響應(yīng)面優(yōu)化龍膽多糖的提取工藝及抗氧化性研究

宮江寧，韋元凈，楊子藝

（貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550001）

響應(yīng)面優(yōu)化龍膽多糖的提取工藝及抗氧化性研究

宮江寧，韋元凈，楊子藝

（貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550001）

該研究優(yōu)化了龍膽草多糖的提取工藝，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行了評價(jià)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇醇沉濃度，提取溫度，提取時(shí)間，液料比為考察因素，以龍膽草多糖提取率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行四因素三水平設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面法來優(yōu)化龍膽草多糖的提取工藝。并評價(jià)龍膽草多糖清除DPPH·﹑ABTS+·﹑OH·﹑O2-·作用以及總還原能力。結(jié)果表明，龍膽草多糖的最佳提取工藝為醇沉體積分?jǐn)?shù)為90%，提取時(shí)間為2 h，液料比為26∶1（m L∶g），提取溫度為75℃；龍膽草多糖的實(shí)際提取率為（5.89±0.25）%，與預(yù)測值相比，偏差較小。龍膽草多糖有一定的抗氧化活性，但活性均小于同濃度的維生素C。

龍膽草；多糖；響應(yīng)面試驗(yàn)；抗氧化活性

龍膽草（Gentianascabra Bunge）屬于多年生草本植物，又名龍膽﹑地膽草或草龍膽，是龍膽科植物（如條葉龍膽、三花龍膽﹑龍膽或堅(jiān)龍膽）的干燥的根和莖[1-2]。龍膽草有清熱利膽、殺菌、消炎、健胃、保肝等功效[2-4]，常作苦味健胃藥[5]。在臨床上有很多應(yīng)用，如治療黃疸型肝炎及慢性膽囊炎、高血壓、急性腎盂腎炎、皮膚病、咽炎、慢性支氣管炎、上呼吸道感染急性角膜炎等[6-8]。

龍膽草中含有多種化學(xué)成分（如環(huán)烯醚萜、裂環(huán)烯醚萜、苷類、生物堿、黃酮、汕酮、多糖等[2]）。其中多糖為龍膽草的有效成分之一，研究發(fā)現(xiàn)植物多糖一般對人體無害，并有抗病毒、抗氧化、降血脂、降血糖、抗衰老、抗凝血、提高免疫力和抗腫瘤的效果[4]，此外龍膽多糖還具有增效減毒的雙重作用[9]。

本研究采用單因素試驗(yàn)和中心復(fù)合試驗(yàn)，考察醇沉體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比對多糖提取率的影響，優(yōu)化龍膽草多糖的水提工藝，并采用維生素C作為陽性對照，考察龍膽草多糖總還原能力以及清除1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）等自由基的能力，以期為龍膽草這一傳統(tǒng)中藥進(jìn)一步開發(fā)利用和龍膽草多糖的生物活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍膽草購于貴州濟(jì)仁堂，產(chǎn)地為貴州。氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonateacid），ABTS）：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、FZ102型微型植物粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；A200S型電子天平：德國賽多利斯集團(tuán)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 龍膽多糖提取工藝流程

原料的預(yù)處理：將龍膽草用去離子水洗凈，50℃干燥，粉碎后用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇80℃回流2 h，以脫除油脂、色素、單糖、小分子物質(zhì)和低聚糖，過濾，將濾渣揮干乙醇后再置于50℃的烘箱中徹底干燥后，密封保存。

多糖的提?。悍Q取10 g龍膽草粉末，加入一定比例的去離子水，置于一定溫度的水浴鍋中提取一定時(shí)間后，先用藥篩過濾，再減壓過濾，所得濾液減壓濃縮至原體積的1/5，加入一定體積的乙醇，放于冰箱中沉淀24 h。過濾，然后依次用無水乙醇、丙酮清洗沉淀，將沉淀放入干燥器中自然干燥，得到龍膽草水提粗多糖[3]。

