2濃度差，所以大氣CO2供應(yīng)在一定程度上成為植物光合作用的重要限制因素之一。大氣CO2濃度的升高，從理論上講，可以提高植物的光合能力，促進(jìn)生物量的積累及品質(zhì)的改善[2]。目前，關(guān)于高濃度CO2對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究較多，但是由于物種間的差異，不同物種對(duì)CO2濃度的升高表現(xiàn)出差異應(yīng)答響應(yīng)。在CO2濃度對(duì)大豆(Glycinemax)光合作用影響的研究中發(fā)現(xiàn)，倍增CO2濃度可以提高大豆的凈光合速率及水分利用效率[3]；還有研究[4]表明，短期高濃度CO2對(duì)植物的光合作用有積極作用，但是長(zhǎng)期高濃度CO2會(huì)使這種積極效應(yīng)逐漸喪失。

高羊茅(Festucaarundinacea)具有較強(qiáng)的抗干旱、耐貧瘠、適應(yīng)性廣等特性，是一種重要的禾本科草坪草及牧草。當(dāng)前，在全球氣候變化大背景下，各地極端高溫天氣頻繁出現(xiàn)；加之愈發(fā)加劇的溫室效應(yīng)，全球范圍內(nèi)溫度逐年上升[5]，因此，高溫成為嚴(yán)重影響高羊茅生長(zhǎng)的因素之一。高溫通過(guò)破壞植物的生物膜、光合器官、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化系統(tǒng)和激素調(diào)節(jié)物質(zhì)等途徑，影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。熱脅迫直接導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大甚至喪失，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲。另外，丙二醛(MDA)是植物生物膜過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，也是植物細(xì)胞膜破壞程度的參考指標(biāo)之一，高溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)MDA的含量顯著升高[6]。光合作用是植物最重要的生命活動(dòng)，對(duì)溫度的變化非常敏感，其最敏感的部位為光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)，高溫下植物的凈光合速率(Pn)和光化學(xué)效率(Fv/Fm)都有所下降，這在水稻(Oryzasativa)等多種植物中都有報(bào)道[7-8]。在熱脅迫條件下，植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，暖季型草坪草狗牙根(Cynodondactylon)葉片中可溶性糖及脯氨酸含量顯著升高[9]。正常情況下，植物體內(nèi)不斷產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS氧化能力極強(qiáng)，對(duì)植物體內(nèi)許多生物大分子都具有破壞作用，但由于植物體內(nèi)同時(shí)具有相應(yīng)的ROS清除系統(tǒng)，使得ROS的產(chǎn)生和消除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[10]。然而，植物的抗氧化系統(tǒng)在熱脅迫下受到破壞，ROS出現(xiàn)過(guò)剩，導(dǎo)致植物代謝失活、光合降低，進(jìn)而產(chǎn)量下降等。植物的ROS清除系統(tǒng)由酶促抗氧化和非酶促抗氧化反應(yīng)組成，酶促抗氧化劑為植物提供了一個(gè)高效而又專(zhuān)一的ROS清除體系，主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)及過(guò)氧化物酶(POD)等，每種酶發(fā)揮的作用各不相同，卻又相互保護(hù)，協(xié)同作用[10]。

關(guān)于CO2濃度和溫度交互作用對(duì)植物影響的研究很多，但大多集中在農(nóng)作物及木本植物上，而對(duì)于多年生草類(lèi)植物的研究較少。蘇營(yíng)等[2]在大豆對(duì)CO2濃度及高溫響應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下CO2濃度升高有利于維持其生長(zhǎng)勢(shì)；徐輝等[11]在關(guān)于大氣CO2濃度升高及高溫對(duì)茶樹(shù)(Camelliasinensis)光合機(jī)制及茶葉品質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度CO2能夠通過(guò)改善葉片的光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)光合作用，進(jìn)而提高茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。梁建平等[12]的研究表明，CO2濃度倍增可以通過(guò)提高體內(nèi)的抗氧化酶活性，有效提高落葉松(Larixgmelinii)幼苗對(duì)高溫脅迫的抵御性。前期研究發(fā)現(xiàn)，在熱脅迫條件下，高濃度CO2使高羊茅葉片中大量有機(jī)酸(莽草酸、丙二酸、甘油酸、檸檬酸)、氨基酸(絲氨酸、纈氨酸)和碳水化合物(蔗糖、麥芽糖)增加[13]；同時(shí)，參與光合作用光反應(yīng)的葉綠素a-b結(jié)合蛋白、電子傳遞載體分子鐵氧化還原蛋白等發(fā)生了上調(diào)表達(dá)[14]。但是，從生長(zhǎng)及抗氧化系統(tǒng)探討高濃度CO2對(duì)多年生草類(lèi)植物熱脅迫的緩解作用，目前還沒(méi)有報(bào)道。因此，本研究不僅可以完善高濃度CO2提高多年生禾草耐熱性的理論基礎(chǔ)，還可以為氣候變化大背景下草類(lèi)植物的抗性育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及生長(zhǎng)環(huán)境

