蘭州百合根及鱗莖水浸液自毒作用的研究

黃鈺芳，張恩和，張新慧，王惠珍，王琦，劉青林，石雨仟

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,寧夏 銀川 750004)

蘭州百合根及鱗莖水浸液自毒作用的研究

黃鈺芳1,2，張恩和1*，張新慧3，王惠珍2，王琦1，劉青林1，石雨仟1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅 蘭州 730000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,寧夏 銀川 750004)

為探討蘭州百合自毒效應(yīng)機(jī)制，明確百合根及鱗莖中主要自毒物質(zhì)，設(shè)置水(CK)、百合根及鱗莖水浸液10、50、100、150 mg/mL，共計9個處理，用于自毒作用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，采用分光光度法及滴定法測定百合幼苗中的生理生化指標(biāo)，利用GC-MS技術(shù)分析蘭州百合根及鱗莖中的主要自毒物質(zhì)。結(jié)果顯示，蘭州百合根及鱗莖水浸液對自身幼苗生長的影響總體上表現(xiàn)為抑制作用，且存在濃度效應(yīng)。隨著水浸液濃度的增加，SOD、POD、CAT三種酶活性先上升后下降，MDA含量和相對電導(dǎo)率變化趨勢則相反。濃度高于100 mg/mL時，脯氨酸及可溶性糖含量較對照顯著增加(P<0.05)。根及鱗莖氯仿萃取液中分別鑒定出23種、14種化合物，主要包括：2,3-二氫茚、萘、2,4-二叔丁基苯酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醛、月桂酸、丁香醛、肉豆蔻酸、苯基異氰酸酯、對苯二甲酸二辛酯，其中多數(shù)被報道為化感自毒物質(zhì)。蘭州百合根及鱗莖水浸液對其幼苗的生長具有明顯自毒效應(yīng)。自毒作用是導(dǎo)致蘭州百合連作障礙的重要原因之一。

蘭州百合；化感作用；GC-MS；化感物質(zhì)；生理生化

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolorsalisb)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)川百合的變種，為多年生鱗莖草本植物。由于獨(dú)特的土壤條件及成熟的栽培技術(shù)，蘭州百合鱗莖碩大，顏色潔白，口味甜美，具有豐富的營養(yǎng)價值，享有“蘭州百合甲天下”的美譽(yù)。然而，近年來，隨著市場需求的急劇增加，蘭州百合連作加重，導(dǎo)致百合產(chǎn)量下降，品質(zhì)劣化。因此，連作障礙已成為制約蘭州百合產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的瓶頸所在[1-2]。連作會加重自毒物質(zhì)在植物根際區(qū)的積聚，從而改變土壤微環(huán)境，植物殘體的代謝產(chǎn)物連同植物根系分泌的自毒物質(zhì)一起影響植株代謝，對植物生長造成嚴(yán)重影響，最終導(dǎo)致自毒作用的發(fā)生。研究表明，許多作物的連作障礙多與此有關(guān)[3]。因而，自毒物質(zhì)引發(fā)的自毒作用則是導(dǎo)致植物連作障礙的主要因子之一。自毒作用是植物通過根系分泌、殘體分解、地上淋溶等途徑釋放次生代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在周圍環(huán)境中不斷累積，從而對下茬同種植物的生長發(fā)育產(chǎn)生直接或間接的抑制作用[4]。自毒作用也是導(dǎo)致蘭州百合連作障礙的主要原因之一[1-2]。立足自毒作用研究作物連作障礙機(jī)制已成為許多學(xué)者研究的重要課題。目前，國內(nèi)外關(guān)于自毒作用的研究多集中在當(dāng)歸(Angelicasinensis)、黃瓜(Cucumissativus)、水稻(Oryzasativa)及甘草(Glycyrrhizauralensis)等植物[5-11]，對百合自毒作用的研究較少，對導(dǎo)致蘭州百合連作障礙的自毒效應(yīng)機(jī)制以及產(chǎn)生自毒效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)至今卻涉及甚少。因此，本試驗(yàn)以百合種球?yàn)槭茉噷ο?，研究百合植株地下部分即根、鱗莖水浸液對自身幼苗生長的影響；并通過對其幼苗生理生化特性的分析，初步闡明蘭州百合自毒作用機(jī)制；利用GC-MS分析技術(shù)，鑒定百合自毒成分，明確造成蘭州百合自毒效應(yīng)的主要物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2015年10月百合收獲期，在百合主產(chǎn)區(qū)蘭州市七里河區(qū)西果園鄉(xiāng)，選擇3年生(1個生長周期)百合種植地，采用5點(diǎn)取樣法隨機(jī)選取健康植株，挖取整株，分別收集根及鱗莖，蒸餾水沖洗干凈后，備用。受試對象為當(dāng)?shù)嘏嘤墒斓陌俸戏N球鱗莖。

