隴東旱塬區(qū)不同糧草輪作模式下土壤細菌群落組成特征

梁志婷，鄧建強，王自奎，沈禹穎，王先之

(草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農業(yè)科技學院，草業(yè)科學國家級實驗教學示范中心，甘肅 蘭州 730020)

隴東旱塬區(qū)不同糧草輪作模式下土壤細菌群落組成特征

梁志婷，鄧建強，王自奎，沈禹穎，王先之*

(草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學草地農業(yè)科技學院，草業(yè)科學國家級實驗教學示范中心，甘肅 蘭州 730020)

以隴東旱塬區(qū)冬麥-休閑-大豆(W-F-S)、冬麥-油菜-箭筈豌豆(W-R-V)和冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿(W/F-L-L)糧草輪作系統(tǒng)為對象，基于16S rRNA基因序列擴增子測序，研究了3種輪作模式下耕層土壤(0～10 cm及10～20 cm)細菌群落組成特征。結果表明，3種輪作模式下，土壤細菌群落中占優(yōu)勢的菌門為變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)；土壤細菌群落屬組成中以紅游動菌屬(Rhodoplanes)、出芽菌屬(Gemmata)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、Adhaeribacter菌屬和Balneimonas菌屬等與固氮相關的菌屬為主。W-F-S輪作模式下土壤特異優(yōu)勢菌屬為紫色桿菌屬(Janthinobacterium)和溶桿菌屬(Lysobacter)，該類菌屬與胞囊線蟲的防治有關，間接揭示了該輪作模式可能抑制土傳病害發(fā)生；W-R-V輪作模式下歐文氏菌屬(Erwinia)豐度較高，主要與前茬油菜根系殘留相關；W/F-L-L輪作模式下鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)豐度較高，與苜蓿生長的少免耕措施有關。0～10 cm土層細菌多樣性表現(xiàn)為W-F-S>W/F-L-L>W-R-V，10～20 cm土層表現(xiàn)則呈與之相反趨勢。本研究從細菌群落組成和功能角度，闡釋了包含豆科牧草的糧草輪作系統(tǒng)促進生物固氮、阻隔病害傳播的微生物學機理，可為隴東旱塬區(qū)建立合理草田輪作制度和維持良好土壤生態(tài)環(huán)境提供理論依據(jù)。

黃土高原；微生物；大豆；箭筈豌豆；苜蓿

隴東黃土高原是我國典型雨養(yǎng)農業(yè)區(qū)之一，也是甘肅省冬小麥主產區(qū)。該地區(qū)以冬小麥為主的谷物連作方式及化肥的不合理施用致使土壤有機質含量降低[1-2]，造成作物產量低而不穩(wěn)，影響區(qū)域內農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展[3]。豆科作物與禾谷類作物合理輪作是傳統(tǒng)農業(yè)的精華，是提高農田土壤質量的栽培耕作方式之一[4]。國內外生產實踐證明豆科作物可以通過充分利用其生物固氮特性來提高土壤肥力，減少化肥投入，保持農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定[5-7]。研究表明，通過合理輪作可增加作物種類，豐富地上、地下生物多樣性，從而改善土壤微生態(tài)環(huán)境[8-9]。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)重要組成部分，其群落結構和多樣性主要受植物物種組成和土壤養(yǎng)分狀況的影響[10]。不同作物釋放的根系分泌物不同，其土壤微生物群落生長代謝和群落結構存在差異[11]。細菌是土壤微生物中分布最廣，數(shù)量最多的部分[12]，占土壤微生物總數(shù)的70%～90%，是土壤養(yǎng)分變化的敏感指標之一[13]。近年來，研究微生物群落組成及多樣性一直是揭示植物-微生物互作機制的熱點問題[14]。不同輪作模式對土壤微生物的影響不盡相同，因此確定合理輪作模式對促進當?shù)剞r業(yè)發(fā)展具有重要意義。

在隴東黃土高原，冬小麥收獲后復種豆科牧草箭筈豌豆(Viciasativa)、飼用油菜(Brassicacampestris)及苜蓿(Medicagosativa)構成的糧草輪作系統(tǒng)可提高作物系統(tǒng)生產力和水熱資源利用效率[15]。為明確不同糧草輪作體系的構建對土壤微生物群落組成的影響，本研究以隴東旱塬區(qū)冬麥-休閑-大豆(wheat-fallow-soybean，W-F-S)、冬麥-油菜-箭筈豌豆(wheat-rapeseed-common vetch，W-R-V)、冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿(wheat/fallow-lucerne-lucerne，W/F-L-L)輪作模式為對象，采用Illumina Hiseq平臺研究了3種輪作模式下表層0～20 cm土壤細菌類群組成特征，以期解釋不同作物與土壤細菌類群間的互作關系，為建立合理的草田輪作模式提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗在甘肅省慶陽市西峰區(qū)什社鄉(xiāng)蘭州大學慶陽黃土高原試驗站(N 35°39′，E 107°51′，海拔1297 m)內進行。該區(qū)域是典型黃土高原雨養(yǎng)農業(yè)區(qū)，屬大陸性季風氣候，春冬寒冷干燥，夏季炎熱多雨。多年平均降雨量573 mm(1961-2015年)，主要集中在7、8、9三個月。年均氣溫在8～10 ℃之間，極端最高氣溫39.6 ℃，極端最低氣溫-22.4 ℃，無霜期150～190 d，生長季255 d。供試土壤為黑壚土，質地為粉壤土。本研究開展前，試驗地長期種植冬小麥。0～20 cm土層基礎養(yǎng)分為：有機質含量為3.63 g/kg，全氮含量為0.61 g/kg。pH值8.1，土壤容重為1.24 g/cm3。