本試驗(yàn)選用2年齡長(zhǎng)勢(shì)良好的高羊茅(F.arundinaceacv. ‘Barlexas’)草皮塊作為試驗(yàn)材料，草皮塊利用高爾夫果嶺打洞器獲取，地上部約8 cm，地下部帶有約8 cm原土，全部取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草坪實(shí)驗(yàn)基地。于2016年2月選取長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的草皮塊，移植到PVC管(直徑11 cm，高50 cm)，管中基質(zhì)為河沙與營(yíng)養(yǎng)土的混合物(1∶1，v/v)。在材料培養(yǎng)階段，每3 d澆透水1次，每周澆1次霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液并修剪1次，使高度保持在大約10 cm，培養(yǎng)2個(gè)月。培養(yǎng)期結(jié)束后，將材料轉(zhuǎn)入人工氣候室中預(yù)培養(yǎng)1周，光周期設(shè)置為14 h，相對(duì)濕度為60%，光照強(qiáng)度大約600 μmol/(m2·s)，處理28 d。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采取雙因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主因子為CO2濃度，即當(dāng)前平均大氣CO2濃度(400 μmol/mol)和倍增大氣CO2濃度(800 μmol/mol)，副因子為溫度，即適宜溫度25/20 ℃(日/夜)和高溫脅迫35/30 ℃(日/夜)，共計(jì)4個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。

本試驗(yàn)在能夠控制環(huán)境因素的人工氣候室進(jìn)行，共計(jì)4間人工氣候室，其中2間設(shè)置為400 μmol/mol的當(dāng)前CO2濃度，分別將溫度控制為25/20 ℃(日/夜)和35/30 ℃(日/夜)；另外2間設(shè)置為800 μmol/mol的倍增CO2濃度，溫度控制同上。每間氣候室材料隨機(jī)擺放，每隔一天重新調(diào)整位置，防止因環(huán)境差異造成結(jié)果誤差。保證水分充足，每周澆1次營(yíng)養(yǎng)液，利用土壤含水量測(cè)定儀(Mini Trase Kit 6050X3，美國(guó))測(cè)定相對(duì)水分含量，以保證不同處理下的高羊茅具有相同的土壤水分條件。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

分別在處理的7、14、21、28 d時(shí)，采用混合取樣方法采樣，分別測(cè)定高羊茅葉片各項(xiàng)生理指標(biāo)，包括生長(zhǎng)速率(growth rate,Gr)和電解質(zhì)滲漏率(electrolyte leakage, EL)、光化學(xué)效率(photochemical efficiency,Fv/Fm)、凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn),分別采用Yu等[13,15]的方法進(jìn)行測(cè)定。

相對(duì)生長(zhǎng)速率：以7 d為時(shí)間間隔所測(cè)定的每盆高羊茅平均冠層高度的差值與時(shí)間的比值。

電解質(zhì)滲漏率：剪取約0.2 g高羊茅葉片，去離子水潤(rùn)洗干凈，浸入裝有30 mL去離子水的50 mL離心管中。在室溫下?lián)u床上振蕩24 h測(cè)定初始電導(dǎo)率(C0)，然后140 ℃高壓滅菌20 min，重新放在搖床上24 h后測(cè)定最終電導(dǎo)率(C1)，EL(%)=(C0/C1)×100。

光化學(xué)效率：利用葉夾對(duì)所測(cè)葉片暗適應(yīng)30 min，用葉綠素?zé)晒庑芊治鰞x，將測(cè)量探頭置于葉夾上，打開(kāi)葉夾的遮光片，測(cè)量葉片光化學(xué)效率值。

葉片凈光合速率：采用Li-6400光合儀進(jìn)行測(cè)定。葉片被夾在內(nèi)置紅藍(lán)光源的6 cm2葉室中，光強(qiáng)設(shè)置為600 μmol/(m2·s)。

黃綠比：通過(guò)記錄每個(gè)重復(fù)標(biāo)記葉的綠葉、黃葉數(shù)，計(jì)算黃綠比。

在處理28 d時(shí)，測(cè)定高羊茅葉片的ROS指標(biāo)，包括超氧陰離子(O2-·)、過(guò)氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)含量以及抗氧化酶活性，參照Z(yǔ)hang等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。

超氧陰離子(O2-·)：稱取0.1 g葉片，在液氮中充分研磨，加入3 mL 65 mmol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 7.8)，混合均勻后于4 ℃下10000 r/min離心15 min，收集上清。將0.5 mL 65 mmol/L 磷酸鉀緩沖液和0.1 mL 10 mmol/L 鹽酸羥胺在離心管中混合均勻，25 ℃水浴10 min，然后加入0.5 mL收集的上清液搖勻，25 ℃水浴20 min；依次加入1 mL 58 mmol/L磺胺和1 mL 7 mmol/L的萘胺混合均勻，25 ℃水浴20 min；加入3 mL 氯仿充分渦旋，并于10000 r/min離心3 min。測(cè)定上層水相在530 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

