多重RT-PCR快速檢測(cè)東南沿海城市生食水產(chǎn)品中致病菌污染狀況

謝慶超 李 想 趙 勇 黃新新 潘迎捷 郭德華* 劉海泉，5**

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心；4.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海）；5.上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心）

多重RT-PCR快速檢測(cè)東南沿海城市生食水產(chǎn)品中致病菌污染狀況

謝慶超1，3，4李 想2趙 勇1，3，4黃新新2潘迎捷1，3，4郭德華2*劉海泉1，3，4，5**

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局；3.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心；4.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海）；5.上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心）

為實(shí)現(xiàn)生食水產(chǎn)品中致病菌的快速、定量檢測(cè)，構(gòu)建了副溶血性弧菌及單增李斯特菌的多重RT-PCR體系。對(duì)東南沿海地區(qū)的92份生食水產(chǎn)品樣品進(jìn)行檢測(cè)，并同國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的變化趨勢(shì)進(jìn)行分析?？焖贆z測(cè)結(jié)果在36 h后得到，國(guó)標(biāo)方法的結(jié)果在3-5 d后得到；經(jīng)過(guò)比對(duì)，二者檢出率相同，致病菌總體檢出率為41.30%：其中副溶血性弧菌檢出率為39.13%，單增李斯特菌檢出率為20.65%。比對(duì)結(jié)果表明多重RT-PCR方法具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；對(duì)檢出率的分析表明東南沿海地區(qū)生食水產(chǎn)品中致病菌污染情況較為嚴(yán)重，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)管理及控制。

多重RT-PCR；快速檢測(cè)；生食水產(chǎn)品；致病菌

1 前言

生食水產(chǎn)品因其味道鮮美受到很多人的喜愛(ài)，然而生食水產(chǎn)品的安全狀況尤其是食源性致病菌污染不容忽視[1-4]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是重要的食源性致病菌[5]，但國(guó)標(biāo)方法的檢測(cè)需要3-5 d，操作很復(fù)雜且不具有高通量性，而傳統(tǒng)PCR方法則由于死菌DNA的污染易造成假陽(yáng)性或提取方法受限造成假陰性[6]。本項(xiàng)目采用多重RT-PCR方法，通過(guò)DNA提取試劑盒提取DNA，并設(shè)計(jì)多重引物與探針，避免了假陽(yáng)性和假陰性的產(chǎn)生，是一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)的定量檢測(cè)方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗(yàn)樣本

對(duì)上海市銅川路水產(chǎn)市場(chǎng)、上海市百川路水產(chǎn)市場(chǎng)、上海市東方國(guó)際水產(chǎn)市場(chǎng)、浙江省寧波市路林水產(chǎn)市場(chǎng)、福建省廈門市中埔水產(chǎn)市場(chǎng)所售三文魚(yú)、金槍魚(yú)、銀鱈魚(yú)、牡蠣、北極貝、扇貝進(jìn)行取樣，共計(jì)采樣92份，每份250 g；檢測(cè)指標(biāo)為副溶血性弧菌和單增李斯特菌。

2.1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP：大連TaKaRa公司；DNA提取試劑盒：北京TIANGEN生化科技有限公司；各種培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司。

2.1.3 儀器設(shè)備

離心機(jī)、PCR儀、微量移液器：德國(guó)Eppendorf；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；BagMixer均質(zhì)器：法國(guó)Interscience；7500 Fast RT-PCR儀：美國(guó)Applied Biosystems。

2.1.4 引物及探針

所有引物及探針由上海Invitrogen公司合成。

2.2 方法

2.2.1 多重RT-PCR方法

2.2.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

（1）純培養(yǎng)細(xì)菌

副溶血性弧菌培養(yǎng)條件：取-80℃保存下甘油管中菌種液劃線接種于TCBS平板，挑取單菌落于10 mL 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯 （TSB，pH 8.0）試管中，在37℃轉(zhuǎn)速為180 rpm的搖床中培養(yǎng)10 h。