1.2 試驗設計

如圖1所示，試驗始于2013年，設置冬麥-休閑-大豆(W-F-S)、冬麥-油菜-箭筈豌豆(W-R-V)、冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿(W/F-L-L)3種輪作模式，小區(qū)面積為4 m×5 m=20 m2，每個處理3次重復，共9個小區(qū)，隨機區(qū)組排列。供試作物分別為大豆(Glycinemax)、箭筈豌豆和紫花苜蓿。大豆播種時間為2015年4月23日，大豆行間距和株間距均為20 cm，箭筈豌豆播種時間為2015年7月11日，播量為75 kg/hm2；苜蓿的播種時間為2014年9月7日，播量為22.5 kg/hm2。各處理施氮肥為尿素、磷肥為磷酸二銨，施氮量為69 kg N/hm2，施磷量為27 kg P2O5/hm2，皆于作物播前將肥料撒施地表后耕翻入土，常規(guī)田間管理。

圖1 3種輪作模式作物種植順序Fig.1 Crop sequence of three crop rotation models

1.3 土壤樣品采集與處理

2015年9月28日分別在大豆(soybean，S)、箭筈豌豆(common vetch，V)和苜蓿(lucerne，L)生育期結束后，用內徑40 mm的土鉆進行耕層土壤取樣，每個小區(qū)采用5點“S”型取樣法，分0～10 cm和10～20 cm兩個層次，共18個樣。為避免污染，每次取樣后土鉆都用75%的酒精消毒。去除植物殘體和石礫等雜物后同層混合均勻樣品，放入滅菌袋用冰盒帶回實驗室。樣品于-80 ℃冰箱保存，用于土壤微生物DNA提取及后續(xù)測定。

1.4 土壤微生物DNA提取和16S rRNA基因高通量測序

每個樣品稱取相當于0.5 g干土重量的新鮮土壤。采用FastDNA?SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals)試劑盒提取土壤微生物總DNA，1%的瓊脂糖電泳檢測DNA樣品是否有降解以及雜質；NanoPhotometer分光光度計檢測樣品純度；Qubit 2.0 Flurometer檢測DNA樣品濃度。利用TE緩沖液將土壤總DNA進行10倍梯度稀釋后，進行PCR擴增。提取DNA流程操作步驟參考試劑盒說明書。

土壤DNA樣品純化后用無菌水稀釋至1 ng/μL，利用細菌16S rRNA基因的通用引物為341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)-805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)擴增土壤微生物16S rRNA的V3+V4區(qū)基因片段。修飾后的通用引物含有不同的Tag標簽用以區(qū)分不同的土壤樣品。PCR反應體系如下：Phusion Master Mix (1X)15 μL，DNA模板(1 ng/μL)10 μL，正、反向引物(0.2 μmol/L)各3 μL，蒸餾水補至30 μL。PCR擴增條件為：95 ℃，3 min；(95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s)，25個循環(huán)；16 ℃,10 min。每個樣品3個重復。獲得擴增產物后，進一步通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物純化效果，測定純化后PCR產物的濃度。將土壤樣品16S rRNA基因的PCR純化產物等摩爾數(shù)混合，利用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒，割膠回收目標條帶。

使用New England Biolabs公司的NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，USA)試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit@2.0熒光計(Life Technologies，CA，USA)和安捷倫科技公司生物分析儀2100系統(tǒng)定量和文庫檢測合格后，使用Illumina HiSeq平臺進行上機測序。文庫構建和測序均在北京安諾優(yōu)達基因科技有限公司進行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2007軟件整理數(shù)據(jù)，然后用Genstat17.0進行單因素方差分析，對同一土層不同輪作模式土壤細菌組成和結構進行方差分析，采用配對T檢驗法檢驗同一輪作模式不同土層土壤細菌群落組成差異。通過主成分(PCA)分析3個輪作模式下土壤細菌在屬水平的相對豐度特征。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品測序結果

測序得到的土壤細菌群落序列讀數(shù)和OTUS數(shù)(表1)，在相似度大于97%的水平上3個輪作模式共獲得高質量目標序列65355條。Cleanreadsrate值均高于80%，說明測序質量可以反映土壤細菌群落組成情況。同一土層不同輪作模式統(tǒng)計分析表明，0～10cm土層各模式下土壤細菌的OTUS的種類數(shù)無顯著差異(P>0.05)，10～20cm土層只有W-F-S出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)；同一輪作模式不同土層統(tǒng)計分析表明，W-R-V的10～20cmOTUS的種類數(shù)差異顯著，其他各輪作模式差異不顯著(P>0.05)。比較OTUS的種類數(shù)發(fā)現(xiàn)：在0～10cm土層內，W-F-S的OTUS種類數(shù)最多，W/F-L-L次之；在10～20cm土層內，W-R-V的OTUS種類數(shù)最多，其次是W/F-L-L。在整個0～20cm耕層土壤中除W-F-S外，其他處理OTUS的種類數(shù)均隨著土層的加深呈增加趨勢。

表1 不同輪作模式下不同土層土壤細菌序列讀數(shù)及OTUS數(shù)

注：大寫字母表示同行之間比較，小寫字母表示同列之間比較，不同字母在0.05水平下差異顯著。下同。

Note： The differences among different soil layer are shown by capital letters in the same rotation model, differences among different rotation models are shown by small letters in the same soil layer, the significant differences atP<0.05 are shown by different letters in the Table. The same below.