1.2 根、鱗莖水浸液的制備

取新鮮的百合根及鱗莖各60 g，分別剪碎，置于燒杯中，加入200 mL蒸餾水，充分振蕩后浸泡24 h，浸提液于4000 r/min離心10 min，取上清液，減壓抽濾，濾液再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，得到濃度為300 mg/mL的浸提母液。將兩種母液分別用蒸餾水稀釋為10、50、100和150 mg/mL的溶液，于4 ℃的冰箱保存，用于百合自毒作用的生物學(xué)研究。

1.3 根、鱗莖水浸液自毒作用的生物活性測定

于10 cm×10 cm×5 cm的發(fā)芽盒中放入適量河沙，選擇包合緊密，基盤健康，大小均一的百合種球，消毒后(在濃度為3 mg/mL的高錳酸鉀溶液中滅菌10 min，再用無菌蒸餾水沖洗2～3次)均勻種植于發(fā)芽盒中，每盒植入9顆，分別準(zhǔn)確加入配制好的梯度提取液30 mL，每處理重復(fù)5次，對照加入等體積蒸餾水。之后，放置于25 ℃人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。期間，每3 d加入適量蒸餾水，保持沙粒濕潤，培養(yǎng)20 d后，測定各項(xiàng)指標(biāo)。

生物指標(biāo)的測定：將所有鱗莖的幼根、幼苗從種球結(jié)合部切下后分別用十萬分之一電子天平和直尺測定其重量和長度，并計算平均值。

化感作用效應(yīng)敏感指數(shù)(response index, RI)采用Williamson等[12]的方法計算：

式中：C為對照值；T為處理值。RI>0時表示促進(jìn)作用，RI<0時表示抑制作用，絕對值的大小代表化感作用強(qiáng)度。

綜合化感效應(yīng)(synthesis effect, SE)為苗長(seeding length, SL)、苗重(seeding weight, SW)、根長(root length, RL)及根重(root weight, RW)化感效應(yīng)指數(shù)的加和平均值。SE>0時表示促進(jìn)作用，SE<0時表示抑制作用，絕對值的大小代表綜合化感作用強(qiáng)度。

1.4 根、鱗莖水浸液自毒作用相關(guān)生理指標(biāo)的測定

將上述百合幼苗的葉片及根系分別保存于液氮中進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定。

1.4.1 保護(hù)酶系統(tǒng)相關(guān)酶活性的測定 過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)分別采用硫代硫酸鈉滴定法、愈創(chuàng)木酚法、氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法測定[13]。

1.4.2 滲透調(diào)節(jié)物及細(xì)胞膜透性相關(guān)指標(biāo)的測定 脯氨酸、可溶性糖、丙二醛(MDA)含量測定分別采用酸性茚三酮比色法、3,5-二硝基水楊酸(DNS)法、硫代巴比妥酸(TBA)法測定[13]；相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)率儀(DDS-307，上海雷磁)測定。

1.5 根、鱗莖水浸液中自毒物質(zhì)的檢測

分別稱取新鮮根、鱗莖500 g，剪碎，加適量蒸餾水浸泡24 h，期間多次振蕩。紗布過濾，濾液以4000 r/min離心10 min，取上清液，減壓抽濾，濾液加入等量體積氯仿萃取5次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000B，上海賢德)在4 ℃條件下減壓回收氯仿至0.5 mL，用于GC-MS分析。

GC-MS條件：HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)柱。進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫40 ℃。以5 ℃/min程序升溫至50 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min程序升溫至130 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min程序升溫至160 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min程序升溫至250 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min程序升溫至280 ℃，保持10 min，最后以10 ℃/min程序升溫至300 ℃。載氣：He，流量：1 mL/min，進(jìn)樣量為1.0 μL。電子轟擊源，轟擊電壓70 eV，掃描范圍M/Z 30-600AMU，掃描速度0.2 S掃全程，離子源230 ℃。

應(yīng)用NIST11.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫計算機(jī)檢索系統(tǒng)分析質(zhì)譜圖，進(jìn)行未知物的鑒定。

借鑒Jaccard相似系數(shù)公式，比較百合根與鱗莖中化合物的相似度。

式中：a為根中特有組分?jǐn)?shù)目；b為鱗莖中特有組分?jǐn)?shù)目；c為根和鱗莖中共有組分?jǐn)?shù)目(a、b所代表組分相對百分含量大于1%，c所代表兩個共有組分中至少有一個的相對百分含量大于1%)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2007軟件處理原始數(shù)據(jù)，通過SPSS 17.0軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，用新復(fù)極差法(Duncan)做顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根、鱗莖水浸液對自身幼苗生長的影響

由表1可知，百合根及鱗莖水浸液對自身幼苗的生長均產(chǎn)生自毒效應(yīng)。隨著水浸液濃度的升高，苗長、苗重、根重均逐漸下降，表現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)。濃度為10 mg/mL時，苗長、苗重、根重較對照下降均不明顯；濃度高于50 mg/mL時，3指標(biāo)均顯著下降(P<0.05)。與上述指標(biāo)相比，根長表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象，濃度為10 mg/mL時，促進(jìn)作用未達(dá)顯著水平；濃度高于100 mg/mL時，呈顯著的抑制作用(P<0.05)。

