白屈菜總堿對舞毒蛾離體酶活性的影響

呂春鶴，張國財(cái)，鄒傳山

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱150040)

白屈菜總堿對舞毒蛾離體酶活性的影響

呂春鶴，張國財(cái)*，鄒傳山

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱150040)

通過對白屈菜粗提物純化獲得白屈菜總堿，對舞毒蛾3齡幼蟲5種離體酶活進(jìn)行測定。測定結(jié)果表明：用AB-8大孔吸附樹脂純化白屈菜粗提物，得到5種生物單堿，含量從高到低依次為：黃連堿>白屈菜堿>鹽酸小檗堿>血根堿>四氫黃連堿。純化后的白屈菜總堿對5種離體酶活均有不用程度的抑制作用，對GST抑制作用最強(qiáng)，IC50為5.333 mg/mL，對CarE的抑制作用最弱，IC50為3.475×103mg/mL。白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲5種離體酶的敏感性依次為GST>AChE>CAT>SOD>CarE。

白屈菜；舞毒蛾；生物堿；離體酶活

隨著化學(xué)農(nóng)藥的不斷開發(fā)，越來越多的農(nóng)藥產(chǎn)品被投入到市場當(dāng)中，造成了市場上化學(xué)農(nóng)藥的所占比例一直居高不下。近幾十年來隨著昆蟲抗藥性的增強(qiáng)，化學(xué)農(nóng)藥也在不斷升級發(fā)展，最終導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥的大量累積而且難被分解，使人們健康受到威脅。新型、無公害農(nóng)藥的研制、開發(fā)就成為了發(fā)展的必然[1]。因此，植物源農(nóng)藥受到了越來越多的關(guān)注，在植物源殺蟲劑上應(yīng)用廣泛的生物堿包括煙堿、苦參堿、雷公藤堿、小檗堿等，這些生物堿都已被證明具有很好的殺蟲活性[2]。

白屈菜(ChelidoniummajusL.)是罌粟科白屈菜屬植物，全草入藥、有毒。 白屈菜中所含的生物堿主要有白屈菜堿、小檗堿、白屈菜紅堿等。研究表明，血根堿對于菜青蟲、葉螨、指環(huán)蟲等具有較強(qiáng)的毒性[3-4]。對某些真菌、細(xì)菌和病毒有抑制作用，但對神經(jīng)、心臟等有毒害，可引起麻痹、心臟抑制，甚至導(dǎo)致死亡。近年來隨著人們不斷地從白屈菜中分離出白屈菜堿、白屈菜紅堿和血根堿等有效活性成分，白屈菜在各個(gè)領(lǐng)域的研究也越來越廣泛[5-7]。但是對其殺蟲方面的研究卻少有報(bào)導(dǎo)。本研究通過對白屈菜的粗提和純化，以舞毒蛾3齡幼蟲為測試對象，研究了白屈菜總堿對舞毒蛾離體酶活性的影響，探討了白屈菜總堿對舞毒蛾的毒殺作用機(jī)理，為其在林業(yè)害蟲防治中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

白屈菜采于東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)林場，取40 g過60目篩的白屈菜干粉與400 mL 80%乙醇溶液混合。在60 ℃、90 Hz條件下超聲處理50 min。抽濾后棄去濾出的粉末，15000 r/min下冷凍離心10 min，將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，將溶液中的有機(jī)溶劑全部蒸發(fā)，余下油狀物質(zhì)即為白屈菜堿粗提物，避光低溫保存4℃冰箱中。

舞毒蛾(Lymantriadispar)蟲卵采于東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，消毒后放于25 ℃條件下用人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。待培養(yǎng)到3齡幼蟲后，取出相同大小的健康幼蟲放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 白屈菜堿粗提物的純化