過(guò)氧化氫(H2O2)：采用KI法測(cè)定，稱取樣品約0.3 g，在5 mL 0.1%(w/v)三氯乙酸中冰浴研磨，勻漿在4 ℃下12000 r/min離心15 min。取上清液0.5 mL，與0.5 mL 0.1 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液和1 mL 1 mol/L KI溶液混合，于室溫黑暗下靜置1 h后，測(cè)定390 nm處吸光度。H2O2含量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

MDA、SOD、CAT、APX：取0.3 g葉片在液氮中充分研磨，加入3 mL 預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(1% PVP和2 mmol/L EDTA)混合均勻，4 ℃下15000 r/min離心20 min，收集上清用于酶活的測(cè)定。SOD：在波長(zhǎng)560 nm處測(cè)定上清液吸光度，以引起氮藍(lán)四唑(NBT)50%的光還原抑制所需酶量作為一個(gè)SOD酶活單位。CAT：通過(guò)測(cè)定240 nm處酶液的吸光度隨著H2O2濃度的降低而下降的速率表示。APX：通過(guò)測(cè)定在290 nm處1 min后酶液吸光度的降低速率確定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分別利用SPSS 18.0和Sigmaplot 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用Duncan進(jìn)行方差分析的顯著性檢驗(yàn)，采用最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行不同處理間的多重比較，置信度為P=0.05。

2 結(jié)果與分析

從表1的雙因素方差分析結(jié)果可以看出，單獨(dú)溫度對(duì)除APX外的所有指標(biāo)均具有極顯著影響；單獨(dú)CO2濃度對(duì)高羊茅葉片的EL、Pn、Fv/Fm、葉片黃綠比、H2O2、O2-·、Pn均具有極顯著影響，對(duì)MDA和SOD具有顯著影響，但對(duì)Gr、CAT、POD沒(méi)有影響；溫度與CO2濃度交互作用對(duì)MDA、Pn、O2-·、APX和POD沒(méi)有顯著影響，對(duì)其余生理生化指標(biāo)具有顯著或極顯著影響。

表1 雙因素方差分析

注：值代表均方和；*、**分別代表顯著相關(guān)(P<0.05)和極顯著相關(guān)(P<0.01)；ns代表不相關(guān)。EL：電解質(zhì)滲漏率；MDA：丙二醛；Gr：相對(duì)生長(zhǎng)速率；Pn：凈光合速率；Fv/Fm：光化學(xué)效率；H2O2：過(guò)氧化氫；O2-·：超氧陰離子；SOD：超氧化物歧化酶；APX：抗壞血酸過(guò)氧化物酶：CAT：過(guò)氧化氫酶；POD：過(guò)氧化物酶。

Note： Value indicates mean square; *, ** indicates the significant (P<0.05) and highly significant (P<0.01) correlation, respectively. ns means not different. EL: Electrolyte leakage; MDA: Malondialdehyde;Gr: Relative growth rate;Pn: Net photosynthetic rate;Fv/Fm: Photochemical efficiency; H2O2: Hydrogen peroxide; O2-·: Superoxide anion; SOD: Superoxide dismutase; APX: Ascorbate peroxidase; CAT: Catalase; POD: Peroxidase.

2.1 CO2濃度對(duì)細(xì)胞膜的影響

在400和800 μmol/mol CO2條件下，熱脅迫都導(dǎo)致EL顯著提高，和對(duì)照相比，分別平均上升了78%和31%；在熱脅迫條件下，隨著處理天數(shù)的增加，400和800 μmol/mol CO2條件下的EL均持續(xù)上升，但處理28 d時(shí)800 μmol/mol CO2條件下的EL比400 μmol/mol條件下降低了72%，差異顯著(圖1A)。

熱脅迫顯著提高了高羊茅在當(dāng)前和高CO2濃度下的MDA含量，處理28 d時(shí)，和對(duì)照相比分別上升了75%和26%；在熱脅迫處理下，400和800 μmol/mol CO2條件下生長(zhǎng)的高羊茅葉片MDA含量均表現(xiàn)為持續(xù)上升，但高濃度CO2較正常CO2顯著抑制了MDA含量的增加(圖1B)。

2.2 CO2濃度對(duì)生長(zhǎng)速率(Gr)和凈光合速率(Pn)的影響

處理28 d時(shí)，在400 μmol/mol CO2下，熱脅迫導(dǎo)致Gr比對(duì)照降低了83%，而800 μmol/mol CO2下，熱脅迫使Gr比對(duì)照降低了64%；適宜溫度條件下，CO2濃度對(duì)Gr沒(méi)有影響，但是在熱脅迫處理的7～21 d內(nèi)，800 μmol/mol CO2下的Gr都顯著高于對(duì)照(圖2A)。

在正常濃度和高CO2濃度條件下，熱脅迫導(dǎo)致Pn均顯著下降，處理28 d時(shí)，和對(duì)照相比分別下降了32%和31%；適宜溫度下的整個(gè)處理期間內(nèi)，800 μmol/mol CO2下生長(zhǎng)的高羊茅葉片的Pn都顯著高于400 μmol/mol CO2；熱脅迫處理下，800 μmol/mol CO2下的Pn從熱處理開(kāi)始就劇烈下降，但到處理28 d時(shí)仍比正常CO2濃度下高出78%，差異顯著(圖2B)。

圖1 CO2濃度和溫度對(duì)高羊茅電解質(zhì)滲漏率和丙二醛含量的影響Fig.1 Effects of CO2 and temperatures on electrolyte leakage and MDA content in tall fescue豎線代表LSD值(P<0.05)，表示同一時(shí)間點(diǎn)不同處理間的差異顯著性。下同。Bar represents difference among different treatments by least significant difference (LSD) test at the level of P<0.05. The same below.

