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    冠心病患者血液循環(huán)miR- 126表達(dá)及與阿司匹林抵抗的關(guān)系

    2017-09-03 02:33:06趙艷晶陶英歌
    中國老年學(xué)雜志 2017年15期
    關(guān)鍵詞:亞組阿司匹林血小板

    劉 卓 趙艷晶 汪 晶 陶英歌

    (牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)一科,黑龍江 牡丹江 157000)

    冠心病患者血液循環(huán)miR- 126表達(dá)及與阿司匹林抵抗的關(guān)系

    劉 卓 趙艷晶 汪 晶 陶英歌

    (牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)一科,黑龍江 牡丹江 157000)

    目的 探討冠心病(CHD)患者血液循環(huán)微小RNA(mi)- 126的表達(dá)及與阿司匹林抵抗(AR)的關(guān)系。方法 收集牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院2015 年3月至2017年1 月的CHD患者106例,選擇同期在院內(nèi)的健康體檢志愿者51例作為對照。檢測所有受試者的血小板聚集率并判斷是否存在AR,采用RT- PCR法檢測血小板的miR- 126表達(dá),并分析miR- 126與AR的相關(guān)性。結(jié)果 與對照組比較,CHD組AR的發(fā)生率較高(P=0.005),血小板的miR- 126明顯降低(P=0.000)。與對照組的AR和非AR(NAR)亞組比,CHD的AR和NAR亞組miR- 126水平均明顯降低(P=0.000)。結(jié)論 CHD患者血小板 miR- 126 水平低于健康人,與AR存在相關(guān)性,血小板 miR126 水平降低可能會增加健康人群發(fā)生CHD的發(fā)生。

    冠心病;miR- 126;阿司匹林抵抗

    臨床常采用具有抗血小板聚集的阿司匹林預(yù)防冠心病(CHD)血栓事件發(fā)生。近年來,人們發(fā)現(xiàn)不同CHD患者對于阿司匹林的治療反應(yīng)或效果存在差異,致使血栓事件發(fā)生頻繁,這種現(xiàn)象被稱為阿司匹林抵抗(AR)〔1〕。流行病學(xué)統(tǒng)計顯示AR在心血管病患者的發(fā)生率高達(dá)40%。目前所發(fā)現(xiàn)的人類基因組30 億個核苷酸堿基對內(nèi),非編碼 RNA 基因,即微小 RNA(miR) 僅占整個基因組 1%,但人類基因組中約有1/3的基因受到miR調(diào)控。miR可調(diào)控血小板內(nèi) mRNA 表達(dá),影響血小板的活性。miR- 126〔2〕、miR- 34a〔3〕和miR- 92a〔4〕常作為血管疾病的生物學(xué)標(biāo)志,其中miR- 126與血小板的活性密切相關(guān)。本課題擬考察CHD患者血液循環(huán)miR- 126表達(dá)及AR的關(guān)系。

    1 對象和方法

    1.1 對象 經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),并經(jīng)過患者簽署知情同意書,收集2015 年3月至2017年1 月經(jīng)WHO臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合專題組提出的《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》中對CHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕并結(jié)合冠脈造影確診的CHD患者106例,主訴反復(fù)胸部悶痛,氣短,頭暈,時伴有心悸,疲勞時可加劇,經(jīng)休息可緩解。其中男67例,女39例,年齡(73.16±9.87)歲。患者均服用小劑量阿司匹林100 mg/d超過3個月,無胃腸出血跡象或者癥狀。納入標(biāo)準(zhǔn):符合CHD診斷標(biāo)準(zhǔn),冠狀動脈造影檢查提示左冠脈主干、右冠脈、左前降支和回旋支中有任意一支直徑狹窄程度>50%者;無阿司匹林過敏史者;未接受過血運(yùn)重建治療者;預(yù)計生存期>6個月;配合檢查和治療。排除標(biāo)準(zhǔn):存在家族或個人出血史,如原發(fā)性血小板減少性紫癜、肝膽疾病和血管硬化性出血;合并血液系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤患者;存在嚴(yán)重的肺、肝和腎功能障礙者;存在阿司匹林口服禁忌證者。選擇同期在院內(nèi)的健康體檢志愿者51例作為對照,其中男35例,女16例,平均年齡(72.65±10.32)歲。對照組在入選前2 個月內(nèi)未服用過影響血小板活性的藥物。