2.2 土壤細菌群落Alpha多樣性

在0～10 cm土層內，土壤細菌群落Alpha多樣性指數(shù)在3個輪作模式之間差異均不顯著(P>0.05)。在10～20 cm土層土壤細菌多樣性指數(shù)Shannon和Simpson在W-F-S和W-R-V模式之間差異顯著(P<0.05)。W-R-V模式在兩個土層的Observed species和Shannon指數(shù)出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。由表2可以看出，在0～10 cm土層內，土壤的細菌豐富度指數(shù)Chao1變化趨勢為W-F-S>W-R-V>W/F-L-L，Observed species變化趨勢為：W-F-S>W/F-L-L>W-R-V。土壤細菌的多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)變化趨勢均為：W-F-S>W/F-L-L>W-R-V。在10～20 cm土層內，土壤的細菌豐富度指數(shù)(Chao1和Observed species)、多樣性指數(shù)(Shannon和Simpson)變化趨勢均為：W-R-V>W/F-L-L>W-F-S。上述結果表明，0～10 cm土層，W-F-S的菌群Alpha多樣性最高，W/F-L-L次之。在10～20 cm土層，各處理土壤細菌群落組成Alpha多樣性指數(shù)呈現(xiàn)出與0～10 cm相反的趨勢。

2.3 不同分類水平下土壤細菌組成

在門水平上，除極少部分細菌(0.02%～0.05%)未被分類外，3種輪作模式下兩個土層土壤細菌均主要分布在25個細菌門類。圖2和圖3分別為0～10 cm和10～20 cm土層豐度前10(占總量的98%)的菌門分布。其中優(yōu)勢菌門均為酸桿菌門(33.47%～39.76%)和變形菌門(32.55%～37.60%)。在0～10 cm土層中疣微菌門(Verrucomicrobia)的豐度在W-R-V模式中顯著高于W/F-L-L模式(P<0.05)，硝化螺旋菌門豐度在W-F-S模式中顯著高于W-R-V和W/F-L-L(P<0.05)。在10～20 cm土層，W-F-S模式中酸桿菌門豐度顯著高于W-R-V模式而綠彎菌門(Chloroflexi)豐度顯著低于W-R-V模式(P<0.05)；W-R-V的放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和疣微菌門豐度顯著高于其他兩個輪作模式。其余各菌在各樣品中均有分布，相對豐度因處理不同而存在差異，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 各輪作模式下0～20 cm土壤細菌群落Alpha多樣性比較

圖2 不同輪作模式0～10 cm土層土壤在門水平上的細菌類群比較Fig.2 Comparison of bacteria groups at phylum level in soil of 0-10 cm layer under different rotation models 不同小寫字母代表不同輪作模式間的差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters represent significant differences among different rotation models (P<0.05). Proteobacteria: 變形菌門；Acidobacteria: 酸桿菌門；Bacteroidetes: 擬桿菌門；Actinobacteria: 放線菌門；Planctomycetes: 浮霉菌門；Gemmatimonadetes: 芽單胞菌門；Verrucomicrobia: 疣微菌門；Chloroflexi: 綠彎菌門；Nitrospirae: 硝化螺旋菌門；Armatimonadetes: 裝甲菌門. 下同The same below.

圖3 不同輪作模式10～20 cm土層土壤在門水平上的細菌類群比較Fig.3 Comparison of bacteria groups at phylum level in soil of 10-20 cm layer under different rotation models

圖4 不同輪作模式0～10 cm土層土壤在屬水平上的細菌類群比較Fig.4 Comparison of bacteria groups at genus level in soil of 0-10 cm layer under different rotation models Arthrobacter: 節(jié)細菌屬；Rhodoplanes: 紅游動菌屬；Nitrospira: 硝化螺旋菌屬；Sphingomonas: 鞘脂單胞菌屬；Lysobacter: 溶桿菌屬；Janthinobacterium:紫色桿菌屬；Gemmata:出芽菌屬；Devosia:德沃斯氏菌屬；Pseudomonas:假單胞菌屬； Phenylobacterium:苯基桿菌屬；Bradyrhizobium:慢生根瘤菌屬；Erwinia:歐文氏菌屬；Bacillus:芽孢桿菌屬；Variovorax:貪噬菌屬；Balneimonas:拜納蒙納斯屬。下同The same below.

圖5 不同輪作模式10～20 cm土層土壤在屬水平上的細菌類群比較Fig.5 Comparison of bacteria groups at genus level in soil of 10-20 cm layer under different rotation models

在屬的分類水平，除未被分類的細菌屬外(84.96%～90.38%)，0～10 cm土層各輪作模式土壤細菌相對豐度前25的細菌菌屬分布見圖4。3個模式下土壤各細菌屬所占相對豐度大小存在差異，其中硝化螺旋菌屬和紫色桿菌屬豐度在W-F-S模式顯著高于W/F-L-L模式，而CandidatusSolibacter菌屬豐度顯著低于W/F-L-L模式(P<0.05)；Flavisolibacter菌屬和苯基桿菌屬(Phenylobacterium)在W/F-L-L模式豐度顯著低于其他輪作模式(P<0.05)；紅游動菌屬在W-F-S模式豐度高于W/F-L-L和W-R-V，且差異顯著(P<0.05)；Adhaeribacter菌屬在W-R-V模式豐度較高且差異顯著(P<0.05)。各處理前5種優(yōu)勢細菌屬除了共有菌屬Kaistobacter屬(2.73%～3.67%)和Flavisolibacter屬(1.15%～1.90%)外，W-F-S下優(yōu)勢菌屬還包括節(jié)細菌屬(Arthrobacter，0.90%)、紅游動菌屬(0.85%)和紫色桿菌屬(0.77%)，W-R-V下包括節(jié)細菌屬(1.37%)、歐文氏菌屬(0.78%)和Adhaeribacter菌屬(0.66%)；W/F-L-L包括鞘脂單胞菌屬(0.83%)、紅游動菌屬(0.60%)和Fimbriimonas菌屬(0.47%)。

在10～20 cm土層土壤內3個輪作模式土壤細菌屬的相對豐度大小均存在差異，其中W/F-L-L模式中的紅游動菌屬相對豐度顯著高于W-R-V模式(P<0.05)；紫色桿菌屬和Ramlibacter菌屬在W-F-S模式中相對豐度顯著高于其他模式(P<0.05)；W-R-V模式中的CandidatusSolibacter菌屬豐度顯著低于W-F-S和W/F-L-L模式，而Adhaeribacter菌屬和Iamia菌屬豐度較其他模式高且差異顯著(P<0.05)；W/F-L-L模式中出芽菌屬豐度顯著高于W-F-S和W-R-V模式(P<0.05)。Kaistobacter仍然是3種模式下的共有屬(1.63%～4.53%)，此外硝化螺旋菌屬(0.76%～1.34%)、節(jié)細菌屬(0.85%～1.81%)和紅游動菌屬(0.75%～1.90%)也是共有菌屬。W-F-S下優(yōu)勢菌屬還包括溶桿菌屬(0.73%)；W-R-V還包括Iamia菌屬(0.51%)；W/F-L-L還包括出芽菌屬(0.99%)(圖5)。