圖2 CO2濃度和溫度對(duì)高羊茅生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of CO2 and temperatures on growth in tall fescue

2.3 CO2濃度對(duì)光化學(xué)效率(Fv/Fm)的影響

熱脅迫顯著降低了高羊茅的Fv/Fm，在400和800 μmol/mol濃度下處理28 d時(shí)分別比對(duì)照下降了21%和9%；在適宜溫度下不同CO2濃度對(duì)Fv/Fm無(wú)顯著影響，但在熱脅迫條件下，高濃度CO2顯著抑制了Fv/Fm的下降，處理結(jié)束時(shí)比400 μmol/mol CO2下升高了17%(圖3)。

2.4 CO2濃度對(duì)葉片衰老的影響

圖3 CO2濃度和溫度對(duì)高羊茅光化學(xué)效率的影響Fig.3 Effects of CO2 and temperatures on photochemical efficiency in tall fescue

在400 μmol/mol CO2條件下，熱脅迫導(dǎo)致綠葉數(shù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)處理期比對(duì)照平均減少了40%，而在800 μmol/mol CO2條件下， 熱脅迫對(duì)綠葉數(shù)沒(méi)有影響；適宜溫度處理的整個(gè)期間內(nèi)，不同CO2濃度對(duì)綠葉數(shù)均無(wú)影響；但是，在熱脅迫下，高濃度CO2顯著提高了綠葉數(shù)，處理28 d時(shí)，比正常濃度CO2下的綠葉數(shù)增加1.65倍(圖4A)。

高溫導(dǎo)致400 μmol/mol CO2條件下的葉片黃綠比急劇上升，處理28 d時(shí)比對(duì)照增加8.75倍，但是對(duì)800 μmol/mol CO2條件下的黃綠比卻無(wú)顯著影響；在適宜溫度下，不同CO2濃度對(duì)黃綠比無(wú)顯著影響；在熱脅迫下，高濃度CO2顯著抑制了黃綠比的持續(xù)升高，到處理結(jié)束時(shí)比400 μmol/mol CO2條件下減少了89%(圖4B)。

圖4 CO2濃度和溫度對(duì)高羊茅葉片衰老的影響Fig.4 Effects of CO2 and temperatures on leaf senescence in tall fescue

2.5 CO2濃度對(duì)活性氧的影響

在400和800 μmol/mol CO2條件下，熱處理第7天時(shí)，葉片過(guò)氧化氫(H2O2)含量均未發(fā)生顯著改變；但是處理到第28天時(shí)，含量均顯著上升，分別比適宜溫度下的含量提高了182%和52%；在適宜溫度下，不同CO2濃度對(duì)H2O2含量沒(méi)有顯著影響；熱脅迫第28天時(shí)，高濃度CO2顯著減少了H2O2含量，比正常CO2濃度下降低了46%(圖5A)。

在400 μmol/mol CO2條件下，熱脅迫導(dǎo)致處理第7和28天時(shí)的高羊茅葉片超氧陰離子(O2-·)含量均顯著升高；但是，在800 μmol/mol CO2條件下O2-·含量卻沒(méi)有發(fā)生顯著變化；與正常CO2濃度相比，高濃度CO2顯著降低了熱脅迫第7和28天時(shí)的O2-·含量，分別下降了43%和31%(圖5B)。

2.6 CO2濃度對(duì)抗氧化酶活性的影響

在400 μmol/mol CO2條件下，處理第7和28天時(shí)，熱脅迫下的葉片SOD活性都顯著下降，分別較正常溫度降低了39%和32%(圖6A)；在800 μmol/mol CO2下，熱脅迫對(duì)7 d處理下的高羊茅葉片SOD活性無(wú)影響，但使處理28 d下的SOD活性比適宜溫度下降低了14%；在適宜溫度下，不同CO2濃度對(duì)SOD活性無(wú)影響；但在熱脅迫下，高濃度CO2顯著提高了處理28 d時(shí)的SOD活性，比對(duì)照升高了26%。

在400 μmol/mol CO2條件下，處理第7天時(shí)，熱脅迫對(duì)葉片APX活性無(wú)顯著影響，處理第28天時(shí)，導(dǎo)致葉片APX活性顯著降低(圖6B)；但是對(duì)800 μmol/mol CO2條件下的葉片APX活性無(wú)顯著影響；熱脅迫條件下，處理28 d時(shí)，高濃度CO2下的葉片APX的活性較正常CO2升高了30%。

圖5 CO2濃度和溫度對(duì)高羊茅活性氧的影響Fig.5 Effects of CO2 and temperatures on reactive oxygen species in tall fescue 豎線代表SE，不同小寫(xiě)字母代表同一時(shí)間點(diǎn)不同處理間的差異顯著(P<0.05)。下同。Bar represents standard error (SE). Different small letters mean significant differences among different treatments at the same time (P<0.05). The same below.