綜合化感效應(yīng)指數(shù)(SE)能夠全面衡量化感效應(yīng)強(qiáng)度。表1顯示，各濃度處理下SE值均為負(fù)值，說明百合根及鱗莖水浸液化感效應(yīng)總體上表現(xiàn)為抑制作用。濃度10～150 mg/mL，根、鱗莖水浸液的SE絕對值呈增加趨勢，說明隨著濃度的增加，二者的抑制作用逐漸加強(qiáng)。同一濃度下，根系水浸液的SE絕對值均高于鱗莖，表明百合根水浸液的自毒效應(yīng)均強(qiáng)于鱗莖。

不同生物指標(biāo)對百合根及鱗莖水浸液的敏感程度存在差異。同一濃度下各指標(biāo)對根水浸液總體敏感程度為：根長>苗長，根重>苗重；對鱗莖水浸液的敏感程度為：根重>苗重。綜合分析可以看出，百合幼根受到兩種水浸液的影響程度較幼葉為大。

表1 百合根及鱗莖水浸液對自身幼苗生長的影響

注：表中數(shù)值為平均值±SD(n=3)，同一供體部位不同濃度間，數(shù)值后的不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note： Data are value±SD, different letters mean the significant differences of the same donor site among different concentrations at 0.05 level, the same below.

2.2 根、鱗莖水浸液對自身幼苗生理生化的影響

圖1 根、鱗莖水浸液對CAT活性的影響Fig.1 Effect of root, bulb water extracts on CAT activity 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。The different small letters mean the significant differences at P<0.05, the same below.

2.2.1 根、鱗莖水浸液對抗氧化酶活性的影響 由圖1、2、3顯示，隨著水浸液濃度的增大，百合幼苗CAT、POD、SOD活性均呈先升高后降低的趨勢，并且隨著濃度的不同，根、鱗莖水浸液對以上3種酶活性的影響程度存在差異。濃度為10 mg/mL時，CAT、POD、SOD活性均顯著升高(P<0.05)；濃度提高至50 mg/mL時，各種酶活性均有所下降，其中僅SOD較對照下降顯著(P<0.05)；濃度提高至150 mg/mL時，3種酶活性均顯著降低(P<0.05)。其中，根浸液中CAT、POD、SOD活性較對照分別降低78.24%、26.36%及56.71%，鱗莖水浸液中3種酶活性分別降低64.43%、20.61%及51.94%。從以上數(shù)據(jù)可以看出，根水浸液對3種酶活性的抑制程度均大于鱗莖水浸液。

2.2.2 根、鱗莖水浸液對滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響 圖4、圖5顯示，根及鱗莖水浸液對脯氨酸及可溶性糖含量的影響均存在一定的差異。濃度10～150 mg/mL，根水浸液中脯氨酸含量較對照持續(xù)增加8.20%～204.27%，而鱗莖水浸液中其含量降低34.40%后僅上升了3.64%。隨著濃度的增大，根和鱗莖水浸液中可溶性糖的含量均先下降后上升。濃度為100和150 mg/mL時，根水浸液中可溶性糖含量提高了33.33%和58.33%，較對照差異顯著(P<0.05)，而鱗莖水浸液在各濃度下，可溶性糖含量與對照差異均不明顯。

2.2.3 根、鱗莖水浸液對細(xì)胞膜透性的影響 圖6、圖7顯示，隨著濃度的升高，根、鱗莖水浸液中MDA含量、電導(dǎo)率均先下降后上升。濃度為10 mg/mL時，根、鱗莖水浸液中MDA含量分別下降59.29%和79.29%，電導(dǎo)率分別下降22.83%和18.06%，較對照差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。濃度為100和150 mg/mL，根、鱗莖水浸液中MDA含量分別增加146.57%和147.14%、100.00%和135.00%，電導(dǎo)率分別提高29.03%和68.96%、17.41%和39.07%，較對照差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。

圖2 根、鱗莖水浸液對POD活性的影響Fig.2 Effect of root, bulb water extracts on POD activity

圖3 根、鱗莖水浸液對SOD活性的影響Fig.3 Effect of root, bulb water extracts on SOD activity

圖4 根、鱗莖水浸液對脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of water extracts from root and bulb on proline content

圖5 根、鱗莖水浸液對可溶性糖含量的影響Fig.5 Effect of water extracts of root and bulb on soluble sugar content

圖6 根、鱗莖水浸液對MDA含量的影響Fig.6 Effect of water extracts of root and bulb on MDA content

圖7 根、鱗莖水浸液對相對電導(dǎo)率的影響Fig.7 Effect of water extracts of root and bulb on relative electrical conductivity

2.3 根、鱗莖水浸液中自毒物質(zhì)的檢測

采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀(GC-MS)分析百合根、鱗莖水浸液氯仿萃取相中潛在的化感自毒物質(zhì)。結(jié)果(表2，圖8)發(fā)現(xiàn)，百合根中存在23種化合物，主要包括：2,3-二氫茚、萘、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醛、月桂酸、丁香醛、肉豆蔻酸、鄰苯二甲酸二異丁酯及對苯二甲酸二辛酯。鱗莖中共鑒定出14種化合物(表3，圖9)，主要包括：苯基異氰酸酯、2,4-二叔丁基苯酚、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯及對苯二甲酸二辛酯。表2、表3中列出的化感物質(zhì)均屬GC-MS分析匹配度大于90%的化合物。