2.4 土壤細菌屬相對豐度的主成分分析

圖6 不同輪作模式不同土層土壤在屬水平細菌相對豐度主成分分析 Fig.6 Principal component analysis of bacteria relative abundance in different soil layers under different rotation modelsS10、V10、L10分別表示W-F-S、W-R-V和W/F-L-L模式0～10 cm土層樣品；S20、V20、L20分別表示W-F-S、W-R-V和W/F-L-L模式10～20 cm土層樣品。S10, V10 and L10 respectively represent the samples of 0-10 cm soil layer in W-F-S, W-R-V and W/F-L-L models; S20, V20 and L20 respectively represent the samples of 10-20 cm soil layer in W-F-S, W-R-V and W/F-L-L.

3種輪作模式下土壤細菌物種相對豐度共提取6個主成分，累積貢獻率達85.82%，其中第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)貢獻率分別為33.85%和18.60%。從圖6中可以看出，3種輪作模式的0～10 cm均分布在PC1軸負方向，W/F-L-L模式的10～20 cm分布在正方向。W-R-V模式的0～10 cm分布在PC2軸正方向，W/F-L-L模式的0～10 cm、W-F-S和W-R-V模式的10～20 cm分布在負方向。

載荷因子反映主成分與細菌屬水平豐度的相關系數(shù)，載荷因子越高，表示該細菌屬對主成分的影響越大[16]。與第一主成分(PC1)具有較高相關性的細菌屬主要有紅游動菌屬、Pirellula菌屬、慢生根瘤菌屬、出芽菌屬和硝化螺旋菌屬，與第二主成分(PC2)具有較高相關性的細菌屬則主要有Balneimonas菌屬、DA101菌屬、苯基桿菌屬、德沃斯氏菌屬(Devosia)和Adhaeribacter菌屬(表3)。

表3 25個細菌屬水平豐度的主成分載荷因子

注：帶*的為兩個主成分中相關性前5的細菌屬。

Note： * are the top 5 related genus of the two main components.

3 討論

3.1 不同輪作模式下土壤細菌多樣性特征

微生物多樣性反映微生物與土壤環(huán)境間的相互關系，不同輪作模式中各作物對微生物多樣性的影響不同[17]。本研究以不同豆科作物構成的輪作模式為對象，發(fā)現(xiàn)在冬麥-休閑-大豆模式下土壤0～10 cm細菌多樣性最高，這與李曉慧等[18]曾報道種植大豆更有利于土壤微生物的生長和繁殖，提高土壤細菌豐度一致。而且研究表明輪作中對土壤短期休閑處理，使土壤保持肥力，對土壤表層的微生物種群和群落組成有積極作用[19]。冬麥-油菜-箭筈豌豆模式下0～10 cm細菌多樣性最低，可能是由于此輪作模式下作物種類多，耕作頻繁而擾動土壤生境，導致土壤微生物群落環(huán)境不穩(wěn)定，致使一些適應特定環(huán)境的微生物失去活性[20]。而冬麥-油菜-箭筈豌豆和冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿模式下10～20 cm多樣性相對較高的原因是箭筈豌豆前茬油菜的直根系可以分泌有機酸，促進了土壤難溶性的磷轉化為有效磷，改善土壤養(yǎng)分和生物體的代謝，提高土壤微生物群落活性，有增加微生物數(shù)量及其多樣性的作用[21]；而苜蓿是多年生作物，隨著生長年限增加，土壤根系累積增多，導致其土壤微生物多樣性較高。在0～20 cm耕層土壤中冬麥-休閑-大豆微生物多樣性表現(xiàn)最低，這可能是由于大豆種植前，土壤處于冬閑期，導致微生物失去繁殖所需載體[22]，這與植被覆蓋下細菌種類豐度較裸地要高的結果一致[23]。