圖6 CO2濃度和溫度對(duì)高羊茅抗氧化酶活性的影響Fig.6 Effects of CO2 and temperatures on antioxidant enzyme activities in tall fescue

在400 μmol/mol CO2條件下，熱脅迫導(dǎo)致處理第7和28天的葉片CAT活性均發(fā)生顯著下降，分別比對(duì)照降低了34%和57%(圖6C)；但是熱脅迫對(duì)800 μmol/mol CO2條件下第7天時(shí)的葉片CAT活性無(wú)顯著影響，28 d時(shí)葉片CAT活性比對(duì)照降低了14%；適宜溫度下，不同CO2濃度對(duì)葉片CAT活性均無(wú)影響；熱脅迫處理第28天時(shí)，800 μmol/mol CO2下的葉片CAT活性比400 μmol/mol升高了50%。

在正常CO2濃度下，處理第7和28天時(shí)，熱脅迫導(dǎo)致葉片POD活性分別比對(duì)照降低了33%和45%(圖6D)；在高濃度CO2條件下，處理第7天，熱脅迫導(dǎo)致葉片POD活性下降，28 d時(shí)無(wú)顯著影響；在適宜溫度和熱脅迫溫度下，不同CO2濃度對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)處理期高羊茅葉片的POD活性均無(wú)影響。

3 討論

3.1 細(xì)胞膜對(duì)CO2濃度和高溫互作的響應(yīng)

植物細(xì)胞膜是細(xì)胞的重要組成部分，為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，是感知溫度變化及其他脅迫最為敏感的部位。在高溫脅迫對(duì)細(xì)胞膜傷害的研究中，電解質(zhì)滲漏率(EL)是一個(gè)用來(lái)衡量細(xì)胞膜完整性的最為普遍且測(cè)定方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的指標(biāo)[17]。另外，膜質(zhì)過(guò)氧化也是植物細(xì)胞膜受到高溫傷害的重要表現(xiàn)，丙二醛(MDA)作為膜質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，可以直接表示膜質(zhì)過(guò)氧化水平和細(xì)胞膜受損傷的程度。本試驗(yàn)中MDA含量的測(cè)定結(jié)果與EL一致，高溫導(dǎo)致MDA含量顯著上升，但高濃度CO2可以明顯抑制其上升幅度。

植物細(xì)胞膜對(duì)高溫的耐受性主要體現(xiàn)在類(lèi)囊體成分的改變，且有研究表明，高溫脅迫導(dǎo)致類(lèi)囊體膜的流動(dòng)性增強(qiáng)，甚至破壞膜結(jié)構(gòu)，但是玉米黃素的積累可以通過(guò)降低類(lèi)囊體膜流動(dòng)性而間接保護(hù)膜系統(tǒng)[18]。葉黃素是類(lèi)胡蘿卜素的一種，而葉黃素包括紫黃素、玉米黃素和環(huán)氧玉米黃素。因此，高濃度CO2對(duì)細(xì)胞膜在熱脅迫下的保護(hù)作用可能與CO2影響植物光合色素的含量有關(guān)，這在高濃度CO2對(duì)油桐(Verniciafordii)和煙草(Nicotianatabacum)的研究中均有發(fā)現(xiàn)[4]。本試驗(yàn)中關(guān)于綠葉數(shù)及黃綠比的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以看出，葉綠素和葉黃素含量在高濃度CO2下發(fā)生變化，但高濃度CO2通過(guò)影響光合色素來(lái)緩解脅迫的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

3.2 光合能力對(duì)CO2濃度和高溫互作的響應(yīng)

植物生長(zhǎng)速率(Gr)是度量植物生長(zhǎng)快慢的單位，高溫脅迫對(duì)植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響，最直接的影響就是生長(zhǎng)受阻。因此，Gr在一定程度可以作為衡量植物受脅迫損害程度的指標(biāo)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫脅迫嚴(yán)重降低了高羊茅的Gr，并且Gr隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，但是高濃度CO2對(duì)Gr的下降有一定的抑制作用。由于CO2濃度的增大，光合作用同化的CO2增多，為葉肉組織提供的原料相應(yīng)增多，因此高濃度CO2對(duì)高羊茅高溫脅迫下的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

