PD-1和PD-L1在原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌的表達情況和其臨床意義

張鑫 郭志華 李京沛 黃偉哲

PD-1和PD-L1在原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌的表達情況和其臨床意義

張鑫 郭志華 李京沛 黃偉哲

目的 檢測分析PC組織中PD-1和PD-L1的表達情況及其與原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌(LELC)患者臨床病理生理特征的相關性。方法 應用免疫組織化學法檢測21例原發(fā)性肺LELC石蠟包埋組織標本中PD-1和PD-L1的蛋白表達情況, 對腫瘤組織腫瘤細胞與免疫細胞中PD-L1和PD-1的表達進行分析評價。結(jié)果 21例患者中, 原發(fā)性肺LELC腫瘤細胞的PD-1、PD-L1陽性表達率分別為14%(3/21)和57%(12/21), 原發(fā)性肺LELC的腫瘤細胞PD-L1陽性表達率明顯高于PD-1的陽性表達率(P＜0.05)。原發(fā)性肺LELC腫瘤細胞周圍免疫細胞的PD-1、PD-L1陽性表達率分別為47.6%(10/21)和42.9%(9/21), 免疫細胞的PD-1、PD-L1陽性表達率均較高, 比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。原發(fā)性肺LELC腫瘤組織及腫瘤細胞周圍T細胞的PD-1、PD-L1的陽性表達在患者的不同性別、年齡、時期、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結(jié)論 PD-L1在原發(fā)性肺LELC的腫瘤細胞與免疫細胞中有40%以上的陽性表達率, PD-1在原發(fā)性肺LELC腫瘤細胞陽性表達率較低, 但在免疫細胞的陽性表達率＞40%。表明PD-1和PD-L1的陽性表達可能與原發(fā)性肺LELC的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關性。

原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌； PD-1； PD-L1

原發(fā)性肺淋巴上皮瘤樣癌(lymphoepithelioma-like carcinoma, LELC)是臨床上較為少見的腫瘤, Begin等［1］首次報道該疾病, 有研究認為原發(fā)性肺LELC好發(fā)于不吸煙的青年, 較其他組織學類型肺癌平均年齡小、預后好［2］, 但仍具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力。它與EB病毒感染有一定關系, 具有人種和地理分布特點, 該病在亞洲人群多見, 轉(zhuǎn)移率較低, 患者預后較好, 但該病較少見, 易漏診和誤診, 部分晚期患者, 臨床治療仍較困難。腫瘤的免疫治療是目前研究的主要熱點之一, T淋巴細胞是介導腫瘤免疫應答的重要效應細胞, 免疫檢查位點PD-1(programmed Death 1)與其配體PD-L1(programmed death ligand-1)可以負性調(diào)控T細胞介導的腫瘤殺傷反應,介導腫瘤免疫逃逸, 促進腫瘤生長［3］。PD-1與PD-L1抗體可阻斷這一逃逸信號, 調(diào)動T細胞攻擊癌細胞。此外, 腫瘤浸潤淋巴細胞是腫瘤微環(huán)境中的主要組成部分, 有研究表明［4］癌旁的單核巨噬細胞通過PD-L1 分子表達逃逸T細胞免疫, 目前, 針對PD-1與PD-L1的靶點抗體藥物, 已在多種惡性腫瘤的免疫治療中取得了良好的效果［5,6］, 是否在原發(fā)性肺LELC治療中獲益, 仍有待研究。本研究回顧性分析本院胸外科2016年6月～2017年6月施行1456例肺部手術, 經(jīng)手術病理證實的21例原發(fā)性肺LELC, 占同期肺癌手術的1.4%(21/1456), 研究原發(fā)性肺LELC腫瘤組織中PD-1與PD-L1的表達情況和與患者的臨床病理生理特征的關系,為進一步針對PD-1和PD-L1在原發(fā)性肺LELC的免疫治療提供理論依據(jù), 總結(jié)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年6月～2017年6月在廣州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸外科接受肺手術的患者1456例, 術后病理確診原發(fā)性肺LELC共21例, 患者術前均未接受化療。其中男9例, 女12例；年齡38～64歲, 平均年齡(51.30± 4.23)歲；2例有吸煙史, 19例無吸煙史；21例患者均接受了手術治療, 具有明確的病理診斷, 所有病例的標本均做EB病毒(EBV)原位雜交檢測, 結(jié)果均為EBER(+)；其中, 伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者肺門及縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例。按照WHO肺癌分型標準及國際抗癌聯(lián)盟(UICC)(2009年)新國際肺癌分期標準進行分型、分期；Ⅰ 期7例, Ⅱ期7例, Ⅲ期7 例。每例患者的病理檢測均經(jīng)本院2名病理科醫(yī)師會診確診, 組織標本的應用均通過醫(yī)院倫理委員會批準和患者同意。

1.2 免疫組化 所有標本采用10%的中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋, 4 μm厚連續(xù)切片。應用原裝脫蠟液中經(jīng)過40 min脫洗進行脫蠟處理, 經(jīng)無水酒精、95%酒精、85%酒精及70%酒精各10 min進行水化, 在微波爐中使用相應的抗原修復液進行腫瘤組織的抗原修復30 min, 滴加抗體, 孵育, 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色, 蘇木精復染, 梯度酒精脫水干燥, 二甲苯透明, 中性樹膠封片。PD-1抗體是來自SIGMA公司的兔抗人單克隆抗體, 經(jīng)1∶50稀釋后使用。PD-L1檢測采用羅氏 VENTANA PD-L1 (SP142)分析試劑盒。

1.3 判定標準PD-1和PD-L1以細胞質(zhì)或細胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。PDL1表達采用半定量積分法,結(jié)合染色強度和陽性細胞百分比來評定陽性表達。