1.3.2 多糖提取率的計(jì)算

按照1.3.1中的方法，改變提取條件，進(jìn)行單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，得到干燥的龍膽草粗多糖，放于分析天平上稱量，均按照下式計(jì)算多糖提取率。

1.3.3 龍膽多糖提取條件的單因素試驗(yàn)

按照1.3.1的提取流程，分別考察不同的提取時(shí)間（1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h）、提取溫度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃），液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）（m L∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%、90%）對多糖提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取提取醇沉體積分?jǐn)?shù)（X1）、提取時(shí)間（X2）、液料比（X3）、提取溫度（X4）4個(gè)因素，以龍膽多糖的提取率為響應(yīng)值，采用4因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對龍膽草多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experim ents

1.3.5 龍膽草多糖的抗氧化活性

配制一定濃度的龍膽草多糖溶液，分別用比色法[10-13]檢測多糖對DPPH·和ABTS+·的清除能力，采用水楊酸法[14]和鄰苯三酚法[15-17]檢測多糖對OH·和O2-·的清除能力，普魯士藍(lán)法[18]檢測多糖的總還原能力。同時(shí)采用VC溶液做陽性對照，比較兩種物質(zhì)的抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

龍膽草多糖的提取時(shí)間、溫度、液料比、醇沉體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率的影響的單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、液料比（C）、醇沉體積分?jǐn)?shù)（D）對龍膽多糖提取率的影響Fig.1 Effects of extraction time(A),extraction tem perature(B), liquid-solid(C)ratio and alcoholprecipitation concentration (D)on extraction rate of Gentian polysaccharide

由圖1A可知，龍膽草多糖提取率隨著提取時(shí)間的增大，呈現(xiàn)增大的趨勢，但當(dāng)提取時(shí)間大于2 h后，提取率的增長幅度趨于平緩。考慮到提取時(shí)間過長，浪費(fèi)能源，且如果提取時(shí)間過長，其它成分的溶出量也可能增加，影響到下一步提取分離的難度。所以選擇最佳提取時(shí)間為2 h。

從圖1B可知，在50～70℃范圍內(nèi)，當(dāng)提取溫度升高，多糖提取率提高，但當(dāng)提取溫度高于70℃時(shí)，提取率反而略有下降。這有可能是提取溫度過高，會導(dǎo)致多糖氧化或使多糖發(fā)生部分水解。所以提取溫度不能過高，在此選擇70℃為最佳提取溫度。

由圖1C可知，液料比對龍膽草多糖提取率的影響較大。當(dāng)液料比增大，龍膽草多糖的提取率也隨之增大。液料比為10∶1（m L∶g）時(shí)，提取率只有1%，而當(dāng)液料比＞30∶1（m L∶g）時(shí)，提取率就有3.89%。且當(dāng)液料比＞25∶1（m L∶g）時(shí)，提取率增大的幅度趨于平緩?？紤]到液料比太大，會增加后續(xù)的濃縮工作量，浪費(fèi)時(shí)間和能源，所以選擇25∶1（m L∶g）為適宜的液料比。

由圖1D可知，醇沉體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響也很大，隨著醇沉體積分?jǐn)?shù)的增大，提取率顯著增加。當(dāng)醇沉體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，提取率只有1%，而當(dāng)醇沉體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，提取率有5.6%。當(dāng)醇沉體積分?jǐn)?shù)＞80%以后，提取率增大的幅度不大?？紤]到醇沉體積分?jǐn)?shù)過大，加入的乙醇過多，增大成本，所以選80%為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果及方差分析

以多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立二次響應(yīng)面回歸方程為：Y=3.6+1.93X1+0.24X2+0.21X3+0.60X4+0.15X1X2-

由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，不顯著，說明該模型成立。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.992 5，校正相關(guān)系數(shù)0，R2和R均較高且接近，說明模型準(zhǔn)確性和通用性較高；變異系數(shù)（coefficientof variation，CV）值為6.01%＜10%，說明試驗(yàn)的可信度與精確度高，擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)操作可行，可以用此模型來預(yù)測龍膽草多糖最佳提取工藝。