高溫脅迫可以通過(guò)各個(gè)途徑影響植物的光合能力，包括促進(jìn)葉綠素的降解，本試驗(yàn)體現(xiàn)為高溫下綠葉數(shù)減少，黃綠比升高。但是，在加以高濃度CO2處理時(shí)，綠葉數(shù)顯著增加。有研究發(fā)現(xiàn)[19]，植物光合作用的最適溫度隨著CO2濃度的升高會(huì)增加2～7 ℃。所以，雖然35 ℃比高羊茅生長(zhǎng)的最適溫度高出10 ℃左右，但是由于高濃度CO2的作用，最適溫度可能提高，故高溫的不利影響減弱。光合作用中的能量轉(zhuǎn)換是由植物光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)和光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)協(xié)同完成的。PSⅡ是結(jié)合在類(lèi)囊體膜上的一個(gè)色素蛋白復(fù)合體，能夠利用光能將水氧化釋放氧氣，把光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[20]，被認(rèn)為是光合機(jī)構(gòu)中對(duì)高溫脅迫最為敏感的部位[7]。因此，PSⅡ吸收光子釋放氧氣的效率即光化學(xué)效率(Fv/Fm)是衡量PSⅡ光抑制的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)也表明，在高溫處理下，F(xiàn)v/Fm顯著下降，但是高濃度CO2條件下的Fv/Fm顯著高于對(duì)照，說(shuō)明高濃度CO2對(duì)PSⅡ在高溫脅迫下有一定的保護(hù)作用。

此外有研究[19]發(fā)現(xiàn)，PSⅡ和PSⅠ在高溫下所受損傷程度及對(duì)高溫的敏感程度存在差異，PSⅡ?qū)Ω邷馗舾?。?dāng)植物處于高溫脅迫下，PSⅡ反應(yīng)中心受到抑制，只吸收捕光色素傳遞的光能而不能將其傳遞并轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[22]，因此光合作用失去能量來(lái)源，加之葉綠素降解，導(dǎo)致凈光合速率(Pn)下降。而對(duì)Pn的測(cè)定結(jié)果也驗(yàn)證了這點(diǎn)。

3.3 抗氧化系統(tǒng)對(duì)CO2濃度和高溫互作的響應(yīng)

高溫脅迫下，植物體內(nèi)ROS過(guò)剩，造成細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，從MDA和EL的結(jié)果也可以看出高溫對(duì)細(xì)胞膜的傷害。但是，高濃度CO2條件可以部分抵消掉高溫造成的ROS積累。有研究表明，植物產(chǎn)生ROS的主要方式是在葉綠體中發(fā)生的光還原反應(yīng)，而光還原反應(yīng)包括類(lèi)囊體、葉綠體基質(zhì)和黃素脫氫酶3條途徑，其中葉綠體基質(zhì)途徑產(chǎn)生ROS會(huì)受到低濃度氧及高濃度CO2的抑制[23]，因此高濃度CO2在一定程度可以減少植物體內(nèi)ROS的積累。PSⅡ是產(chǎn)生ROS的重要部位之一，尤其是在CO2固定受阻的時(shí)候。因此，高濃度CO2可以通過(guò)抑制高溫下ROS的積累而間接保護(hù)PSⅡ，這與對(duì)Fv/Fm的測(cè)定結(jié)果也相吻合。植物的抗氧化系統(tǒng)包括多種酶，SOD是清除ROS的第一道防線，把多余的超氧陰離子(O2-·)轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫(H2O2)；CAT、APX和POD催化H2O2生成水[10]，降低ROS對(duì)植物的毒害作用。在脅迫程度較輕時(shí)，抗氧化酶可以將過(guò)剩的ROS清除，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，脅迫程度不斷加劇，抗氧化酶自身受到毒害，活性下降，ROS開(kāi)始積累。但是，高濃度CO2顯著抑制了抗氧化酶活性的下降，提高了ROS的清除能力。因此，抗氧化酶之間具有協(xié)同互補(bǔ)的作用，在高溫及高濃度CO2下表現(xiàn)出一致的活性變化趨勢(shì)。

4 結(jié)論

綜上可知，高濃度CO2可以提高高羊茅的抗熱性，具體表現(xiàn)為熱脅迫抑制了高羊茅的正常生長(zhǎng)(較低的Gr、Pn、Fv/Fm)，破壞了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性(較高的EL)，使膜脂發(fā)生過(guò)氧化(較高的MDA)，抗氧化酶活性下降(SOD、APX、CAT、POD)；但是，高濃度CO2使熱脅迫條件下生長(zhǎng)的高羊茅具有較高的Gr、Pn、Fv/Fm、綠葉數(shù)及細(xì)胞膜完整性，并且ROS得到有效清除。因此，高濃度CO2對(duì)高羊茅熱脅迫的緩解作用主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：1)對(duì)光合器官的保護(hù)和生長(zhǎng)的促進(jìn)；2)對(duì)細(xì)胞膜穩(wěn)定性的維持；3)對(duì)ROS的有效清除。

References：

[1] Zhang C S, Liu G B, Xue S. Photosynthetic characteristics ofBothriochloaishaemumunder drought stress and elevated CO2concentration. Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23(11): 3009-3015. 張昌盛, 劉國(guó)斌, 薛萐, 等. 干旱脅迫和CO2濃度升高條件下白羊草的光合特征. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 23(11): 3009-3015.