（2）單增李斯特菌培養(yǎng)

取-80℃保存下甘油管中菌種液劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂 （TSA）平板，挑取單菌落于10mL TSB試管中，在37℃轉(zhuǎn)速180rpm的搖床中培養(yǎng)18h。

（3）樣品培養(yǎng)

副溶血性弧菌：取樣品25 g放入無(wú)菌均質(zhì)袋，加入225 mL 3%氯化鈉TSB，均質(zhì)后37℃培養(yǎng)18 h；

單增李斯特菌：取樣品25 g放入無(wú)菌均質(zhì)袋，加入225 mL TSB，均質(zhì)后37℃培養(yǎng)24 h。

2.2.1.2 細(xì)菌DNA提取

支架搭設(shè)方案為系梁支架采用滿堂插扣式支架，支架布置根據(jù)系梁截面位置受力情況的不同分區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)。我橋采用鋼管支架滿布式搭設(shè)，左右幅系梁分別搭設(shè)，寬度與系梁每側(cè)加寬1m，縱向間距0.4m，橫向間距0.6m。中橫梁處搭設(shè)寬度每側(cè)加寬1m，縱向間距0.8m，橫向間距0.9m。為保證穩(wěn)定性，立桿沿豎向每1.35m布設(shè)橫向拉桿。

根據(jù)TIANamp DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取DNA。其中有兩處優(yōu)化：溶菌酶處理時(shí)間延長(zhǎng)為1 h，蛋白酶K處理時(shí)間延長(zhǎng)為2 h[7]。

2.2.1.3 引物及探針設(shè)計(jì)

引物及探針設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表1。

表1 TaqMan引物及探針序列

2.2.1.4 多重RT-PCR體系及反應(yīng)條件[7]

20μL 的多重 RT-PCR 反應(yīng)體系為：2.0 μL 10×PCR 緩沖液，1.2 μL MgSO4溶液 （50 mmol/L），0.5 μL dNTPs（10 mmol/L），0.2 μL Taq 酶（5 U/μL），二對(duì)引物（10 μmol/L）各 0.5 μL，二對(duì)探針（10 μmol/L）各 0.2 μL，1.0 μL 模板 DNA，加 ddH2O 至 20 μL。

RT-PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 2 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共進(jìn)行40次循環(huán)。反應(yīng)結(jié)果利用儀器自帶軟件7500 Software v2.0.6進(jìn)行分析。

2.2.1.5 多重RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建及擴(kuò)增效率計(jì)算

直接平板技術(shù)法作為以上標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)照（X軸）：將攜帶不同菌量的純培養(yǎng)物分別涂布于TCBS瓊脂以及PALCAM瓊脂，37℃下兩種選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)時(shí)間分別為18 h和24 h。利用菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果和多重實(shí)時(shí)熒光PCR輸出的CT值構(gòu)建反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算曲線的斜率 （slope），利用公式E=10-1/slope-1計(jì)算多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率。

2.2.2 國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法

取樣品25 g放入無(wú)菌均質(zhì)袋，加入225 mL 3%氯化鈉堿性蛋白胨水，均質(zhì)后進(jìn)行副溶血性弧菌檢驗(yàn)[11]；取樣品25 g放入無(wú)菌均質(zhì)袋，加入225 mL LB1增菌液，均質(zhì)后進(jìn)行單增李斯特菌檢驗(yàn)[12]。

2.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel 2010進(jìn)行作圖，并利用χ2檢驗(yàn)等方法分析事件差異。

3 結(jié)果

3.1 多重RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率

兩種致病菌的多重RT-PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。副溶血性弧菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：RT-PCR（Log CFU/g）=41.536-3.175×Viable counts （Log CFU/mL），R2=0.995；單增李斯特菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：RTPCR（Log CFU/g）=43.205-3.073×Viable counts（Log CFU/mL），R2=0.998。該方法對(duì)于副溶血性弧菌和單增李斯特菌的擴(kuò)增效率分別為107%和112%，結(jié)果表明該方法具有很好的穩(wěn)定性可以用于檢測(cè)樣品中的副溶血性弧菌和單增李斯特菌。