該回歸模型中的一次項(xiàng)X1、X2、X3、X4，交互項(xiàng)X3X4，二次項(xiàng)對提取率的影響極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)X2X4對提取率的影響顯著（P＜0.05）。各因素對龍膽草多糖提取率的影響大小順序?yàn)榇汲馏w積分?jǐn)?shù)（X1）＞提取溫度（X4）＞提取時(shí)間（X2）＞液料比（X3）。

表2 Bex-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and resu lts of Bex-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression mode l

2.2.2 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證

由該回歸模型預(yù)測的龍膽草多糖最佳提取工藝條件為醇沉體積分?jǐn)?shù)為90%，提取時(shí)間為2.11 h，液料比為26.36（m L∶g），提取溫度為74.89℃，最大提取率預(yù)測值為5.99%。考慮到實(shí)際操作的可行性，將工藝條件改為醇沉體積分?jǐn)?shù)90%，提取時(shí)間2 h，液料比26∶1（m L∶g），提取溫度75℃。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，龍膽草多糖的提取率為（5.89±0.25）%，與預(yù)測值較接近，所以此模型可較好地模擬和預(yù)測龍膽草多糖提取率及最佳提取工藝。

2.3 龍膽草多糖的抗氧化活性

2.3.1 龍膽草多糖對DPPH·清除作用

龍膽草多糖及維生素C對DPPH·清除率的作用見圖2。由圖2可知，隨著龍膽草多糖和維生素C溶液加入量的增多，對DPPH·清除率也隨之增大，超過一定量之后基本不再變化。分別以龍膽草多糖質(zhì)量濃度（0.05～0.80mg/m L）和維生素C質(zhì)量濃度（0.0005～0.006mg/m L）對DPPH·的清除率進(jìn)行線性擬合，求得龍膽草和維生素C的多糖清除DPPH·的IC50值分別為0.582 2mg/m L和0.003 7mg/m L，由IC50可以看出龍膽草多糖對DPPH·的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于維生素C。

圖2 龍膽草多糖對DPPH·的清除能力Fig.2 Scavenging effect of polysaccharide from Gentiana scabra on DPPH·

2.3.2 龍膽草多糖對OH·的清除作用

圖3 龍膽草多糖對OH·的清除能力Fig.3 Scavenging effectof polysaccharide from Gentiana scabra on OH·

龍膽草多糖及維生素C對DPPH·清除率的作用見圖3。由圖3可以看出，總的來說隨著龍膽草多糖和維生素C溶液加入量的增多，對OH·清除率也隨之增大，超過一定量之后基本不再變化。以龍膽草多糖質(zhì)量濃度（0.05～1mg/m L）對OH·的清除率進(jìn)行線性擬合，求得龍膽草多糖清除OH·的IC50為0.721 4mg/m L，以維生素C質(zhì)量濃度（0.000 5～0.015mg/m L）對OH·的清除率進(jìn)行線性擬合，得出維生素C的IC50為0.006 7mg/m L。由IC50可以看出龍膽草多糖對OH·的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于維生素C。

2.3.3 龍膽草對O2-·清除能力

龍膽草多糖對維生素C和多糖清除O2-·的能力結(jié)果見圖4。由圖4可以看出隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，龍膽草多糖和維生素C對O2-·的清除能力呈上升趨勢，但龍膽草多糖的清除能力不高，遠(yuǎn)小于同濃度的維生素C，當(dāng)維生素C的質(zhì)量濃度為0.5mg/m L的時(shí)候，對O2-·的清除率已經(jīng)達(dá)到99.62%。以樣品質(zhì)量濃度（0.05～1.00mg/m L）對O2-·的清除率進(jìn)行線性擬合，求得龍膽草多糖清除O2-·的IC50為2.5mg/m L，維生素C清除O2-·的IC50為0.11mg/m L。