計算根和鱗莖中相對含量大于1%組分的相似系數(shù)。結(jié)果顯示，氯仿萃取液中二者的相似系數(shù)為25%，可見，百合根與鱗莖氯仿萃取液中所含的化合物差異性較大。前者含量大于5%的組分共6種，其中2種為特有組分；后者含量大于5%的組分共7種，特有組分為4種。二者相對含量最大的組分一致，均為對苯二甲酸二辛酯。

表2 根水浸液氯仿萃取液GC-MS分析

圖8 根氯仿萃取液GC-MS色譜圖Fig.8 GC-MS chromatogram of root chloroform extraction

表3 鱗莖水浸液氯仿萃取液GC-MS分析

圖9 鱗莖氯仿萃取液GC-MS色譜圖Fig.9 GC-MS chromatogram of bulb chloroform extraction

3 討論與結(jié)論

3.1 百合根、鱗莖水浸液的自毒作用

生物活性測定試驗(yàn)表明，百合根及鱗莖水浸液對自身幼苗的生長存在一定的影響。研究顯示，當(dāng)水浸液濃度達(dá)到某一臨界濃度時，才能產(chǎn)生化感自毒作用，低于該濃度，不會產(chǎn)生抑制效應(yīng)，甚至具有促進(jìn)作用。周秀梅等[14]研究發(fā)現(xiàn)，木香薷(Elsholtziastauntonii)莖和花序水浸液對其種子萌發(fā)表現(xiàn)出“低促高抑”的濃度梯度效應(yīng)。袁莉等[15]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同濃度的苜蓿(Medicagosativa)浸提液對其種子萌發(fā)有不同程度地抑制或者促進(jìn)效應(yīng)，隨著提取液濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)，濃度降低，抑制作用減弱甚至消失，表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象。但本試驗(yàn)綜合化感效應(yīng)指數(shù)分析顯示，百合根及鱗莖水浸液化感效應(yīng)總體上表現(xiàn)為抑制作用，且抑制程度隨水浸液濃度的提高而增強(qiáng)，存在濃度梯度效應(yīng)，這與胡遠(yuǎn)彬等[16]對黃芪(Astragalusstrictus)、黃玉茜等[17]對花生(Arachishypogaea)自毒作用的研究結(jié)果相同。由此可見，不同作物甚至同作物不同部位水浸液對其種子的萌發(fā)和幼苗生長表現(xiàn)出不同的自毒作用規(guī)律，這可能與研究者采用的研究方法、取樣時間及研究對象的差異有關(guān)。但可以確定的是，隨著供體水浸液濃度的提高，對其種子萌發(fā)及幼苗生長確實(shí)存在顯著的自毒作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，百合根及鱗莖不同部位水浸液對其幼苗生長的影響存在差異性。與鱗莖水浸液相比，根浸液對其幼苗生長的抑制作用更為明顯。周凱等[18]的研究顯示，菊花(Dendranthemamorifolium)的自毒作用同樣存在部位差異。其中，葉與枯落物水浸液的抑制作用最強(qiáng)，而根的抑制作用較弱。銀福軍等[19]在研究黃連(Coptischinensis)的自毒作用時發(fā)現(xiàn)，其不同部位自毒作用順序?yàn)椋焊o浸提液>須根浸提液。羅小勇等[20]研究發(fā)現(xiàn)23種紫花苜蓿各器官對小麥(Triticumaestivum)幼苗生長的抑制作用以根的活性最高，葉次之，莖最低。由此可見，不同作物及作物的不同部位之間，其自毒作用程度存在一定的差別。而外在的表現(xiàn)作用是由內(nèi)在的物質(zhì)成分所主導(dǎo)。故推測，這一差別可能是由于不同部位含有的自毒成分種類和數(shù)量之間的差異所導(dǎo)致的。

本研究還發(fā)現(xiàn)，不同生物指標(biāo)對根、鱗莖水浸液的敏感程度有所不同。張新慧等[21]在研究蒙古黃芪自毒試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，種子胚根長度對根浸液的敏感程度大于胚芽長度。本研究結(jié)果顯示，百合根及鱗莖水浸液對其幼根的抑制程度大于幼苗，證實(shí)所測定指標(biāo)對根浸液的敏感程度存在一定的差異。植物在生長過程中，其根系與土壤接觸最為緊密，土壤中的各種化學(xué)物質(zhì)只能通過根的吸收和傳導(dǎo)才能輸送到其它器官，所以根是化感物質(zhì)作用的首要位點(diǎn)，從而受到的影響程度也最大。