3.2 不同輪作模式下土壤細菌類群組成

土壤細菌群落結構受種植作物的影響[24]，作物種類不同其土壤微生物所處環(huán)境不同，細菌組成和豐度大小有差異，不同的農田土壤中存在共有和特異的細菌種群[25]。本研究發(fā)現(xiàn)變形菌、酸桿菌和擬桿菌在各輪作模式豐度較高，這一結果與Sapp等[26]、Liu等[27]和王伏偉等[28]對小麥和大豆土壤細菌的研究結果一致。在屬的水平，Kaistobacter屬在0～20 cm耕層豐度較高，該屬為不產氧光合細菌，其功能與光合作用和固氮作用緊密相關[29]，這與3個模式取樣階段均為豆科作物相符。紅游動菌屬具有脫氮作用，是具有降解有機物及一些難以生物降解的含氮化合物功能菌，在豆科作物土壤中較常見，且在光照厭氧和黑暗好氧條件下降解效果更好[30]。本研究中冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿模式下10～20 cm紅游動菌屬豐度最大，由于苜蓿為多年生作物，免耕下10～20 cm土層氧氣含量低于0～10 cm土層。節(jié)細菌屬是土壤常見細菌之一，為化能異養(yǎng)菌，具有脫硫、解磷和固氮作用[31]，在冬麥-油菜-箭筈豌豆模式下豐度最高，這可能與油菜根系分泌有機酸有關。0～10 cm土層土壤細菌中Flavisolibacter屬豐度表現(xiàn)較高，這可能由于其為纖維素降解菌屬，其產生纖維素酶水解0～10 cm土層植物凋落物的細胞壁，促進根瘤菌侵染根系[32]。輪作系統(tǒng)可以通過增加作物多樣性改變土壤環(huán)境，抑制植物的一些土傳病害發(fā)生[33]。研究表明，某些植物能夠與微生物產生互作作用，對植物病害控制產生一定效果，同時也可能會引起某種作物感染病害[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，冬麥-休閑-大豆模式土壤中紫色桿菌屬豐度較高，該菌屬能夠通過產生幾丁質酶或紫色桿菌素的方式對大豆胞囊線蟲發(fā)育產生抑制作用，有生防效果[35]。冬麥-油菜-箭筈豌豆土壤中歐文氏菌屬豐度較高，與種植油菜密切相關，歐文氏菌屬是十字花科等植物的病原菌，易引起植物器官和組織的軟腐，能夠以腐生的形式存活于土壤耕層或在植物殘體中存活并越冬[36-37]。研究結果揭示了在隴東旱塬區(qū)冬麥后復種大豆、箭筈豌豆改善土壤肥力的同時，提示在有大豆加入的輪作土壤中對胞囊線蟲防治效果較好、油菜參與的輪作系統(tǒng)中需關注軟腐病的發(fā)生。冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿土壤中鞘脂單胞菌屬和Fimbriimonas菌屬豐度較高，此二菌均具有固氮和脫氮特征，在維持氮平衡方面起重要作用[38]。劉丹丹等[39]在連作根圍土壤發(fā)現(xiàn)鞘脂單胞菌屬類群數(shù)量增加。Fimbriimonas菌屬為需氧、嗜溫且非運動性細菌，適宜低營養(yǎng)濃度環(huán)境生存[40]，而苜蓿是二年生，較箭筈豌豆和大豆地上、地下生物量大，對土壤擾動頻率低，所以Fimbriimonas菌屬在冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿0～10 cm土層中豐度較高。在10～20 cm土層土壤，硝化螺旋菌屬豐度表現(xiàn)相對較高，這可能與其參與土壤氮循環(huán)，適宜在低碳和氮土壤中生存相關聯(lián)[41]。冬麥-休閑-大豆模式下溶桿菌屬豐度較高，該菌與大豆胞囊線蟲的卵和胞囊發(fā)育有關，其中抗生素溶桿菌有效防治大豆銹病[42]，因此有大豆參加的輪作可以很好地抑制有關病蟲害。冬麥/休閑-苜蓿-苜蓿模式豐度表現(xiàn)較高的出芽菌屬為厭氧氨氧化菌，適宜養(yǎng)分含量較低環(huán)境，促進氮循環(huán)[43]，在非根際土壤豐度較高[44]。

3.3 不同輪作模式對土壤細菌屬水平物種豐度的影響

因子載荷用來反映微生物群落的生理特征，是其群落組成和功能多樣性的具體表現(xiàn)[45]，同時結合主成分分析可以解釋不同處理土壤微生物群落組成不同。本研究中紅游動菌屬、出芽菌屬和硝化螺旋菌屬與第一主成分相關性較高，這與相對豐度結果相一致。研究發(fā)現(xiàn)慢生根瘤菌屬具備溶無機磷酸鹽的能力，接種該菌株可提高大豆光合作用色素含量[46]，在非根際土壤豐度較高。Pirellula菌屬為專性好氧菌參與土壤氮循環(huán)，在0～10 cm土壤中較豐富。因此，在第一主成分它們相關性較高。本研究中，Balneimonas菌屬、DA101菌屬、苯基桿菌屬和德沃斯氏菌屬與第二主成分相關性較高。Balneimonas菌屬是與豆科植物相關的根瘤菌屬；DA101菌屬好氧，一般在表土層豐度較高，可利用植物生物代謝有機碳過程中的化學能[47]。苯基桿菌屬和德沃斯氏菌屬均為固氮菌，屬于好氧細菌常見于土壤表層[48]。但目前為止，德沃斯氏菌屬在土壤中的具體功能還鮮有報道?？傮w來看，與第一、第二主成分相關性較高的菌屬均與生物固氮性能有關，這與本研究采用的輪作模式中均包含豆科作物相吻合。

4 結論

在隴東旱塬冬小麥后采用不同的豆科作物復種輪作方式下，土壤0～10 cm細菌多樣性以W-F-S模式下最高，W-R-V最低；10～20 cm土層表現(xiàn)出相反趨勢。3種輪作模式下細菌群落組成接近，土壤細菌大部分為與固氮有關的菌如紅游動菌屬、出芽菌屬和硝化螺旋菌屬等；W-F-S模式中與防治胞囊線蟲有關的紫色桿菌屬和溶桿菌屬豐度較高；W-R-V模式土壤中發(fā)現(xiàn)病原菌歐文氏菌屬的出現(xiàn)可能受前茬油菜的根系殘留影響；W/F-L-L模式土壤中菌屬以固氮作用為主。研究結果發(fā)現(xiàn)，通過冬麥后復種大豆、箭筈豌豆，或采用小麥-苜蓿輪作模式可改善隴東旱塬區(qū)土壤肥力，并揭示了防治某些土傳植物病害的微生物機理。

References：

[1] Deng Z Y, Zhang Q, Wang Q,etal. Influence of water storage capacity on yield of winter wheat in dry farming area in the Loess Plateau. Acta Ecologica Sinica, 2011, 31(18): 5281-5290. 鄧振鏞, 張強, 王強, 等. 黃土高原旱塬區(qū)土壤貯水量對冬小麥產量的影響. 生態(tài)學報, 2011, 31(18): 5281-5290.

[2] Wang T, Li L L, Zhou H Y,etal. Effects of long-term fertilization on soil nitrogen under rain-fed farming in Loess Plateau of East Gansu. Acta Pedologica Sinica, 2016, 53(1): 177-188. 王婷, 李利利, 周海燕, 等. 長期不同施肥措施對雨養(yǎng)條件下隴東旱塬土壤氮素的影響. 土壤學報, 2016, 53(1): 177-188.