圖4 龍膽草多糖清除的能力Fig.4 Scavenging effectof polysaccharide from Gentiana scabra on

2.3.4 龍膽草多糖的總還原能力

圖5 龍膽草多糖總還原能力Fig.5 Reducing power o f polysaccharides from Gentiana scabra

龍膽草多糖以及維生素C的總還原能力見圖5。從圖5可以看出，隨著龍膽草多糖和維生素C質(zhì)量濃度的增加，其還原能力均呈上升趨勢，但龍膽草的還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于同濃度的維生素C的還原能力。而維生素C的質(zhì)量濃度＞0.75mg/m L以后，吸光度值就達(dá)到最大，且基本穩(wěn)定，不再隨著濃度的增大而升高。

2.3.5 龍膽草多糖對ABTS+·的清除能力

龍膽草多糖以及維生素C對ABTS+·的清除能力見圖6。從圖6可以看出，隨著質(zhì)量濃度的增大，龍膽草多糖以及維生素C對ABTS+·的清除能力均有所提高。在0.01～4mg/m L范圍內(nèi)，龍膽草多糖對ABTS+·的清除能力均低于同濃度的維生素C，在多糖和維生素C質(zhì)量濃度為4mg/m L時(shí)和0.6mg/m L時(shí)，對ABTS+·的清除能力就達(dá)到了100%。以龍膽草多糖質(zhì)量濃度（0.01～1.00mg/m L）對ABTS+·的清除率進(jìn)行線性擬合，求得龍膽草多糖清除ABTS+·的IC50為0.6mg/m L，以維生素C質(zhì)量濃度（0.01～0.05mg/m L）對ABTS+·的清除率進(jìn)行線性擬合，得出維生素C的IC50為0.008mg/m L，由IC50也可以看出龍膽草多糖對ABTS+·的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于維生素C。

圖6 龍膽草多糖清除ABTS+·的能力Fig.6 Scavenging effect of polysaccharides from Gentiana scabra on ABTS+·

3 結(jié)論

龍膽草為一種具有清熱解毒功效的常見中藥，含有多種活性物質(zhì)，研究龍膽多糖的提取和抗氧化活性的條件具有重要價(jià)值。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對龍膽草多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立較可靠的預(yù)測模型，影響龍膽草多糖提取率的主次順序?yàn)榇汲馏w積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取時(shí)間＞液料比?？紤]到實(shí)際情況，得到最終的優(yōu)化條件為醇沉體積分?jǐn)?shù)90%，提取時(shí)間為2 h，液料比為26∶1（m L∶g），提取溫度為75℃。經(jīng)驗(yàn)證，得到的多糖提取率為（5.89±0.25）%，和預(yù)測值5.99%比較接近，說明此模型可以較好地預(yù)測實(shí)際提取率。

龍膽草多糖對自由基具有一定的清除能力，但均小于同濃度的維生素C，且龍膽草多糖的濃度與對自由基的清除能力呈一定的量效關(guān)系。龍膽草多糖的總還原能力也小于同濃度的維生素C，當(dāng)濃度為4mg/m L時(shí)，多糖樣品的吸光度值只有0.672，而維生素C質(zhì)量濃度在0.75mg/m L時(shí)，吸光度就達(dá)到了2.905。龍膽草多糖清除自由基的IC50分別為：IC50（DPPH·）=0.582 2mg/m L，IC50（OH·）=0.721 4mg/m L，IC50（O2-·）=2.5mg/m L，IC50（ABTS+·）為0.6mg/m L，由IC50的大小判斷出龍膽草多糖對這四種自由基清除能力的強(qiáng)弱順序如下：DPPH·＞ABTS+·＞OH·＞O2-·。

[1]程振玉，于麗穎，吉惠杰，等.龍膽多糖的不同提取工藝及抗氧化活性研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2016，37（5）：81-86.

[2]王金宏.龍膽中植物多糖保肝降血脂及免役調(diào)節(jié)作用的研究[D].哈爾濱：哈爾濱商業(yè)大學(xué)，2012.

[3]王晨瑜，劉鑫，張晶，等.水溶性龍膽多糖的提取工藝研究[J].北方園藝，2013（10）：155-157.