3.2 百合自毒作用機(jī)制的探討

SOD、POD、CAT等保護(hù)酶系統(tǒng)能夠清除植物細(xì)胞中產(chǎn)生的活性氧，防止膜脂過氧化，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[22]。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物，其含量的高低能夠反映質(zhì)膜受傷害的嚴(yán)重程度[23]。相對電導(dǎo)率(%)則是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)[24]。王才斌等[25]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，連作脅迫能夠顯著降低花生葉片中SOD、POD及CAT活性，一方面增加MDA含量，抑制蛋白質(zhì)合成，從而引起花生生育障礙；另一方面可導(dǎo)致膜透性的增加，造成電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大。本試驗(yàn)研究顯示，當(dāng)水浸液濃度為10 mg/mL時，SOD、POD、CAT三種酶活性較對照均顯著上升(P<0.05)，MDA含量明顯下降(P<0.05)，相對電導(dǎo)率顯著降低(P<0.05)，表明低濃度水浸液誘導(dǎo)了3種酶的抗氧化能力，促使酶活性增強(qiáng)，維持了質(zhì)膜的完整性，降低MDA含量，從而減少電解質(zhì)的外滲，相對電導(dǎo)率降低。當(dāng)濃度大于100 mg/mL時，逆境脅迫超出了3種酶的防御值，抑制了酶活性，致使膜透性增大，MDA含量上升，電解質(zhì)外滲，電導(dǎo)率增大。這與吳榕等[26]的研究結(jié)果相類似，正是上述生理代謝方面的改變導(dǎo)致了百合幼苗形態(tài)上的改變，也是百合根及鱗莖水浸液產(chǎn)生自毒效應(yīng)的內(nèi)在生理機(jī)制之一。

逆境環(huán)境中，植物細(xì)胞會積累可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透勢、維持水分平衡及細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)[27]。本研究結(jié)果顯示，低濃度時，根浸液對其幼苗葉片中脯氨酸及可溶性糖含量的影響較??；當(dāng)濃度高于100 mg/mL時，二者含量顯著增加(P<0.05)，這可能是百合幼苗為適應(yīng)自毒物質(zhì)脅迫而增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，提高細(xì)胞滲透勢，以維持細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)，是百合幼苗對自毒物質(zhì)的相關(guān)生理反應(yīng)。對于鱗莖水提液，任何濃度下，其脯氨酸及可溶性糖含量均沒有顯著變化，這一結(jié)果可能與根浸液的抑制效應(yīng)強(qiáng)而鱗莖水提液的抑制作用弱有關(guān)系。

3.3 百合根、鱗莖中自毒成分的比較

Rice[28]將化感物質(zhì)分為14類，主要為次生代謝物質(zhì)。程智慧等[29]從西伯利亞百合根系分泌物氯仿組分中鑒定出20種化合物。其中，含量最高為鄰苯二甲酸二異辛酯。本試驗(yàn)從蘭州百合根及鱗莖氯仿萃取液中分別鑒定出23種、14種化合物，主要包括：2,3-二氫茚、萘、2,4-二叔丁基苯酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醛、月桂酸、丁香醛、肉豆蔻酸、苯基異氰酸酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、對苯二甲酸二辛酯。其中，含量最大者為對苯二甲酸二辛酯。除乙烯基愈創(chuàng)木酚和苯基異氰酸酯罕見報道外，其余成分與其他研究結(jié)果相類似[30]。上述成分是否均具有自毒效應(yīng)，還需要進(jìn)一步做單體成分的生物活性研究。蘭州百合與西伯利亞百合的種雖不同，但其中含量最大的化合物均為酯類。但化合物含量與自毒效應(yīng)是否呈正相關(guān)，這一點(diǎn)卻需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。再者，本結(jié)果中未列出烷烴類物質(zhì)，因?yàn)槔肎C-MS技術(shù)作其他任何定性研究時，均發(fā)現(xiàn)大量烷烴類化合物，故研究者認(rèn)為此類物質(zhì)多為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物在質(zhì)譜儀中斷裂生成，而不完全歸屬于化感自毒成分。

本試驗(yàn)還比較了百合根與鱗莖中自毒成分的相似度，結(jié)果為25%，說明百合根與鱗莖所含自毒物成分的種類差異性較大。同時，該結(jié)論也證實(shí)了上述研究結(jié)果，即植株的不同部位含有不同種類的化學(xué)成分，在內(nèi)影響植物生理生化反應(yīng)，在外表現(xiàn)出自毒作用的差異。對于不同的自毒物質(zhì)，其作用方式的差別以及自毒物質(zhì)種類與數(shù)量之間的交叉作用還有待于進(jìn)一步探索。

3.4 自毒作用與連作障礙

植物自毒是化感作用的重要表現(xiàn)形式，也是連作障礙的重要因素之一[31]。銀福軍等[19]研究表明，黃連根莖、須根、根際土及殘體腐解液均對黃連種子發(fā)芽、幼苗生長及成株發(fā)育具有影響，黃連連種兩年即可見其自毒作用。王田濤等[32]研究表明，當(dāng)歸具有較強(qiáng)的自毒作用，并且自毒作用隨濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)歸的自毒作用是造成連作障礙的原因之一。劉蘋等[33]研究發(fā)現(xiàn)，花生連作土壤中豆蔻酸、軟脂酸和硬脂酸的累積與花生的連作障礙有著密切關(guān)系。本研究表明，連作模式下，百合根及鱗莖產(chǎn)生的各種次生代謝物能夠增加百合幼葉離子的滲透量，誘導(dǎo)類脂的過氧化作用，抑制抗氧化酶的活性，破壞細(xì)胞膜的完整性，從而對百合幼苗的生長產(chǎn)生抑制作用。該研究結(jié)果可以證實(shí)，自毒作用是導(dǎo)致蘭州百合連作障礙的重要原因之一。

References：

[1] Liang X D. The mechanism and preventive measures of continuous cropping obstacle in Lanzhou lily. Journal of Agricultural Science and Technology and Information, 2012, 19: 19-20. 梁旭東. 蘭州百合連作障礙發(fā)生機(jī)理及其防治措施. 植物保護(hù), 2012, 19: 19-20.

[2] Chai Z B, Liang Q L, Zhang H,etal. Effects of continuous cropping technique on planting of Lanzhou lily and control measures. Journal of Agricultural Science and Technology and Information, 2015, 6: 9-11. 柴宗兵, 梁巧蘭, 張虎, 等. 連作技術(shù)對蘭州百合種植的影響及控制措施. 農(nóng)業(yè)科技與信息, 2015, 6: 9-11.

[3] Qiu L Y, Qi Y C, Wang M D,etal. Relationship between secondary metabolite autotoxic to plant and continuous cropping obstacles. Soils, 2010, 42(1): 1-7. 邱立友, 戚元成, 王明道, 等. 植物次生代謝物的自毒作用及其與連作障礙的關(guān)系. 土壤, 2010, 42(1): 1-7.

[4] Bao H C, Hao L Z, Zhang F L,etal. Autotoxicity of aquatic extracts from different parts ofPugioniumcornutum(L.) Gaertn. Chinese Journal of Grassland, 2016, 38(2): 103-110. 鮑紅春, 郝麗珍, 張鳳蘭, 等. 沙芥不同部位水浸液自毒作用研究. 中國草地學(xué)報, 2016, 38(2): 103-110.

[5] Zhang X H, Zhang E H, Fu X Y,etal. Autotoxic effects ofAngelicasinensis(Oliv.) Diels. Allelopathy Journal, 2010, 26(1): 1-12.

[6] Zhang X H, Zhang E H, Lang D Y. Autotoxic compounds from rhizosphere soil ofHumuluslupulusL. extracts: identification and biological activity. Agronomy Journal, 2011, 103(3): 695-701.

[7] Sun S S, Gong B, Wen D,etal. Effect of exogenous melatonin on physiological and biochemical characteristics of cucumber radicles under p-hydroxybenzoic acid. Chinese Journal of Applied Ecology, 2016, 27(3): 897-903. 孫莎莎, 鞏彪, 溫丹, 等. 對羥基苯甲酸脅迫下褪黑素對黃瓜胚根生理生化特性的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2016, 27(3): 897-903.

[8] Lin W X. Rhizobiological properties of allelopathic rice in suppression of weeds and its research prospect. Acta Agronomica Sinica, 2013, 39(6): 951-960. 林文雄. 化感水稻抑草作用的根際生物學(xué)特性與研究展望. 作物學(xué)報, 2013, 39(6): 951-960.

[9] Zhang D D, Liang X H, Wang J. Effect of aqueous extracts fromGlycyrrhizauralensisFisch. seeds on its seed germination and genes relative expression ofGuSQS1 andGubAS. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2016, 30(1): 28-34. 張豆豆, 梁新華, 王俊. 甘草種子水浸液對其種子萌發(fā)及GuSQS1和GubAS基因表達(dá)的影響. 核農(nóng)學(xué)報, 2016, 30(1): 28-34.

[10] Wu F Z, Ling M, Cao P,etal. Effects of wheat root exudates on cucumber growth and soil fungal community structure. Chinese Journal of Applied Ecology, 2014, 25(10): 2861-2867. 吳鳳芝, 李敏, 曹鵬, 等. 小麥根系分泌物對黃瓜生長及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2014, 25(10): 2861-2867.

[11] Xu N, Wang C, Wei M,etal. Allelopathy of welsh onion root exudates on cucumber seed germination andFusariumoxysporumf. sp.cucumerinumand the GC-MS analysis. Acta Horticulturae Sinica, 2012, 39(8): 1511-1520. 徐寧, 王超, 魏珉, 等. 大蔥根系分泌物對黃瓜種子萌芽和枯萎病病原菌的化感作用及其GC-MS分析. 園藝學(xué)報, 2012, 39(8): 1511-1520.

[12] Williamson G B, Richardson D. Bioassays for allelopathy: measuring treatment responses with independent controls. Journal of Chemical Ecology, 1988, 14: 181-187.

[13] He K Y, Ling G R. Biochemistry Experiments (Bilingual)[M]. Beijing: Science Press, 2013: 193-198. 何開躍, 李關(guān)榮. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)(雙語)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2013: 193-198.