1.3.1 PD-1 陽性結(jié)果判斷［7,8］以細胞計數(shù)法評估：低倍鏡下觀察整張切片, 尋找淋巴細胞密度較高處, 在其中隨機選擇5個高倍視野(×400), 每個視野計數(shù)100個細胞中PD-1 陽性細胞數(shù), 求其平均值作為PD-1 陽性表達的細胞數(shù)。以所有病例PD-1 陽性細胞數(shù)的均數(shù)為閾值, 大于該閾值即為PD-1 陽性表達, 低于該閾值即為PD-1陰性表達。

1.3.2 PD-L1陽性結(jié)果判斷 使用Roche(SIX：RO, ROG;OTCQX：RHHBY)診斷VENTAN APD-L1 (S P 142)分析試劑盒,按說明書測定腫瘤浸潤免疫細胞PD-L1表達水平。PD-L1狀態(tài)的確定具有指示特異性, 基于任何強度的P D-L1表達腫瘤浸潤性免疫細胞占據(jù)的腫瘤面積的比例(%I C)或表達PD-L1的腫瘤細胞的百分比(%T C)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗或Fish精確檢驗法, 分別計算PD-1和PD-L1陽性患者的臨床特征及病理類型的關系。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1、PD-L1在腫瘤組織及腫瘤細胞周圍T細胞的表達 21例患者中, 原發(fā)性肺LELC腫瘤細胞的PD-1、PD-L1陽性表達率分別為14%(3/21)和57%(12/21), 原發(fā)性肺LELC的腫瘤細胞PD-L1陽性表達率明顯高于PD-1的陽性表達率(P=0.001＜0.05)。原發(fā)性肺LELC腫瘤細胞周圍免疫細胞的PD-1、PD-L1陽性表達率分別為48%(10/21)和43%(9/21),免疫細胞的PD-1、PD-L1陽性表達率均較高, 比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.2 原發(fā)性肺LELC腫瘤組織及腫瘤細胞周圍T細胞的PD-1、PD-L1的陽性表達 原發(fā)性肺LELC腫瘤組織及腫瘤細胞周圍T細胞的PD-1、PD-L1的陽性表達在患者的不同性別、年齡、時期、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。由于本組病例數(shù)不多, 不能分析出此類患者的PD-1和PD-L1的兩者陽性表達與吸煙是否存在相關性。雖然肺LELC具有一定的侵襲和轉(zhuǎn)移能力, 但總體的惡性程度低, 本組病例入組時間較短, 不足以分析PD-1、PD-L1的陽性表達與患者預后是否有關。見表1。

表1 21例肺類癌患者臨床特征和PD-1、PD-L1在腫瘤細胞與免疫細胞陽性表達情況［n(%)］

2.3 P63、CK5/6(+)、EBER檢測 P63陽性率為91%(19/21), CK5/6陽性率為86%(18/21), EBER陽性率為100%(21/21)。

3 討論

原發(fā)性肺LELC是發(fā)病率較低的惡性腫瘤, 文獻報道的病例較少, 約占全部肺癌的0.92%, 大多數(shù)來自廣東、香港和臺灣地區(qū), 本組病例占同期肺手術的1.4%(21/1456), 與文獻報道相似［9］, 與其他類型肺惡性腫瘤相比, 原發(fā)性肺LELC缺乏特異性的臨床表現(xiàn), 確診以病理診斷為主。有研究［10］認為原發(fā)性肺LELC與EBV的感染有密切相關性, 其組織學特點與鼻咽癌的相似性, 其報道14例病例均來自廣東地區(qū), EBER檢測的陽性率達93%, 本組21例患者的手術樣本均做EBER檢測, 陽性率100%, 與上述文獻相似。原發(fā)性肺LELC無性別偏好, 發(fā)病年齡輕, 中位年齡41～56歲［11］。本組患者男9例, 女12例, 中位年齡55歲, 其中年齡最小患者僅38歲,相關研究報道顯示被確診的肺LELC 患者中非吸煙患者達64%～80%, 本組患者中非吸煙19例, 吸煙2例［12］。病理組織學檢查、免疫組化染色以及EBER檢測是診斷原發(fā)性肺LELC的主要方法。高表達的CK5/6、P63等高表達提示肺LELC來源于上皮組織, 歸屬于鱗狀細胞癌范疇［13］。EBER高表提示了原發(fā)性肺LELC的發(fā)生可能與EB病毒感染有關［1］。本組病例均做P63、CK5/6(+)、EBER免疫組化檢測, P63陽性率為91%(19/21),CK5/6陽性率為86%(18/21), EBER陽性率為100%(21/21)。與文獻報道相符。

由于原發(fā)性肺LELC 發(fā)病率較低, 對該病的治療方法多限于回顧性報道, 與其他非小細胞肺癌一樣, 手術仍是治療原發(fā)性肺LELC的主要方式, 對局部晚期的患者輔以化療和放療, 化療方案以GP方案運用最多, 近年來也有學者［14］在探索靶向治療和免疫治療, 均需要進一步的研究。目前, 腫瘤的免疫治療是研究的主要熱點, PD-1/PD-L1單抗已在多種腫瘤包括黑色素瘤、結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌、霍奇金淋巴瘤等中顯示顯著的臨床療效［15］, PD-1或(和)PD-L1的表達能否作為使用PD-1或PD-L1的阻斷劑治療有效與否的主要標記物, 但在許多的研究中PD-L1的表達仍被建議作為一個使用抗PD-1/PD-L1療法的標記。由于PD-1抗體生產(chǎn)產(chǎn)家的不同, 免疫組化染色的半定量統(tǒng)計的標準尚未統(tