桑枝黃酮對(duì)糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用

宿世震 項(xiàng)東宇 劉 杰 王金鳳

(山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺(tái) 264199)

桑枝黃酮對(duì)糖尿病腎病大鼠的保護(hù)作用

宿世震 項(xiàng)東宇 劉 杰 王金鳳

(山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，山東 煙臺(tái) 264199)

目的 觀察桑枝黃酮對(duì)糖尿病腎病(DN)大鼠的保護(hù)作用。方法 采取一側(cè)結(jié)扎腎臟+鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射的方法復(fù)制DN大鼠模型，分為模型組，二甲雙胍組、低、高劑量桑枝黃酮組(9、18 g/kg)，取健康大鼠為正常對(duì)照組，灌胃治療，1次/d，連續(xù)4 w后檢測(cè)各組大鼠空腹血糖(FBG)、血肌酐(Scr)、腫瘤壞死因子(TNF)- α、白細(xì)胞介素(IL)- 6和C反應(yīng)蛋白(CRP)水平；收集24 h尿液測(cè)定尿蛋白。同時(shí)取腎臟制備病理切片，PAS染色后鏡下觀察。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組的FBG、Scr、尿蛋白、TNF- α、IL- 6、CRP均顯著升高(P<0.01)，說明DN模型復(fù)制成功；與模型組比較，桑枝黃酮組的FBG、mAlb、TNF- α、IL- 6、CRP水平顯著降低(P<0.01)，并呈一定劑量依賴性；病理切片顯示高劑量桑枝黃酮組大鼠腎臟損害輕于模型組。結(jié)論 桑枝黃酮可降低DN大鼠的血糖、改善腎功能、減輕腎臟病理改變，對(duì)DN大鼠的腎臟具有保護(hù)作用，降低炎癥因子水平可能是其機(jī)制之一。

桑枝黃酮；糖尿病腎??；炎癥因子

桑枝是?？浦参锷orus alba L.的干燥嫩枝，性平味微苦，歸肝經(jīng)。桑枝的藥理作用在我國很早就有醫(yī)書記載，如“桑枝，功專去風(fēng)濕拘攣”、“療遍體風(fēng)癢干燥，兼療口干”等，目前臨床多應(yīng)用于關(guān)節(jié)腫痛、手足麻木等疾病。實(shí)驗(yàn)研究顯示桑枝具有降糖、降脂、抗氧化、抗炎等作用〔1～3〕。糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者常見的慢性并發(fā)癥，近年研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)- 6、腫瘤壞死因子(TNF)- α和C反應(yīng)蛋白(CRP)在DN發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，并認(rèn)為DN是一種炎癥性疾病〔4，5〕。本文探討桑枝黃酮對(duì)DN大鼠炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，SPF級(jí)，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK(魯)20090001，體重192～217 g，雌雄各半，攝食飲水自由，飼料喂普通大鼠飼料，飲水采用高壓滅菌自來水。

1.2 藥物及試劑 桑枝黃酮制備：桑枝購于本校附屬醫(yī)院，經(jīng)山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥鑒定教研室王蘇麗教授鑒定為?？浦参锷orus alba L.的干燥嫩枝，桑枝烘干粉碎，以95%乙醇為溶劑，料液比為1∶10，80℃提取3次，合并提取液，減壓回收至無醇味，加適量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，真空干燥，備用。1 g提取物相當(dāng)于生藥75 g，臨用前配置為生藥濃度0.9 g/ml，復(fù)溫至25℃～30℃后灌胃。鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)。尿微量白蛋白測(cè)定試劑盒(廣州智真生物科技有限公司，批號(hào)20131129)。IL- 6、TNF- α、CRP試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)20131225)。二甲雙胍(河南天方藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)130105112)

1.3 主要儀器 微量血糖儀及試紙(ACCU- Chek Active，德國羅氏診斷公司)；ZD- 420電熱恒溫水浴箱(杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠)；st- 60索氏提取器(上海精密科學(xué)儀器總廠)；680酶標(biāo)儀(美國Bio- rad公司)；CX21BIM- SET6奧林巴斯生物光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 模型制備 大鼠70只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)數(shù)字表法取10只作為正常對(duì)照組，余60只大鼠腹腔注射3%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后，從左側(cè)脊柱與肋骨相交處稍下方切開皮膚及肌層，暴露腎臟，于腎門處沿腎蒂同時(shí)結(jié)扎腎臟動(dòng)靜脈和輸尿管，縫合肌層和皮膚，術(shù)后4 w，禁食12h，腹腔注射1%STZ溶液55 mg/kg，72 h后取尾血測(cè)定空腹血糖(FBG)，≥16.6 mmol/L為初選指標(biāo)，穩(wěn)定2 w后FBG≥16.6 mmol/L、尿糖強(qiáng)陽性、尿量大于正常對(duì)照組的50%為DN模型〔6〕，其中8只大鼠于術(shù)中或術(shù)后死亡，4只大鼠于注射STZ后死亡，2只大鼠血糖未達(dá)標(biāo)，最終成模46只。

1.4.2 動(dòng)物分組及給藥 成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法選取40只，隨機(jī)分為四組，每組10只，即模型組、二甲雙胍組(65 mg/kg)、低、高劑量桑枝黃酮組(以生藥計(jì)，9.0、18.0 g/kg)，以上給藥劑量均參考“人與動(dòng)物體表面積計(jì)算藥物量”的方法制定，正常對(duì)照組及模型組每次給予蒸餾水2 ml，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)4 w。

1.4.3 指標(biāo)檢測(cè) 動(dòng)物禁食不禁水12 h，剪尾取血，應(yīng)用微量血糖儀檢測(cè)FBG；腹主動(dòng)脈取血，EDTA抗凝管收集，離心分離血漿、凍存待測(cè)。全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血肌酐(Scr)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定IL- 6、TNF- α、CRP水平，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作；于取血前用代謝籠收集24 h尿液，混勻后取4 ml，免疫透射比濁法測(cè)定24 h尿蛋白；病理切片過程為取血后迅速取腎臟，去除腎包膜及腎門結(jié)締組織并用生理鹽水洗凈，經(jīng)腎門冠狀面取腎組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，PAS染色，光鏡下觀察腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)、基質(zhì)增生和炎細(xì)胞浸潤等情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用SNK法。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠FBG、Scr、尿蛋白的比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠FBG、Scr、尿蛋白明顯升高(P<0.01)，提示模型復(fù)制成功；與模型組比較，低、高劑量桑枝黃酮組的FBG、Scr、尿蛋白顯著下降(P<0.01)，桑枝黃酮高劑量組作用更明顯，見表1。

表1 各組 FBG、Scr、尿蛋白、IL- 6、TNF- α、CRP水平比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與低劑量桑枝黃酮組比較：3)P<0.05，與二甲雙胍組比較：4)P<0.05

2.2 各組炎癥因子IL- 6、TNF- α、CRP比較 與正常對(duì)照組比較，模型組IL- 6、TNF- α、CRP水平顯著升高(P<0.01)，說明DN大鼠體內(nèi)炎癥水平升高；與模型組比較，桑枝黃酮組IL- 6、TNF- α、CRP水平均不同程度降低，并呈劑量依賴性(P<0.01)，且作用優(yōu)于二甲雙胍組(P<0.05)，見表1。

2.3 各組腎臟組織學(xué)比較 正常對(duì)照組鏡下腎小球基底膜完整，間質(zhì)中未見炎癥細(xì)胞浸潤、系膜基質(zhì)未見明顯異常改變；模型組鏡下可見腎小球體積增大，系膜基質(zhì)增生，基底膜增厚，腎小管壞死，炎性細(xì)胞浸潤，呈空泡變性，間質(zhì)部見糖原積累，髓質(zhì)亦可見糖原積累，符合DN特征。各給藥組大鼠腎臟病理改變較模型組有所減輕，桑枝黃酮高劑量組改變明顯，基底膜少量增厚，病變明顯減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織表現(xiàn)(PAS染色，×200)

3 討 論

炎癥因子IL- 6、TNF- α、CRP與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔5，7〕。IL- 6主要由脂肪組織、單核- 巨噬細(xì)胞分泌，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，可通過旁分泌或自分泌形式與腎小球系膜細(xì)胞上的IL- 6受體結(jié)合，刺激腎小球系膜的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腎小球肥大、腎小球?yàn)V過膜增厚、腎間質(zhì)纖維化及出現(xiàn)蛋白尿等。此外，IL- 6基因的表達(dá)與腎間質(zhì)損傷程度密切相關(guān)〔8〕。

TNF- α主要由即使細(xì)胞產(chǎn)生，糖尿病時(shí)腎小球和腎小管間質(zhì)其表達(dá)增高，TNF- α可促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集與黏附，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，減少血漿纖溶酶原激活物的合成，導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管內(nèi)血栓和纖維素樣物質(zhì)的生成，引起腎小球結(jié)構(gòu)和功能異常繼而尿中蛋白排出增加〔9，10〕。CRP是由肝臟產(chǎn)生的一種急性期蛋白，可降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)及生物活性；參與氧化應(yīng)激，刺激血管內(nèi)皮釋放炎癥因子如細(xì)胞間黏附分子- 1、TNF- α及單核細(xì)胞趨化蛋白- 1等；促進(jìn)白細(xì)胞釋放超氧化物歧化酶和蛋白水解酶，從而引起腎損傷，并與尿蛋白排泄率及疾病嚴(yán)重程度相關(guān)〔10，11〕。近年來，許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均表明抗炎治療可以降低尿蛋白排泄率以及延緩腎臟損傷的進(jìn)程〔12，13〕。

本實(shí)驗(yàn)采用一側(cè)腎臟結(jié)扎加小劑量STZ腹腔注射的方法復(fù)制DN模型，模型復(fù)制成功，并證實(shí)DN大鼠體內(nèi)存在著炎癥狀態(tài)，桑枝黃酮對(duì)DN模型大鼠的腎臟具有保護(hù)功能，考慮其保護(hù)腎臟的機(jī)制可能與降低IL- 6、TNF- α、CRP等炎癥因子水平有關(guān)，其抑制炎癥的作用及具體機(jī)制有待深入研究。

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〔2016- 02- 28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009- 271)

宿世震(1979- )，男，講師，在讀碩士，主要從事動(dòng)物模型及解剖學(xué)研究。

R965

A

1005- 9202(2017)15- 3697- 03；

10.3969/j.issn.1005- 9202.2017.15.024