圖1 兩種致病菌多重RT-PCR方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 各種生食水產(chǎn)品致病菌檢出率

各種生食水產(chǎn)品致病菌檢出率見(jiàn)表2。快速檢測(cè)結(jié)果在36 h后得到，而國(guó)標(biāo)方法的結(jié)果則在3-5 d后得到，經(jīng)過(guò)比對(duì)二者檢出率相同。致病菌總體檢出率為41.30%，其中副溶血性弧菌檢出率為39.13%，單增李斯特菌檢出率為20.65%。由于有的樣品兩種致病菌均檢出，有的則只檢出一種，因此單個(gè)檢出率相加會(huì)與總體檢出率不同。副溶血性弧菌檢出率最高的是牡蠣，其次是扇貝，檢出率最低的是金槍魚(yú)。單增李斯特菌檢出率最高的是牡蠣，其次是扇貝，檢出率最低的是金槍魚(yú)。

表2 各種生食水產(chǎn)品致病菌檢出率

3.3 不同調(diào)查時(shí)間檢出率比較

選取食用生食水產(chǎn)品較多的5-8月份，調(diào)查致病菌隨季節(jié)變化的檢出情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。5月份取樣量較少，僅為5個(gè)，6月18個(gè)，7月27個(gè)，8月42個(gè)。圖2顯示，致病菌檢出率呈現(xiàn)出逐步升高的趨勢(shì)。

圖2 不同調(diào)查時(shí)間致病菌檢出率變化趨勢(shì)

3.4 不同包裝情況檢出率比較

生食水產(chǎn)品基本都是兩種包裝及銷售的形式，即散裝冰鮮和真空包裝冷凍銷售，通過(guò)調(diào)查兩種不同形式產(chǎn)品的檢出率可以指引消費(fèi)者選擇更安全的產(chǎn)品。兩種包裝形式致病菌檢出情況見(jiàn)圖3。圖3顯示，真空包裝冷凍產(chǎn)品檢出率明顯低于散裝冰鮮產(chǎn)品，但兩者隨月份的增加都是上升的趨勢(shì)。

圖3 不同包裝情況致病菌檢出率時(shí)間變化趨勢(shì)

4 討論

張輝等[13]針對(duì)hlyA基因建立的PCR方法，具有較強(qiáng)的特異性。該方法對(duì)純培養(yǎng)物的最低檢測(cè)限為7.3 CFU/mL，對(duì)模擬污染的生豬肉和蔬菜的檢測(cè)低限為4 CFU/g，牛奶為4 CFU/mL。應(yīng)用該方法對(duì)285份食品樣品檢測(cè)，17份樣品呈陽(yáng)性，與常規(guī)的分離培養(yǎng)方法完全一致。Omiccioli等[9]通過(guò)雙標(biāo)記的探針和對(duì)熔解曲線的分析建立了能同時(shí)檢測(cè)牛奶中廣泛存在的沙門氏桿菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157病原體的多元實(shí)時(shí)定量PCR，通過(guò)可以同時(shí)使病原菌增殖的增菌步驟，在2 d內(nèi)完成對(duì)5組25 mL生牛奶中每一種病原菌1 CFU的檢測(cè)。