[14] Zhou X M, Wang Y J, Li B Y,etal. Self-allelopathy effect of water extracts ofElsholtziastauntoniion its seed germination. Northern Horticulture, 2016, (15): 62-66. 周秀梅, 王玉杰, 李保印, 等. 木香薷水浸液對其種子萌發(fā)的自化感效應(yīng). 北方園藝, 2016, (15): 62-66.

[15] Yuan L, Lu W H, Yu L. Autotoxicity of aqueous extracts from different parts of alfalfa at early stage on seed germination. Chinese Journal of Grassland, 2007, 29(5): 111-114. 袁莉, 魯為華, 于磊. 紫花苜蓿生長前期各部位提取液對種子萌發(fā)的自毒作用. 中國草地學(xué)報, 2007, 29(5): 111-114.

[16] Hu Y B, Chen J, Xiao T H,etal. Research on allelopathy of aqueous extract fromAstragalusstrictus. Acta Prataculturae Sinica, 2013, 22(6): 136-142. 胡遠(yuǎn)彬, 陳俊, 肖天昊, 等. 勁直黃芪水浸提液化感作用研究. 草業(yè)學(xué)報, 2013, 22(6): 136-142.

[17] Huang Y Q, Han L S, Yang J F,etal. Autotoxicity of aqueous extracts from plant, soil of peanut and identification of autotoxic substances in rhizospheric soil. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(19): 6023-6032. 黃玉茜, 韓立思, 楊勁峰, 等. 花生植株和土壤水浸液自毒作用研究及土壤中自毒物質(zhì)檢測. 生態(tài)學(xué)報, 2012, 32(19): 6023-6032.

[18] Zhou K, Guo W M, Wang Z F,etal. Autotoxicity of aqueous extracts from different parts ofChrysanthemum. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2008, 28(4): 759-764. 周凱, 郭維明, 王智芳, 等. 菊花不同部位水浸液自毒作用的研究. 西北植物學(xué)報, 2008, 28(4): 759-764.

[19] Yin F J, Zhai X Y, Zeng W,etal. Study on the autotoxicity of aqueous extracts from different parts ofCoptischinensis. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2009, 32(3): 329-330. 銀福軍, 瞿顯友, 曾緯, 等. 黃連不同部位水浸液自毒作用研究. 中藥材, 2009, 32(3): 329-330.

[20] Luo X Y, Sun J. A study on allelopathic activities of different organs of 23 alfalfa species. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(2): 83-91. 羅小勇, 孫娟. 23種紫花苜蓿不同品種及器官間化感活性差異的研究. 草業(yè)學(xué)報, 2012, 21(2): 83-91.

[21] Zhang X H, Lang D Y, Chen J,etal. Autotoxicity of aqueous extracts from plant of cultivatedAstragalusmembranaceusvar. Mongholicus. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2014, 37(2): 187-191. 張新慧, 郎多勇, 陳靖, 等. 蒙古黃芪植株水浸液的自毒作用研究. 中藥材, 2014, 37(2): 187-191.

[22] Liu C, Chen X D, Wu M,etal. Allelopathic effect ofPhragmitescommunisleaves on the growth and physiobiochemical characteristic ofSolidagocanadensis. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(3): 182-190. 劉成, 陳曉德, 吳明, 等. 蘆葦葉片化感作用對加拿大一枝黃花生長及生理生化特性的影響. 草業(yè)學(xué)報, 2014, 23(3): 182-190.

[23] Chen S L, Zhou B L, Lin S S,etal. Effects of cinnamic acid and vanillin on grafted eggplant root growth and physiological characteristics. Chinese Journal of Applied Ecology, 2010, 21(6): 1446-1452. 陳紹莉, 周寶利, 藺姍姍, 等. 肉桂酸和香草醛對嫁接茄子根系生長及生理特性的影響. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2010, 21(6): 1446-1452.

[24] Hou Y X, Zhou B L, Wu X L. Allelopathy of root exudates of pepper. Journal of Shenyang Agricultural University, 2007, 38(4): 504-507. 侯永俠, 周寶利, 吳曉玲. 辣椒根系分泌物化感作用的研究. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 38(4): 504-507.

[25] Wang C B, Wu Z F, Cheng B,etal. Effects of continuous cropping on photosynthetic characteristics and reactive oxygen metabolism of peanut. Acta Agronomica Sinica, 2007, 33(8): 1304-1309. 王才斌, 吳正鋒, 成波, 等. 連作對花生光合特性和活性氧代謝的影響. 作物學(xué)報, 2007, 33(8): 1304-1309.

[26] Wu R, Chen Y J, Zhang L,etal. Effects of white clover plant aqueous extracts on germination, seeding growth and physiological metabolism of Dandelion. Acta Agrestia Sinica, 2014, 22(2): 334-338. 吳榕, 陳雅君, 張璐, 等. 白三葉浸提液對蒲公英細(xì)胞膜透性及相關(guān)生理指標(biāo)的影響. 草地學(xué)報, 2014, 22(2): 334-338.