[4]宋海燕，梁麗青.龍膽藥材中龍膽多糖的提取工藝研究[J].化工技術(shù)與開發(fā)，2016，45（9）：28-31.

[5]LIR.Optimization ofextraction technology ofastragaluspolysaccharides by response surfacemethodology and its effecton CD40[J].Carbohyd Polym,2009,78(4):784-788.

[6]李佰綱.龍膽瀉肝湯臨床應(yīng)用舉隅[J].國醫(yī)論壇，2006，21（3）：31-32.

[7]劉濤，才謙，付玉芹，等.中藥龍膽的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2004，31（1）：85-86.

[8]孫海波，冷輝.十味龍膽花顆粒劑治療慢性咽炎臨床觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2001，8（12）：85.

[9]SUN J,YIN G Y,CHEN L Y.Extraction of pumpkin polysaccharide by complex enzymemethod and its antioxidant research[J].Agr Sci Technol,2010,11(5):34-37.

[10]張迪，劉洋，李書藝.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取青蛇果多酚工藝及其抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2016，37（4）：51-57.

[11]趙煥新，景援朝，白虹，等.分心木中的化學(xué)成分及抗氧化活性研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（7）：54-57.

[12]LIC,HUAN Q,FU X,et al.Characterization,antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides from Prunella vulgaris Linn[J].Int J Biol M acromol,2015,75:298-305.

[13]JIN L,GUAN X,LIUW,etal.Characterization and antioxidantactivity ofapolysaccharideextracted from Sarcandraglabra[J].Carbohyd Polym, 2012,90(10):524-532.

[14]程旺開，許月明，張冬冬.響應(yīng)面優(yōu)化黃秋葵葉多糖的提取工藝及其抗氧化活性考察[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（4）：38-42.

[15]王金華，杜超，梁晨，等.貴長獼猴桃多糖提取工藝及體外抗氧化功能[J].食品科學(xué)，2016，37（20）：19-23.

[16]楊申明，范樹國，文美瓊，等.微波輔助提取澳洲堅(jiān)果殼多糖的工藝優(yōu)化及抗氧化性評價(jià)[J].食品科學(xué)，2016，37（10）：17-22.

[17]徐盼菊，孟凡欣，唐萌，等.黑虎掌菌粗多糖制備及體外抗氧化活性研究[J].中國釀造，2017，36（3）：150-155.

[18]王晨瑜.龍膽多糖的制備及生物活性分析[D].撫順：遼寧石油化工大學(xué)，2014.

Extraction optim ization and antioxidantactivity ofGentian polysaccharides by response surfacemethodology

GONG Jiangning,WEIYuanjing,YANG Ziyi
(SchoolofChem istry and Material Science,Guizhou NormalUniversity,Guiyang 550001,China)

Theextraction technology of polysaccharide from Gentiana scabra Bungewasoptim ized and the in vitro antioxidantactivity wasevaluated. On the basis of single factor experiments,using alcohol precipitation concentration,extraction temperature,time and liquid-solid ratio as affecting factors,Gentian polysaccharideextraction ratio as response value,four factorsand three levelsBox-Behnken experimentswere designed,and then the extraction technology wasoptim ized by response surfacemethodology.The scavenging effectof Gentian polysaccharide on DPPH·,ABTS·,OH·,·was evaluated.Results showed that the optimum extraction conditions for Gentian polysaccharide was ethanol concentration 90%,extraction time2 h,liquid-solid ratio 26∶1(m l∶g),temperature75℃.Theactualextraction rate of polysaccharide from G.scabra was(5.89±0.25)%,and the deviation wasquite small compared with the predicted values.Gentian polysaccharide had certain antioxidant activity,but itwas less than vitam in C w ith the same concentration.

Gentiana scabra;polysaccharide;response surfaceexperiments;antioxidantactivity

TS201.2

0254-5071（2017）08-0134-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.029

2017-03-23

貴州省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合J字LKS[2012]17號）

宮江寧（1979-），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物。