將 AB-8大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，濕法裝住后靜置40 min。以3 mL/min的吸附流速上樣，直到樣品被完全吸附，靜置6 h。最后用95%乙醇溶液洗脫，在有黃色液體流出時(shí)開始接收至流出液無色，收集全部洗脫液，減壓回收溶劑，低溫烘干得到白屈菜總堿。

將純化出的白屈菜總堿配制成濃度為0.1、1、10、100 、1000 mg/mL的溶液，用于離體酶活的測定。

1.3 離體酶液制備及酶活性的測定

取舞毒蛾3齡幼蟲4頭，用pH 7.5 0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PBS)清洗體表，去除腸道內(nèi)含物，置于玻璃勻漿器中，按舞毒蛾幼蟲體重加入不同pH 值的預(yù)冷 PBS(1mL/g，于 4 ℃，12000 r/min 離心15 min，上清液即為酶源，并將酶源用0.1mol/L 磷酸緩沖液配制成不同的濃度。在 GST 和 CAT的制備中，分別用含 1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)的 1.0 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH6.5)(緩沖液用前加 PMSF 和 DTT 至終濃度為1.0mmol/L)及 pH 7.0 0.1mol/L 磷酸緩沖液代替 pH 7.5 0.1mol/L 磷酸緩沖液。

1.3.1 AChE活性測定。AChE活性測定參考Gorun改進(jìn)的Ellman方法[8]。對照組和處理組同時(shí)取0.2 mL不同濃度的待測酶液，對照組加入40%乙醇，處理組加入1 mL不同濃度的白屈菜總堿，反應(yīng)3 min后與0.6 mL ATCI混勻，35 ℃水浴加熱15 min，再加入2.0 mL顯色劑(DTNB)終止反應(yīng)，于412 nm波長下測定光密度值(OD412)。

1.3.2 CarE活性測定。CarE活性測定參照Van Asperen等的方法[9]，略加改進(jìn)。對照組和處理組分別將0.05 mL稀釋酶液與1 mL 40%乙醇和1 mL不同濃度的白屈菜總堿混勻，3 min后加入2 mL 3×10-4mol/L α-乙酸萘酯底物溶液(含毒扁豆堿1∶1)，混勻后，35 ℃水浴保溫10 min后，加入0.90 mL顯色液(5%十二烷基硫酸鈉∶1%固藍(lán)B鹽=5∶2)終止反應(yīng)，于600 nm波長下測光密度值OD600。

1.3.3 GST活性測定。GST活性測定參照Habig(1974)和Oppenoort等(1979)方法[10-11]?？偡磻?yīng)體系為3.1 mL，含有1.0 mL 0.1 mol/L PBS、1.0 mL 5 mmol/L GSH和1.0 mL稀釋酶液，對照組和處理組分別加入1 mL 40%乙醇和1 mL不同濃度的白屈菜總堿，35 ℃水浴孵育10 min，加入0.1 mL 1.0 mmol/L DCNB底物，于345 nm波長下每隔30 S測定光密度值OD345，記錄3 min內(nèi)OD345變化值△OD345。

1.3.4 SOD活性測定。SOD比活力參照(Beauchamp和Fridovich,1971；Maleck A 等,2001)的NBT法進(jìn)行[12]。反應(yīng)體系中含有80 μmol/L的核黃素、77 μmol/L的NBT、13 mmol/L的MET、0.1 mmol/L的EDTA和50 μL酶液，對照組加入1 mL40%乙醇，處理組加入1 mL不同濃度的白屈菜總堿。于4000 lx下光照5 min后，遮光停止反應(yīng)，測定OD560，并測定酶液的蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 CAT活性測定。CAT活性測定參照張友軍等方法[13]。反應(yīng)體系含有0.1 mol/L pH7.0的PBS、0.08%H2O2和0.05 mL酶液對照組加入1 mL40%乙醇，處理組加入1 mL不同濃度的白屈菜總堿。測定OD240，每30s記數(shù)一次，共記錄3 min，測定每分鐘OD240的變化值，同時(shí)測定酶液的蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果分析

2.1 白屈菜粗提物的純化

利用大孔樹脂AB-8吸附法從白屈菜粗提物中分離得到白屈菜堿、鹽酸小檗堿、血根堿、四氫黃連堿和黃連堿等5種主要生物堿，并通過HPLC-MS對5種生物堿進(jìn)行了鑒定及定量分析，結(jié)果見圖1。按照每種生物堿含量由高到低依次為：黃連堿>白屈菜堿>鹽酸小檗堿>血根堿>四氫黃連堿。

圖1 白屈菜總堿高效液相圖譜

2.2 白屈菜總堿對舞毒蛾離體酶活影響

2.2.1 白屈菜總堿對AChE的作用。白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體AChE活性抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖2 白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體AChE活性的影響

由圖2可知，白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體AChE活性有抑制作用，AChE抑制率隨著白屈菜總堿處理濃度的升高而升高，存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在濃度為1000 mg/mL時(shí)，白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲的抑制率為88%。但在低濃度時(shí)，白屈菜總堿對AChE的抑制率僅為9%。

2.2.2 白屈菜總堿對CarE的作用。白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體CarE活性影響見圖3。

圖3 白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體CarE活性的影響

由圖3可知，白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體CarE活性抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系?？傮w上CarE活性隨著白屈菜總堿處理濃度的升高而降低。在白屈菜總堿濃度為1000 mg/mL時(shí)，白屈菜總堿對舞毒蛾幼蟲CarE的抑制率為43%，濃度為100 mg/mL時(shí)抑制率為44%，濃度為1 mg/mL時(shí)，抑制率僅為15%。

2.2.3 白屈菜總堿對GST的作用。白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體GST活性抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果見圖4。

圖4 白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體GST活性的影響

由圖4可知，白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體GST活性有抑制作用，GST抑制率隨著白屈菜總堿濃度的升高而升高。在白屈菜總堿濃度為1000 mg/mL時(shí)，白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲GST的抑制率為80%，濃度為100 mg/mL，抑制率為65%，濃度為0.1 mg/mL時(shí)，抑制率為22%。

2.2.4 白屈菜總堿對SOD的作用。白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體SOD活性有抑制作用，結(jié)果見圖5。

圖5 白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體SOD活性的影響

由圖5可知，對SOD的抑制率隨著白屈菜總堿濃度的升高而升高，且存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在濃度為1000 mg/mL時(shí)，白屈菜總堿對舞毒蛾幼蟲SOD的抑制率達(dá)到了85%，在100 mg/mL時(shí)，對SOD的抑制率為52%，在10 mg/mL和0.1 mg/mL時(shí)，抑制率分別為19%和6%。

2.2.5 白屈菜總堿對CAT的作用。白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體CAT活性有抑制作用，對CAT的抑制率隨著白屈菜總堿處理濃度的升高而升高，且存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果見圖6。

圖6 白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲離體CAT活性的影響

由圖6可知，在濃度為1000 mg/mL時(shí)，白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲CAT的抑制率在59%，在濃度為100 mg/mL時(shí)，對CAT的抑制率為51%，當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，對CAT抑制率為37%，在0.1 mg/mL時(shí)，白屈菜總堿對CAT抑制率為18%。

2.2.6 白屈菜總堿對舞毒蛾體內(nèi)酶活I(lǐng)C50的測定。根據(jù)相應(yīng)的劑-效關(guān)系，用二次方程分別計(jì)算出白屈菜總堿對5種酶的抑制中濃度(IC50)，結(jié)果見表1。