[2] Su Y, Zhao Y F, Mou W Y,etal. Morphological traits and yield of soybean under elevated atmospheric CO2concentration and temperature. Acta Ecologica Sinica, 2016, 36(9): 2597-2606. 蘇營(yíng), 趙逸飛, 牟文雅, 等. 大豆主要株型和產(chǎn)量指標(biāo)對(duì)大氣CO2濃度和溫度升高的響應(yīng). 生態(tài)學(xué)報(bào), 2016, 36(9): 2597-2606.

[3] Zhang Q Y, Zong Y Z, Dong Q,etal. Effects of elevated atmospheric CO2concentration on soybean photosynthesis. Journal of Shanxi Agricultural Science, 2016, 44(11): 1675-1679. 張仟雨, 宗毓錚, 董琦, 等. 大氣CO2濃度升高對(duì)大豆光合生理的影響. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 44(11): 1675-1679.

[4] Zhao T H, Wang M Y, Zhang W W,etal. Effects of elevated atmospheric CO2concentration on plant photosynthesis. Ecology and Environment, 2006, 15(5): 1096-1100. 趙天宏, 王美玉, 張巍巍, 等. 大氣CO2濃度升高對(duì)植物光合作用的影響. 生態(tài)環(huán)境, 2006, 15(5): 1096-1100.

[5] Jing L Q, Lai S K, Wang Y X,etal. Combined effect of rising atmospheric CO2concentration and temperature on growth and development of rice. Acta Ecological Sinica, 2016, 36(14): 4254-4265. 景立權(quán), 賴上坤, 王云霞, 等. 大氣CO2濃度和溫度互作對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2016, 36(14): 4254-4265.

[6] Li L X, Li J L, Zhang Q,etal. Effects of high temperature stress on cell membrane and nuclear DNA of tall fescue turfgrass. Guizhou Agricultural Sciences, 2008, 36(1): 37-39. 李良霞, 李建龍, 張強(qiáng), 等. 高溫脅迫對(duì)高羊茅細(xì)胞膜及其核DNA傷害的影響. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(1): 37-39.

[7] Yang W L, Huang F Q, Cao Z Z,etal. Effects of high temperature stress on PSⅡ function and its relation to D1 protein in chloroplast thylakoid in rice flag leaves. Acta Agronomica Sinica, 2013, 39(6): 1060-1068. 楊衛(wèi)麗, 黃福氣, 曹珍珍, 等. 高溫脅迫對(duì)水稻光合 PSⅡ 系統(tǒng)傷害及其與葉綠體D1蛋白間關(guān)系. 作物學(xué)報(bào), 2013, 39(6): 1060-1068.

[8] Qin L Q, Zhang Y L, Guo F,etal. Damaging mechanisms of peanut (ArachishypogaeaL.) photosystems caused by high-temperature and drought under high irradiance. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(7): 1843-1845. 秦立琴, 張悅麗, 郭峰, 等. 強(qiáng)光下高溫與干旱脅迫對(duì)花生光系統(tǒng)的傷害機(jī)制. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 31(7): 1845-1843.

[9] Du H M, Wang Z L, Yu W J,etal. Differential metabolic responses of perennial grassCynodontransvaalensis×Cynodondactylon(C4) andPoapratensis(C3) to heat stress. Physiologia Plantarum, 2011, 141: 251-264.

[10] Noctor G, Foyer C H. Ascorbate and glutathione: keeping active oxygen under control. Annual Review of Plant Physiology & Plant Molecular Biology, 1998, 49: 249-279.

[11] Xu H, Li L, Li Q H,etal. Effects of elevated atmospheric CO2concentration and temperature on photosynthesis system and quality components in tea plant. Journal of Nanjing Agricultural University, 2016, 39(4): 550-556. 徐輝, 李磊, 李慶會(huì), 等. 大氣CO2濃度與溫度升高對(duì)茶樹(shù)光合系統(tǒng)及品質(zhì)成分的影響. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 39(4): 550-556.

[12] Liang J P, Liu Y M, Niu Y,etal. Effects of high temperature and double CO2on antioxidant enzymes lipid peroxidation inLarixprincipis-rupprechtiiMayr. seedings. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2007, 25(3): 100-103. 梁建平, 劉詠梅, 牛遠(yuǎn), 等. 高溫和CO2濃度倍增對(duì)華北落葉松幼苗抗氧化酶及膜質(zhì)過(guò)氧化的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)生態(tài)學(xué)報(bào), 2007, 25(3): 100-103.

[13] Yu J J, Du H M, Xu M,etal. Metabolic responses to heat stress under elevated atmospheric CO2concentration in a cool-season grass species. Journal of the American Society for Horticultural Science, 2012, 137: 221-228.

[14] Yu J J, Yang Z M, Jespersen D,etal. Photosynthesis and protein metabolism associated with elevated CO2mitigation of heat stress damages in tall fescue. Environmental and Experimental Botany, 2014, 99: 75-85.