[3] Yang N, Wang Z, Gao Y,etal. Effects of planting soybean in summer fallow on wheat grain yield, total N and Zn in grain and available N and Zn in soil on the Loess Plateau of China. European Journal of Agronomy, 2014, 58: 63-72.

[4] Zhou L, Yang Y, Wang Z H,etal. Influence of maize-soybean rotation and N fertilizer on bacterial community composition. Acta Agronomica Sinica, 2013, 39(11): 2016-2022. 周嵐, 楊永, 王占海, 等. 玉米-大豆輪作及氮肥施用對土壤細菌群落結構的影響. 作物學報, 2013, 39(11): 2016-2022.

[5] Christiansen S, Ryan J, Singh M,etal. Potential legume alternatives to fallow and wheat monoculture for mediterranean environments. Crop & Pasture Science, 2014, 66(2): 175-182.

[6] Northup B K, Rao S C. Summer legume ‘green’ nitrogen crops affect winter wheat forage in continuous rotation. Crops and Soils, 2016, 49(1): 39-41.

[7] Qin S H, Cao L, Zhang J L,etal. Effect of rotation of leguminous plants on soil available nutrients and physical and chemical properties in continuous cropping potato field. Acta Agronomica Sinica, 2014, 40(8): 1452-1458. 秦舒浩, 曹莉, 張俊蓮, 等. 輪作豆科植物對馬鈴薯連作田土壤速效養(yǎng)分及理化性質的影響. 作物學報, 2014, 40(8): 1452-1458.

[8] Tiemann L K, Gry A S, Atkinson E E,etal. Crop rotational diversity enhances belowground communities and functions in an agroecosystem. Ecology Letters, 2015, 18(8): 761.

[9] Song L P, Luo Z Z, Li L L,etal. Effects of lucerne-crop rotation patterns on soil aggregate stability and soil organic carbon. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2016, 24(1): 27-35. 宋麗萍, 羅珠珠, 李玲玲, 等. 苜蓿-作物輪作模式對土壤團聚體穩(wěn)定性及有機碳的影響. 中國生態(tài)農業(yè)學報, 2016, 24(1): 27-35.

[10] Chen D, Cheng J, Chu P,etal. Regional-scale patterns of soil microbes and nematodes across grasslands on the Mongolian plateau: relationships with climate, soil, and plants. Ecography, 2015, 38(6): 622-631.

[11] Li G B, Li G Y, Sun C S,etal. Rhizosphere microbe quantity and biomass accumulation ofAstragalusmongholicusunder drought stress. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2015, 35(9): 1868-1874. 李國斌, 李光躍, 孫窗舒, 等. 干旱脅迫對蒙古黃芪生物量及其根際微生物種群數(shù)量的影響. 西北植物學報, 2015, 35(9): 1868-1874.

[12] Fierer N, Caporaso J G, Fierer N,etal. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2012, 109(52): 21390-21395.

[13] Liu W Q, Mao Z C, Yang Y H,etal. Analysis of soil bacterial diversity by using the 16S rRNA gene library. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(10): 1344-1350. 劉瑋琦, 茆振川, 楊宇紅, 等. 應用16S rRNA基因文庫技術分析土壤細菌群落的多樣性. 微生物學報, 2008, 48(10): 1344-1350.

[14] Herrera Paredes S, Lebeis S L. Giving back to the community: microbial mechanisms of plant——soil interactions. Functional Ecology, 2016, 30(7): 1043-1052.

[15] Deng J Q, Liang Z T, Liu Y B,etal. Dry matter production and water use of winter wheat-forage catch crop rotation systems on the Longdong Loess Plateau. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(2): 161-170. 鄧建強, 梁志婷, 劉淵博, 等. 隴東旱塬冬小麥復種飼草輪作系統(tǒng)產量和水分利用特征. 草業(yè)學報, 2017, 26(2): 161-170.

[16] Shi P, Gao Q, Wang S P,etal. Effects of continuous cropping of corn and fertilization on soil microbial community functional diversity. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(22): 6173-6182. 時鵬, 高強, 王淑平, 等. 玉米連作及其施肥對土壤微生物群落功能多樣性的影響. 生態(tài)學報, 2010, 30(22): 6173-6182.

[17] Nannipieri P, Ascher J, Ceccherini M T,etal. Microbial diversity and soil functions. European Journal of Soil Science, 2003, 54(4): 655-670.

[18] Li X H, Han X Z, Wang S Q,etal. Soil Microorganism amount and population as affected by different crop roots. Soil and Crop, 2010, 26(2): 156-159. 李曉慧, 韓曉增, 王樹起, 等. 土壤微生物對不同作物根系活動的響應. 土壤與作物, 2010, 26(2): 156-159.

[19] Acostamartínez V, Mikha M M, Vigil M F. Microbial communities and enzyme activities in soils under alternative crop rotations compared to wheat-fallow for the Central Great Plains. Applied Soil Ecology, 2007, 37(1/2): 41-52.

[20] Li T, Wang Z T, Liu L,etal. Effect of conservation tillage practices on soil microbial spatial distribution and soil physico-chemical properties of the Northwest Dryland. Scientia Agricultura Sinica, 2017, 50(5): 859-870. 李彤, 王梓廷, 劉露, 等. 保護性耕作對西北旱區(qū)土壤微生物空間分布及土壤理化性質的影響. 中國農業(yè)科學, 2017, 50(5): 859-870.

[21] Yang R J, Ma H L, Yang Q F,etal. Effects of planting density and nitrogen application rate on soil microbial activity under wheat/forage rape multiple cropping. Chinese Journal of Applied Ecology, 2007, 18(1): 113-117. 楊瑞吉, 馬海靈, 楊祁峰, 等. 種植密度與施氮量對麥茬復種飼料油菜土壤微生物活性的影響. 應用生態(tài)學報, 2007, 18(1): 113-117.