由表1可知，白屈菜總堿對GST的IC50為5.333 mg/mL，顯示出最強(qiáng)的抑制活性，對AChE的IC50為7.122 mg/mL，也具有顯著的抑制作用。此外，白屈菜總堿對兩種保護(hù)酶SOD和CAT的IC50值分別為1.24×102mg/mL和5.126×101mg/mL，有較為明顯的抑制作用。白屈菜總堿對CarE(IC50=3.475×103mg/mL)的抑制作用最弱。因此，根據(jù)離體IC50值，得出白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲5種離體酶的敏感性依次為GST>AChE>CAT>SOD>CarE。

表1 白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲體內(nèi)酶活I(lǐng)C50值

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)用AB-8大孔樹脂對白屈菜粗提物進(jìn)行純化，經(jīng)高效液相分析，得到5種生物單堿，其含量從高到低依次是黃連堿>白屈菜堿>鹽酸小檗堿>血跟堿>四氫黃連堿。牛長群用高效薄層色譜法對白屈菜中的生物堿進(jìn)行了種類、含量測定[14]，得到8種單堿，除了白屈菜紅堿外，多分離出的另兩種單堿的含量相對較少，所占比例均未達(dá)到總堿的0.05%。其它單堿含量與本試驗(yàn)得出的結(jié)果基本相符，黃連堿和白屈菜堿含量較高，其次為白屈菜紅堿和鹽酸小檗堿，四氫黃連堿含量相對較少，與本研究結(jié)果基本吻合。

研究得出白屈菜總堿對舞毒蛾3齡幼蟲5種離體酶活均有顯著的抑制作用。尤其對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)具有最強(qiáng)的抑制活性，而對羧酸酯酶(CarE)抑制活性最弱，其敏感性依次為GST>AChE>CAT>SOD>CarE。

當(dāng)白屈菜總堿對昆蟲體內(nèi)酶活系統(tǒng)造成干擾時(shí)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶作為昆蟲體內(nèi)一種重要的解毒酶活性就會(huì)受到影響，遭到破壞[15]；而乙酰膽堿酯酶在維持神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)中起著重要作用，它主要通過催化水解乙酰膽堿來保證神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞，是多種植物源殺蟲劑的主要靶標(biāo)酶之一[16,18]，本研究也證實(shí)了乙酰膽堿酯酶對白屈菜總堿有著較強(qiáng)的敏感性；昆蟲體內(nèi)的保護(hù)酶可以保護(hù)昆蟲有機(jī)體免受外界刺激侵害[19,21]。超氧化物歧化酶是昆蟲體內(nèi)最重要的清除自由基的酶，它清除O2-生成H2O2后，H2O2與O2-形成毒性更強(qiáng)的HO，必須由過氧化氫酶來分解H2O2[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)?shù)蜐舛劝浊丝倝A侵入昆蟲體內(nèi)時(shí)，其對兩種保護(hù)酶的抑制作用并不明顯，甚至起到了一定的激活作用，但隨著藥劑累加，藥害加強(qiáng)，兩種保護(hù)酶的活性就會(huì)得到顯著抑制。

[1]周治德,李曉剛,李桂銀.植物源農(nóng)藥的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J].廣東化工,2013(19):68-69.

[2]王以燕,袁善奎,李友順.美國EPA登記的生物農(nóng)藥有效成分名錄2009,30(8).

[3]劉計(jì)權(quán),韓曉靜,謝樹蓮.植物源農(nóng)藥防治根結(jié)線蟲研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥,2011(6):395-398

[4]趙善歡.中國植物質(zhì)殺蟲劑的研究(英語)[J].Entomologia Sinica,1994(4): 365-374.

[5]丁吉同,唐樺,阿地力·沙塔爾,等.4種植物源殺蟲劑對亞洲型舞毒蛾幼蟲的毒性與拒食作用[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,48(4):80-84.

[6]顏成生,彭曙光,單雪華,等.魚藤酮對煙草斜紋夜蛾和煙青蟲的防治效果[J].作物研究,2015(6):647-650.

[7]王新華,劉敏艷,胡冠芳,等.頂羽菊提取物對鱗翅目幼蟲的殺蟲活性研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,12(3):1124-1129.