    1.2 主要儀器及試劑 ABI QuantstudioTMDX定量PCR儀(美國 ABI 公司);5400型全自動生化分析儀(美國貝克曼公司);700型全自動血小板聚集儀(上海博士儀器有限公司);LBY- NJ4A型全自動血小板聚集儀(北京普利生儀器有限公司)。Trizol 總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);內(nèi)參引物和miR- 19a(美國 Invitrogen公司),花生四烯酸(AA) (美國 Invitrogen公司)。

    1.3 指標(biāo)檢測

    1.3.1 一般指標(biāo) 收集所有受試者的性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙和喝酒情況,檢測血壓,抽取所有受試者空腹血5 ml,抗凝處理,離心獲得血漿,分別采用全自動生化儀檢測血脂和血糖及LBY- NJ4A型全自動血小板聚集儀檢測血小板計數(shù)。

    1.3.2 血小板聚集率 參考血小板聚集儀說明書及文獻(xiàn)〔6〕,收集所有受試者的空腹靜脈血5.0 ml,平均分為兩份,分別置于取2.5 ml置于抗凝管(抗凝劑∶血液=1∶9),500 r/min離心5 min,獲得富血小板血漿,3 000 r/min離心10 min,得乏血小板血漿(PPP)。以PPP為對照,采用全自動血小板聚集儀測定血小板聚集功能,將0.5 mmol/L AA為誘導(dǎo)劑,AA誘導(dǎo)的血小板聚集率≥20% 即為AR,20%為非CHD(NAR)。

    1.3.3 RT- PCR法檢測血小板的miR- 126表達(dá) 收集所有患者的富血小板血漿,檢測血小板的miR- 126表達(dá)。血小板沉淀按miRcute miRNA 提取試劑盒提取miRNA。采用莖環(huán)引物行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):2.0 μl RT buffer,2 μmol/L Primer 0.5 μl,6.25 μl RNA,0.5 μl dNTP,0.5 μl M- MLV,0.5 μl Rnase inhibitor,RNase- Free dd H2O加入至20 μl。逆轉(zhuǎn)錄循環(huán)條件:16℃ 15 min,35℃ 60 min,80℃ 15min。 hsa- miR- 126 引物序列:正義5′- GCCCTCGTACCGTGAGTAAT- 3′,反義5′- GTGCAGGGTCCGAGGT- 3′。熒光定量PCR反應(yīng):miRNA PCR 反應(yīng)終體積20 μl,包括2×Super Real Pre Mix 10 μl、上下游引物共 0.3 μmol/L、cDNA模板2.5 μl,同設(shè)陰性對照。PCR反應(yīng)設(shè)置程序:95℃ 變性2 min,95℃變性20 s,6℃退火20 s,72℃延伸1 min,共40個循環(huán)。經(jīng)軟件分析CT值,最終結(jié)果以2-ΔCT表示。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t及χ2檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1 兩組一般情況比較 兩組性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙喝酒、舒張壓、血脂、血糖和血小板計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),與對照組比較,CHD患者收縮壓較高(P<0.05)。見表1。

    表1 兩組一般情況比較

    2.2 兩組AR發(fā)生情況 對照組出現(xiàn)AR 10例(19.61%),CHD組出現(xiàn)45例(42.45%),兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.895,P=0.005) 。

    2.3 兩組miR- 126表達(dá) 對照組血小板miR- 126的相對表達(dá)(0.34±0.09)顯著高于CHD組(0.12±0.04,t=21.232,P=0.000)。