2010-2011年上海浦東新區(qū)食品藥品監(jiān)督所對(duì)上海市各類生食水產(chǎn)品病原菌污染情況進(jìn)行了檢測(cè)，共檢測(cè)樣品204份，檢出致病菌27份，檢出率13.24%[14]。本項(xiàng)目調(diào)查中致病菌檢出率高達(dá)41.30%，從檢出的致病菌種類來(lái)看，副溶血性弧菌檢出率高于單增李斯特菌，這說(shuō)明副溶血性弧菌是生食水產(chǎn)品中最常見(jiàn)的致病微生物。主要原因是生食水產(chǎn)品大多都是海產(chǎn)品，而海水的鹽度非常適合副溶血性弧菌的生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)比散裝冰鮮產(chǎn)品及真空包裝冷凍產(chǎn)品的感染情況可以看出，散裝冰鮮產(chǎn)品感染率遠(yuǎn)高于后者。一方面可能是魚(yú)體自身感染的細(xì)菌，但更大的可能是銷售中的交叉污染造成，因?yàn)樘鞖庋谉?，魚(yú)肉中細(xì)微的變質(zhì)肉眼看不出來(lái)，但一旦堆放在一起銷售，就很容易造成交叉污染。而真空包裝冷凍產(chǎn)品也有檢出，一方面可能是魚(yú)體自身感染的細(xì)菌，也有可能是加工企業(yè)管理不嚴(yán)格造成的交叉污染或者加工工具的污染。

從時(shí)間變化上來(lái)看，隨著由春入夏氣溫升高，致病菌的檢出率上升，這與純培養(yǎng)狀態(tài)下細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線相吻合。

通過(guò)本次調(diào)查可以看出，生食水產(chǎn)品中病原微生物感染情況很嚴(yán)重，食用不當(dāng)可能會(huì)引發(fā)群體腹瀉等食品安全事件。在爆發(fā)突發(fā)性食品安全事故時(shí)，快速溯源非常重要，有利于控制發(fā)病源進(jìn)而控制疫情的蔓延。在調(diào)研中，很多經(jīng)營(yíng)者所說(shuō)的產(chǎn)品原產(chǎn)地經(jīng)證實(shí)有部分不屬實(shí)，以次充好、以假亂真現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。如果消費(fèi)者或是政府監(jiān)管部門能隨時(shí)查到商品來(lái)源及產(chǎn)品信息，對(duì)突發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的控制以及消費(fèi)者權(quán)益的保障都有利。同時(shí)消費(fèi)者自身很關(guān)注食品安全，但是由于生食性水產(chǎn)品烹飪不當(dāng)引發(fā)的食品安全事件也很多，主要是因?yàn)橄M(fèi)者接收信息范圍窄，有時(shí)尚未意識(shí)到自己飲食的方式不安全，這就需要政府積極引導(dǎo)。根據(jù)本項(xiàng)目的調(diào)查結(jié)果，食用散裝冰鮮產(chǎn)品感染疾病風(fēng)險(xiǎn)較大，可以引導(dǎo)消費(fèi)者食用真空包裝冷凍保藏的產(chǎn)品。

5 結(jié)論

本研究建立了快速、定量檢測(cè)水產(chǎn)品中副溶血性弧菌及單增李斯特菌的多重RT-PCR方法，通過(guò)對(duì)東南沿海地區(qū)的92份生食水產(chǎn)品樣品的檢測(cè)表明，致病菌總體檢出率為41.30%，其中副溶血性弧菌檢出率為39.13%，單增李斯特菌檢出率為20.65%。該方法內(nèi)在36 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中致病菌的定量檢測(cè)，遠(yuǎn)快于國(guó)標(biāo)方法，具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)檢測(cè)結(jié)果分析表明東南沿海地區(qū)生食水產(chǎn)品中致病菌污染情況較為嚴(yán)重，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)管理及控制。

[1]高培.生食水產(chǎn)品食用安全性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2005，（5）：202-205.

[2]秦品章.生食水產(chǎn)品的衛(wèi)生 （綜述）[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2000，（5）：40-43.

[3]鄭理.上海市熗、醉小水產(chǎn)品衛(wèi)生狀況的調(diào)查研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，1996，8（1）：41-43.