[22] Li Z H, Han Z Q, Gao F H,etal. Effects of different preceding crops on rhizosphere microorganisms of flue-cured tobacco plant. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2011, 27(22): 114-118. 李忠環(huán), 韓智強, 高福宏, 等. 不同前茬對烤煙根際土壤微生物的影響. 中國農學通報, 2011, 27(22): 114-118.

[23] Roesch L F W, Fulthorpe R R, Riva A,etal. Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity. Isme Journal, 2007, 1(4): 283-290.

[24] Wen X, Dubinsky E, Yao W U,etal. Wheat, maize and sunflower cropping systems selectively influence bacteria community structure and diversity in their and succeeding crop’s rhizosphere. Journal of Integrative Agriculture, 2016, 15(8): 1892-1902.

[25] Wu F Z, Wang X Z. Effect of soybean-cucumber and wheat-cucumber rotation on soil microbial community species diversity. Acta Horticulturae Sinica, 2007, 34(6): 1543-1546. 吳鳳芝, 王學征. 黃瓜與小麥和大豆輪作對土壤微生物群落物種多樣性的影響. 園藝學報, 2007, 34(6): 1543-1546.

[26] Sapp M, Harrison M, Hany U,etal. Comparing the effect of digestate and chemical fertiliser on soil bacteria. Applied Soil Ecology, 2014, 86: 1-9.

[27] Liu J, Sui Y, Yu Z,etal. High throughput sequencing analysis of biogeographical distribution of bacterial communities in the black soils of northeast China. Soil Biology & Biochemistry, 2014, 70(2): 113-122.

[28] Wang F W, Wang X B, Li J C,etal. Effects of fertilization and straw incorporation on bacterial communities in lime concretion black soil. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2015, 23(10): 1302-1311. 王伏偉, 王曉波, 李金才, 等. 施肥及秸稈還田對砂姜黑土細菌群落的影響. 中國生態(tài)農業(yè)學報, 2015, 23(10): 1302-1311.

[29] Yang S P, Lin Z H, Cui X H,etal. Current taxonomy of anoxygenic phototrophic bacteria—A review. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(11): 1562-1566. 楊素萍, 林志華, 崔小華, 等. 不產氧光合細菌的分類學進展. 微生物學報, 2008, 48(11): 1562-1566.

[30] Chen C J, Zhang H Q, Wang Y Q,etal. Characteristics of microbial community in each compartment of ABR ANAMMOX reactor based on high-throughput sequencing. Environmental Science, 2016, 37(7): 2652-2658. 陳重軍, 張海芹, 汪瑤琪, 等. 基于高通量測序的ABR厭氧氨氧化反應器各隔室細菌群落特征分析. 環(huán)境科學, 2016, 37(7): 2652-2658.

[31] Tian G J, Wang H, Chen L H. Isolation and determination of nitrogen-fixing bacteria in rhizosphere of main tree species in Chifeng, Inner Mongolia. Inner Mongolia Forestry Science and Technology, 2016, 42(1): 21-26. 田國杰, 王晗, 陳立紅. 內蒙古赤峰地區(qū)主要樹種根際固氮菌的分離和鑒定. 內蒙古林業(yè)科技, 2016, 42(1): 21-26.

[32] Deng Z S, Du Y, He X L,etal. Combined rhizobium of robinia pseudoacacia with cellulose-decomposing bacteria for promoting growth of Shanghai Green (Brassicachinensis) andSorghumvulgare. Journal of Microbiology, 2016, 36(1): 36-41. 鄧振山, 杜洋, 賀曉龍, 等. 刺槐根瘤菌與纖維素分解菌對上海青和高粱的促生效應. 微生物學雜志, 2016, 36(1): 36-41.

[33] Niu J, Chao J, Xiao Y,etal. Insight into the effects of different cropping systems on soil bacterial community and tobacco bacterial wilt rate. Journal of Basic Microbiology, 2017, 57(1): 3-11.

[34] Gong X F, Song Z F, Miao M J,etal. Regulation molecular mechanisms of Ca2+signaling on plant-environmental microorganism interactions. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2016, 36(10): 2128-2136. 鞏雪峰, 宋占鋒, 苗明軍, 等. Ca2+信號在植物與環(huán)境微生物互相作用中的分子調控機制. 西北植物學報, 2016, 36(10): 2128-2136.

[35] Wu Y P, Shi F Y, Hamid M I,etal. Endophytic bacterial diversity of wild soybean (Glycinesoja) varieties with different resistance to soybean cyst nematode (Heteroderaglycines). Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(8): 926-935. 武云鵬, 史鳳玉, Hamid M I, 等. 野生大豆抗感大豆孢囊線蟲材料內生細菌多樣性分析. 微生物學報, 2014, 54(8): 926-935.

[36] Togashi J, Ueda K, Namai T. Overwintering ofErwiniacarotovorasubsp.carotovorain diseased tissues in soil and its role as inoculum for soft rot of Chinese cabbage (BrassicacampestrisL., Pekinensis Group). Journal of General Plant Pathology, 2001, 67(1): 45-50.

[37] Zhao L, Chai Z X, Li J H,etal. Isolation and identification of four newErwiniacarotovorasubsp.carotovorastrains. Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(4): 244-251. 趙玲, 柴兆祥, 李金花, 等. 四株胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌胡蘿卜亞種新菌株的分離鑒定. 草業(yè)學報, 2011, 20(4): 244-251.

[38] Hu J, He X H, Li D P,etal. Progress in research ofSphingomonas. Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 2007, 13(3): 431-437. 胡杰, 何曉紅, 李大平, 等. 鞘氨醇單胞菌研究進展. 應用與環(huán)境生物學報, 2007, 13(3): 431-437.

[39] Liu D D, Li M, Liu R J. Recent advances in the study of plant growth-promoting rhizobacteria in China. Chinese Journal of Ecology, 2016, 35(3): 815-824. 劉丹丹, 李敏, 劉潤進. 我國植物根圍促生細菌研究進展. 生態(tài)學雜志, 2016, 35(3): 815-824.