    2.4 兩組AR和非AR(NAR)亞組血小板miR- 126水平比較 對照組AR亞組miR- 126水平(0.49±0.10)低于NAR亞組(0.30±0.12),CHD組AR亞組miR- 126水平低于NAR亞組(0.14±0.04),與對照組的AR和NAR亞組比,CHD的AR和NAR亞組miR- 126水平均明顯降低(P=0.000)。

    3 討 論

    血小板在CHD發(fā)生血栓栓塞事件的作用越來越明確,血小板與血管內(nèi)皮釋放的黏連蛋白結(jié)合,啟動血栓形成,因此抗血小板治療成為CHD預(yù)防心血管事件發(fā)生的重要手段。阿司匹林是臨床最常用的抗血小板藥,病人應(yīng)用常規(guī)劑量的阿司匹林仍會發(fā)生血栓事件,即不良心血管事件(MACE),檢查標(biāo)明血小板的活化及聚集功能未得到充分抑制,即AR現(xiàn)象,AR的發(fā)生率較高,臨床后果較嚴(yán)重,因此早期判斷患者是否存在AR,通過替換給藥方案則有望改善CHD患者預(yù)后〔7〕。本研究提示存在AR的患者如果仍然繼續(xù)使用阿司匹林,抗血小板聚集的功能降低,AR患者發(fā)生MACE的概率遠(yuǎn)高于NAR患者,嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量,這也是CHD患者即使接受冠狀動脈介入治療(PCI)后繼發(fā)支架內(nèi)血栓的重要原因。

    miR- 126的基因位于血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)基因的第7個內(nèi)含子,最早在小鼠心臟和小腦中發(fā)現(xiàn),miR- 126可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的多種生理功能,對于造血、呼吸、消化、生殖甚至胚胎均有一定功能,尤其在心血管的功能備受關(guān)注。miR- 126在 CHD 的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色〔8〕。本課題結(jié)果提示血小板miR- 126與AR呈負(fù)相關(guān),即miR- 126水平越低,AR的發(fā)生率越高,血小板miR126的減少不僅可增加健康人發(fā)生AR的概率,也可增加健康人發(fā)生CHD的風(fēng)險。本文及文獻(xiàn)報道均顯示血小板miR- 126與AR關(guān)系緊密,可用于預(yù)測人群的AR發(fā)生,尤其可用于CHD用藥指導(dǎo)〔9〕。miR- 126水平與 CHD 病變的關(guān)系較為復(fù)雜,大致可分以下4 個方面〔9〕:(1)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)參與 CHD及動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生發(fā)展,miR- 126通過直接抑制出芽相關(guān)蛋白1(SPRED1)和磷酸肌醇3激酶調(diào)控亞單位(PIK3R2)/p85- β的表達(dá)負(fù)性調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF的應(yīng)答,下調(diào)的miR- 126失去了對 VEGF 的抑制,因此有學(xué)者認(rèn)為miR- 126可作為抗AS的潛在靶點(diǎn);(2) CHD的發(fā)生起始于血管內(nèi)皮受損導(dǎo)致功能障礙,血管內(nèi)皮受自始至終伴隨在CHD發(fā)展全過程,細(xì)胞黏附因子(VCAM)- 1是參與并促進(jìn)CHD發(fā)展過程的AS早期斑塊形成的關(guān)鍵因子。VCAM- 1是miR- 126的靶基因,當(dāng)敲除miR- 126反義寡核苷酸,VCAM- 1的表達(dá)增高;(3)CHD是慢性炎癥性疾病,許多炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與其中,miR- 126可下調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)- α表達(dá),抑制TNF- α誘導(dǎo)的白細(xì)胞在血管內(nèi)皮的黏附,促使動脈斑塊面積縮小,增高膠原蛋白,達(dá)到抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生;(4)miR- 126是血管生成信號通路中的正調(diào)節(jié)因子,miR- 126可編碼類表皮生長因子域(EGFL)7基因內(nèi)含子,EGFL7可編碼VEGF,因此上調(diào)miR- 126表達(dá)可促進(jìn)血管生成,改善并修復(fù)損傷血管細(xì)胞,確保血管完整,敲除斑馬魚的miR- 126可抑制血管遷移,干擾生長信號,破壞血管內(nèi)膜完整性。