[27] Yang Y J, Wang X W, Zhao K. Effects of phthalic acid on seed germination, membrane lipid peroxidation and osmoregulation substance of radish seedlings. Acta Ecologica Sinica, 2013, 33(19): 6074-6080. 楊延杰, 王曉偉, 趙康. 鄰苯二甲酸對蘿卜種子萌發(fā)、幼苗葉片膜脂過氧化及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響. 生態(tài)學(xué)報, 2013, 33(19): 6074-6080.

[28] Rice E L. Allelopathy[M]. Orlando, F L: Acadamic Press, 1984.

[29] Cheng Z H, Xu P. GC-MS identification of chemicals in lily root exudates. Journal of Northwest A & F University: Natural Science Edition, 2012, 40(9): 203-208. 程智慧, 徐鵬. 百合根系分泌物的GC-MS鑒定. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2012, 40(9): 203-208.

[30] Zhang W M, Qiu H Z, Zhang C H,etal. Identification and autotoxicity of root exudates of continuous cropping potato at different growth stages. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2015, 23(2): 215-224. 張文明, 邱慧珍, 張春紅, 等. 連作馬鈴薯不同生育期根系分泌物的成分檢測及其自毒效應(yīng). 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2015, 23(2): 215-224.

[31] Zhang Z Y, Niu M M, Chen T,etal. The effect of different pretreament on the germination of polygala seeds. Modern Chinese Medicine, 2011, 22(6): 136-142. 張重義, 牛苗苗, 陳婷, 等. 藥用植物化感自毒作用研究對栽培技術(shù)創(chuàng)新的啟示. 中國現(xiàn)代中藥, 2011, 22(6): 136-142.

[32] Wang T T, Wang Q, Wang H Z,etal. Autotoxicity ofAngelicasinensisand allelopathy on tested plant. Acta Agrestia Sinica, 2012, 20(6): 1132-1138. 王田濤, 王琦, 王惠珍, 等. 當(dāng)歸自毒作用和其對不同作物的化感效應(yīng). 草地學(xué)報, 2012, 20(6): 1132-1138.

[33] Liu P, Zhao H J, Zhong Z W,etal. The effects of three root exudated fatty acids on peanut (ArachishypogaeaL.) growth and soil enzymes activities. Acta Ecologica Sinica, 2013, 33(11): 3332-3339. 劉蘋, 趙海軍, 仲子文, 等. 三種根系分泌脂肪酸對花生生長和土壤酶活性的影響. 生態(tài)學(xué)報, 2013, 33(11): 3332-3339.

Autotoxicity of water extracts of the root and bulb ofLiliumdavidiivar.unicolorsalisb

HUANG Yu-Fang1,2, ZHANG En-He1*, ZHANG Xin-Hui3, WANG Hui-Zhen2, WANG Qi1, LIU Qing-Lin1, SHI Yu-Qian1

1.AgronomyCollege,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.GansuUniversityofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,China; 3.CollegeofPharmacy,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

Autotoxicity is one of the main problems in the continuous cropping of Lanzhou lily. The aim of this study was to determine the mechanism of the autotoxic effect of Lanzhou lily and identify the organic compounds responsible for its autotoxicity. Water extracts of the root and bulb were applied to young lily plants at different concentrations (10, 50, 100, and 150 mg/mL) to test their effects on early development. Spectrophotometry and titration methods were used to measure various physiological indexes in the seedlings, and gas chromatography-mass spectrometry was used to identify compounds in the extracts. The extracts inhibited seedling growth in a concentration-dependent manner. As the concentrations of the extracts increased, the activities of superoxide dismutase, peroxidase, and catalase first increased and then decreased, and the malondialdehyde content and relative conductivity decreased. The contents of proline and soluble sugars increased significantly when the extracts were applied at concentrations greater than 100 mg/mL. Twenty-three and 14 compounds were identified in chloroform extracts of the root and bulb, respectively, including indane, naphthalene, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol, 2-methoxy-4-vinylphenol, vanillin, dodecanoic acid, 4-hydroxy-3, 5-dimethoxy-benzaldehyde, tetradecanoic acid, phenyl isocyanate, 1, 4-benzenedicarboxylic acid, and bis(2-ethylhexyl) ester. Most of the identified substances are known to be allelopathic. These results showed that water extracts of the root and bulb of Lanzhou lily showed autotoxic effects on lily seedling growth.

Liliumdavidiivar.unicolorsalisb; allelopathy; GC-MS; allelochemicals; physiology and biochemistry

10.11686/cyxb2016411

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-11-02；改回日期：2017-01-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31560380)資助。

黃鈺芳(1977-)，女，甘肅隴南人，講師，在讀博士。E-mail: 1049395950@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: zhangeh@gsau.edu.cn

黃鈺芳, 張恩和, 張新慧, 王惠珍, 王琦, 劉青林, 石雨仟. 蘭州百合根及鱗莖水浸液自毒作用的研究. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(8): 93-103.

HUANG Yu-Fang, ZHANG En-He, ZHANG Xin-Hui, WANG Hui-Zhen, WANG Qi, LIU Qing-Lin, SHI Yu-Qian. Autotoxicity of water extracts of the root and bulb ofLiliumdavidiivar.unicolorsalisb. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(8): 93-103.