[8]蔣小龍,楊嘉谷,劉文斌,等.花椒對玉米象、儲(chǔ)糧曲霉和青霉防效的初步研究[J].鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào),1992(3):30-39.

[9]Van Asperen K. A study of housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method[J]. Journal of insect physiology, 1962,8(4):401-416.

[10]Oppenoorth F J, Van der Pas L J T, Houx N W H. Glutathione S-transferase and hydrolytic activity in a tetrachlorvinphos-resistant strain of housefly and their influence on resistance[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,1979,11 (1):176-188.

[11]Habig W H, Pabst M J, Jakoby W B. Glutathione S-transferases the first enzymatic step in mercapturic acid formation[J].Journal of biological Chemistry,1974,249(22):7130-7139.

[12]Beauchamp C,Fridovich I.Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to acrylamide gels[J].Analytical biochemistry,1971,44(1):276-287.

[14]牛長群,何麗一. 白屈菜中異喹啉生物堿的高效薄層分離及熒光掃描法[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1992(1):69-73.

[15]張友軍,王光鋒,吳青君,等.多殺菌素對不同發(fā)育階段甜菜夜蛾的毒力及其體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶的影響[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2003,5(3):31-38.

[16]蔣繼宏,吳薇,陳鳳美,等.苦豆堿對小菜蛾體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)活力的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2004(5):56-57.

[17]黃菁,喬傳令.昆蟲解毒酶解毒機(jī)理及其在農(nóng)藥污染治理中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù),2002(3):285-287.

[18]鄒宇曉,昆蟲應(yīng)激代謝產(chǎn)物-熱休克蛋白及保護(hù)酶研究概況[J].廣東蠶業(yè),2000,34(1):55-58.

[19]劉麗華,王雙,關(guān)磊.北烏頭乙醇提取液對菜青蟲體內(nèi)保護(hù)酶活性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2015(1):146-147.

[20]趙云峰,楊峰,鄭瑩光,等.活性氧自由基對固氮酶鋁鐵蛋白的損傷[J].吉林大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào),1994,11(4):79-81.

[21]廖月枝,嚴(yán)善春,曹傳旺,等.甲氧蟲酰肼對舞毒蛾幼蟲解毒酶及其體內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響[J].林業(yè)科學(xué),2012,23(8):99-105.

[22]鄢杰明,鐘華,嚴(yán)俊鑫,等.多殺菌素對舞毒蛾幼蟲解毒酶活性的影響[J].林業(yè)科學(xué),2012,43(9):82-87.

EffectsofTotalAlkaloidsfromtheChelidoniummajusontheEnzymesActivitiesinLymantriadisparinVitro

Lv Chunhe,Zhang Guocai*,Zou Chuanshan
(Northeast Forestry University, Harbin 150040)

Purify the crude extract ofChelidoniummajus to get the total alkaloids ofChelidonium,determine the five in vitro enzyme activities of 3rd instar larvae.The results show:five main isoquinoline alkaloids in C. majus are successfully isolated using macroporous resin AB-8 adsorption,content from high to low followed by coptisine>celeryridine > berberine hydrochloride > sanguinarine > tetrahydrocoptisine. the strongest inhibitory activity to glutathione S-transferase (GST) IC50:5.333mg/mL, and the weakest inhibition to carboxylesterase (CarE). IC50:3.475×103mg/mL.The IC50 values of five enzymes is in a decreasing order of GST>AChE>CAT>SOD>CarE.

Chelidoniummajus;Lymantriadispar; Alkaloid;Enzymatic activity

2017-04-27

呂春鶴(1991-)，女，碩士，研究方向：生物化學(xué)防治，E-mail：1547481870@qq.com；*通訊作者：張國財(cái)(1964-)，男，教授，研究方向：生物化學(xué)防治，E-mail：zhang640308@126.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.04.009

S767.3+7

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