[4]鄭鵬然，周樹(shù)南.食品衛(wèi)生全書(shū)[M].北京：紅旗出版社，1996：1415-1426.

[5]戴昌芳，方悅怡，嚴(yán)紀(jì)文，等.生食水產(chǎn)品常見(jiàn)病原微生物污染與安全性評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生，2006，（4）：449-450.

[6]劉海泉，趙強(qiáng)，孫曉紅，等.多重PCR快速檢測(cè)食品中的單核細(xì)胞增生性李斯特菌[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（23）：4893-4900.

[7]Zhaohuan Zhang，Haiquan Liu，Yang Lou，etal.Quantifying viableVibrioparahaemolyticusandListeriamonocytogenessimultaneously in raw shrimp[J].Appl Microbiol Biotechnol，2015，99：6451-6462.

[8]Nordstrom J L，Vickery M C L，Blackstone G M，etal.Developmentofamultiplexreal-timePCR assaywith an internal amplification controlfor the detection of totaland pathogenicVibrio parahaemolyticusbacteria in oysters[J].Appl Environ Microbiol，2007，73：5840-5847.

[9]Omiccioli E，Amagliani G，Brandi G，et al.A new platform for Real-Time PCR detection ofSalmonellaspp.，Listeria monocytogenesand Escherichia coli O157 in milk[J].Food Microbiol，2009，26：615-622.

[10]Zhang Z H，Xiao L L，Lou Y，et al.Development of a multiplex real-time PCR method for simultaneous detection ofVibrio parahaemolyticus，Listeria monocytogenesandSalmonellaspp.in raw shrimp[J].Food Control，2015，51：31-36.

[11]GB 4789.7-2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)[S].

[12]GB 4789.30-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)[S].

[13]張輝，王興龍.食品中單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌PCR快速檢測(cè)[J]. 食品科學(xué)，2008，29（4）：324-327.

[14]湯志榮，張磊，騰迪云.上海市生食水產(chǎn)品安全監(jiān)管研究[J].上海食品藥品監(jiān)管情報(bào)研究，2012，12（119）：18-21.

Rapid Detection of Pathogen Pollution in Raw Seafood in the Southeast Coastal City by Multiple RT-PCR

XIE Qingchao1，3，4， LI Xiang2， ZHAO Yong1，3，4， HUANG Xinxin2， PAN Yingjie1，3，4，GUO Dehua2*， LIU Haiquan1，3，4，5**
（1.College of Food Science and Technology， Shanghai Ocean University， Shanghai， 201306；2.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau；3.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing&Preservation；4.Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation（Shanghai）， Ministry of Agriculture 5.Engineering Research Center of Food Thermal-processing Technology， Shanghai Ocean University）

A multiple real time polymerase chain reaction （RT-PCR） system was developed to detectVibrio parahemolyticusandListeria monocytogenesin raw seafood quickly and quantitatively.92 samples of raw seafood which were sampled in the southeast coastal city of China were tested and compared with standard methods，then analysis detectable rate variation tendency in time.The rapid test results were obtained 36 h later and standard methods test results were obtained 3-5 d later，both of the two methods had same detectable rate.The total detectable rate of pathogens was 41.30%，and the detectable rate ofVibrio parahemolyticusandListeria monocytogeneswere 39.13% and 20.65%.The comparison results showed that multiple RT-PCR method is rapid，sensitive and specific.The investigation results showed that pathogens pollution in raw seafood in the southeast coastal city was relatively serious，and the relevant departments should strengthen the management.

Multiple RT-PCR；Rapid Detection；Raw Seafood；Pathogen

TS207.4；Q789

E-mail：qcxie@shou.edu.cn；*通訊作者E-mail：guodeh@shciq.gov.cn；**通訊作者E-mail：hqliu@shou.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （31571917，31671779）；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 （2015第4-8號(hào)、2016第1-1號(hào)）；上海市教委曙光計(jì)劃 （15SG48）

2017-04-06