[40] Im W T, Hu Z Y, Kim K H,etal. Description ofFimbriimonasginsengisoligen. nov., sp. nov. within theFimbriimonadiaclassnov., of the phylum Armatimonadetes. Antonie van Leeuwenhoek, 2012, 102(2): 307-317.

[41] Luo X, Han S, Lai S,etal. Long-term straw returning affectsNitrospira-like nitrite oxidizing bacterial community in a rapeseed-rice rotation soil. Journal of Basic Microbiology, 2017, 57(4): 309-315.

[42] Ji G H. Advances in the study onLysobacterspp. bacteria and their effects on biological control of plant diseases. Journal of Yunnan Agricultural University: Natural Science Edition, 2011, 26(1): 124-130. 姬廣海. 溶桿菌屬及其在植物病害防治中的研究進展. 云南農業(yè)大學學報: 自然科學版, 2011, 26(1): 124-130.

[43] Wagner M, Horn M. ThePlanctomycetes,Verrucomicrobia,Chlamydiaeand sister phyla comprise a superphylum with biotechnological and medical relevance. Current Opinion in Biotechnology, 2006, 17(3): 241-249.

[44] Wang Q T, Zhu W R, Liu M L,etal. Comparison on bacterial community of rhizosphere and bulk soil of poplar plantation based on pyrosequencing. Chinese Journal of Applied Environmental Biology, 2015, 21(5): 967-973. 汪其同, 朱婉芮, 劉夢玲, 等. 基于高通量測序的楊樹人工林根際和非根際細菌群落結構比較. 應用與環(huán)境生物學報, 2015, 21(5): 967-973.

[45] Long J, Huang C Y, Teng Y,etal. Research on soil microbial characteristics of soil-Elsholtziaharchowensissystem in copper mine tailings. Acta Pedologica Sinica, 2004, 41(1): 120-125. 龍健, 黃昌勇, 滕應, 等. 銅礦尾礦庫土壤-海洲香薷(Elsholtziaharchowensis)植物體系的微生物特征研究. 土壤學報, 2004, 41(1): 120-125.

[46] Guo J, Chi J. Effect of Cd-tolerant plant growth-promoting rhizobium on plant growth and Cd uptake byLoliummultiflorumLam. andGlycinemax(L.) Merr. in Cd-contaminated soil. Plant and Soil, 2014, 375(1): 205-214.

[47] Sangwan P, Chen X, Hugenholtz P,etal. Chthoniobacter flavus gen. nov., sp. nov., the first pure-culture representative of subdivision two, spartobacteria classis nov., of the phylum verrucomicrobia. Applied & Environmental Microbiology, 2004, 70(10): 5875-5881.

[48] Oh Y S, Roh D H. Phenylobacterium muchangponense sp. nov., isolated from beach soil, and emended description of the genus Phenylobacterium. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology, 2012, 62: 977-983.

Differences in soil bacterial community composition among three forage-crop rotations on the Longdong Loess Plateau

LIANG Zhi-Ting, DENG Jian-Qiang, WANG Zi-Kui, SHEN Yu-Ying, WANG Xian-Zhi*

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-Ecosystems,CollegeofPastoralAgriculturalScienceandTechnology,NationalDemonstrationCenterforExperimentalGrasslandScienceEducation,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

We analyzed the composition of the soil bacterial community in two topsoil layers (0-10 cm and 10-20 cm) under three crop-forage rotation models; winter wheat-fallow-soybean (W-F-S), winter wheat-forage rapeseed-common vetch (W-R-V), and winter wheat/fallow-lucerne (W/F-L-L). The soil bacterial community was analyzed by sequencing 16S rRNA gene amplicons. The results indicated that the dominant phyla in the topsoil were Proteobacteria and Acidobacteria under all three rotation models. The dominant genera in the topsoil under the three rotation models wereRhodoplanes,Gemmata,Nitrospira,Bradyrhizobium,Adhaeribacter, andBalneimonas. The bacterial communities in the topsoil under the W-F-S rotation sequence were dominated byJanthinobacteriumandLysobacter, which were related to the prevention and control of soybean cyst nematode, and were closely associated with soil-borne pathogen resistance under the W-F-S rotation. The dominant genus in topsoil in the W-R-V rotation wasErwinia, which was related to rapeseed, and that in the W/F-L-L rotation sequence wasSphingomonas, which was indicative of no- or low-tillage during alfalfa planting. The rotations could be ranked, from highest bacterial alpha-diversity to lowest, as follows W-F-S>W/F-L-L>W-R-V in the 0-10 cm topsoil layer; and W-R-V>W/F-L-L>W-F-S in the 10-20 cm topsoil layer. This study reveals the mechanisms by which nitrogen fixation is promoted and soil-borne pathogens are inhibited in various crop-forage rotation systems, from the perspective of the bacterial community composition and function. The results of this study have important theoretical value for maintaining a healthy soil ecological environment and for establishing successful forage-crop rotation systems on the Longdong Loess Plateau.

Loess Plateau; microorganism; soybeans; common vetch; lucerne

10.11686/cyxb2017048

http://cyxb.lzu.edu.cn

2017-02-16；改回日期：2017-04-19

甘肅省草原技術推廣總站項目，國家科技支撐計劃(2014BAD14B006)和教育部重大科技項目(313028)資助。

梁志婷(1990-)，女，甘肅蘭州人，在讀碩士。E-mail:liangzht15@lzu.edu.cn*通信作者Corresponding author. E-mail:wangxianzhi@lzu.edu.cn

梁志婷, 鄧建強, 王自奎, 沈禹穎, 王先之. 隴東旱塬區(qū)不同糧草輪作模式下土壤細菌群落組成特征. 草業(yè)學報, 2017, 26(8): 180-191.

LIANG Zhi-Ting, DENG Jian-Qiang, WANG Zi-Kui, SHEN Yu-Ying, WANG Xian-Zhi. Differences in soil bacterial community composition among three forage-crop rotations on the Longdong Loess Plateau. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(8): 180-191.