[15] Yu J J, Chen L H, Xu M,etal. Effects of elevated CO2on physiological responses of tall fescue to elevated temperature, drought stress, and the combined stresses. Crop Science, 2012, 52(4): 1848-1858.

[16] Zhang J, Li H B, Xu B,etal. Exogenous melatonin suppresses dark-induced leaf senescence by activating the superoxide dismutase-catalase antioxidant pathway and down-regulating chlorophyll degradation in excised leaves of perennial ryegrass (LoliumperenneL.). Frotiers in Plant Science, 2016, 7: 1500(e93724). doi: 10.3389/fpls.2016.01500

[17] Blum A, Ebercon A. Cell membrane stability as a measure of drought and heat tolerance in wheat. Crop Science, 1981, 21(1): 43-47.

[18] Gruszecki W I, Strzalka K. Does the xanthophyll cycle take part in the regulation of the thylakoid membrane. Biochimica et Biophysica Acta, 1991, 1060(3): 310-314.

[19] Ghannoum O, Phillips N G, Sears M A,etal. Photosynthetic responses of two eucalypts to industrial-age changes in atmospheric [CO2] and temperature. Plant Cell and Environment, 2010, 33(10): 1671-1681.

[20] Debus R J, Debus R J. The manganese and calcium ions of photosynthetic oxygen evolution. Biochimica et Biophysica Acta, 1992, 1102(3): 269-352.

[21] Li Z X, Li X, Fan L C,etal. Effects of heat stress on the photosynthesis system of tea leaves. Journal of Tea Science, 2015, 35(5): 415-422. 李治鑫, 李鑫, 范利超, 等. 高溫脅迫對(duì)茶樹(shù)光合系統(tǒng)的影響. 茶葉科學(xué), 2015, 35(5): 415-422.

[22] Tang T, Zheng G W, Li W Q. Defense mechanisms of plant photosystem to heat stress. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2012, 28(2): 127-132. 唐婷, 鄭國(guó)偉, 李唯奇. 植物光合系統(tǒng)對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制. 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2012, 28(2): 127-132.

[23] Guo Y S, Li X Y, Ren X L. Metabolism and function of reactive oxygen species in plant. Heilongjiang Agricultural Sciences, 2011, (8): 146-148. 郭玉雙, 李祥羽, 任學(xué)良. 植物體內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生極其作用研究進(jìn)展. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, (8): 146-148.

Effects of elevated carbon dioxide concentration on the growth and antioxidant system in tall fescue under heat stress

YU Jing-Jin, FAN Ning-Li, LI Ran, YANG Zhi-Min*

CollegeofAgro-grasslandScience,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

The gradual increases in the atmospheric CO2concentration and temperature are the two primary characteristics of global climate change. However, the rising atmospheric CO2concentration could alleviate the negative effects of heat stress. Therefore, the aim of this study was to explore the mitigating effects of elevated CO2on the growth and antioxidant system a perennial grass under heat stress. Tall fescue (Festucaarundinaceacv. ‘Barlexas’) was exposed to either ambient CO2concentration (400 μmol/mol) or elevated CO2concentration (800 μmol/mol) under optimal growth temperature (25/15 ℃ day/night) or elevated temperature (35/25 ℃ day/night) conditions. After 28 days of the experimental treatment, heat stress caused a significant reduction in relative growth rate (RGR), leaf net photosynthetic rate (Pn), number of green leaves, antioxidant enzyme activities [(superoxide dismutase, (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD), and ascorbate peroxidase (APX)], as well as an increase in electrolyte leakage (EL), and the contents of malondialdehyde (MDA) and reactive oxygen species (ROS) (H2O2and O2-·). Elevated CO2mitigated these negative effects of heat stress in tall fescue. Compared with plants grown under heat stress and ambient CO2, those grown under heat stress and elevated CO2had lower leaf EL and MDA contents (72% and 39% lower, respectively); thePn,Fv/Fm, and number of green leaves were increased by 1.74-fold, 17%, and 1.65-fold, respectively; and the ROS contents were significantly lower (H2O2and O2-·contents decreased by 46% and 31%, respectively). These results demonstrated that elevated CO2can improve the heat tolerance of tall fescue through increased photosynthetic capacity, cellular membrane stability, and decreased ROS accumulation.

tall fescue; heat stress; elevated CO2; antioxidant system

10.11686/cyxb2017093

http://cyxb.lzu.edu.cn

2017-03-07；改回日期：2017-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301799)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(KYZ201673)資助。

于景金(1983-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，副教授，博士。E-mail: jingjin_yu@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail: nauyzm@njau.edu.cn

于景金, 范寧麗, 李冉, 楊志民. 高濃度CO2對(duì)熱脅迫條件下高羊茅生長(zhǎng)和抗氧化系統(tǒng)的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(8): 113-122.

YU Jing-Jin, FAN Ning-Li, LI Ran, YANG Zhi-Min. Effects of elevated carbon dioxide concentration on the growth and antioxidant system in tall fescue under heat stress. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(8): 113-122.