    CHD患者血小板miR- 126與AR具有明顯的相關(guān)性,提示miR- 126可能具有促進(jìn)血小板的活化和聚集的作用,研究也顯示阿司匹林的應(yīng)用可降低循環(huán)miR- 126水平,進(jìn)一步為miR- 126參與CHD提供了證據(jù)〔10〕。雖然研究認(rèn)為在血小板表達(dá)的miR可改變血小板基因表達(dá),如血小板內(nèi)Ago2免疫沉淀物可檢測到miR- 223,即P2Y12的 mRNA 在 3′端 UTR 可以被miR識別,miR- 223與3′ 端 UTR結(jié)合并形成 Ago2- miR- 223 復(fù)合體反過來調(diào)節(jié) P2Y12的表達(dá)〔11〕。但miR- 126對血小板基因影響尚不明確,有待進(jìn)一步探索。李娜〔12〕認(rèn)為miR- 126在穩(wěn)定型心絞痛的表達(dá)低于不穩(wěn)定型心絞痛,是否提示miR- 126在不穩(wěn)定型心絞痛水平增高是一種機(jī)體對心絞痛病理的代償性保護(hù)作用,仍需要提供更多數(shù)據(jù)支持。另外,除了miR- 126,血小板中有超過300個不同的 mRNA,這些miR均有可能不同程度地參與調(diào)控血小板基因表達(dá),這些不同的 mRNA也存在不同程度地交互作用,如血栓素激活1 h的血小板中miR- 15a的表達(dá)下調(diào),但miR- 365的表達(dá)上調(diào)〔3,4〕,可見不同的 mRNA的相互作用復(fù)雜多變,因此僅考察miR- 126或多個miRNA均可能存在不同程度的偏頗。

    1 Chadha DS,Sumana B,Karthikeyan G,etal.Prevalence of aspirin resistance in Asian- Indian patients with stable coronary artery disease〔J〕.Catheter Cardiovasc Interv,2016;88(4):E126- 31.

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    6 Tarandovskiy ID,Artemenko EO,Panteleev MA,etal.Antiplatelet agents can promote two- peaked thrombin generation in platelet rich plasma:mechanism and possible applications〔J〕.PLoS One,2013;8(2):e55688.

    7 Doly JS,Lorian E,Desormais I,etal.Prevalence and prognosis of aspirin resistance in critical limb ischemia patients〔J〕.J Mal Vasc,2016;41(6):358- 64.

    8 Wang JN,Yan YY,Guo ZY,etal.Negative association of circulating microRNA- 126 with high- sensitive c- reactive protein and vascular cell adhesion molecule- 1 in patients with coronary artery disease following percutaneous coronary intervention〔J〕.Chin Med J (Engl),2016;129(23):2786- 91.

    9 Khanaghaei M,Tourkianvalashani F,Hekmatimoghaddam S,etal.Circulating miR- 126 and miR- 499 reflect progression of cardiovascular disease;correlations with uric acid and ejection fraction〔J〕.Heart Int,2016;11(1):e1- 9.

    10 王 鳳,徐華英,杜文婷,等.miR- 126的臨床意義研究進(jìn)展〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2016;35(9):2236- 41.

    11 Tian HS,Zhou QG,Shao F.Relationship between arterial atheromatous plaque morphology and platelet- associated miR- 126 and miR- 223 expressions〔J〕.Asian Pac J Trop Med,2015;8(4):309- 14.

    12 李 娜.冠心病患者血小板相關(guān)microRNA的表達(dá)及其意義〔D〕.蚌埠:蚌埠醫(yī)學(xué)院,2014.

    〔2017- 06- 11修回〕

    (編輯 袁左鳴)

    陶英歌(1979- ),女,主管護(hù)師,主要從事消化內(nèi)科研究。

    劉 卓(1983- ),女,主管護(hù)師,主要從事心血管疾病研究。

    R741.02

    A

    1005- 9202(2017)15- 3707- 03;

    10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.028

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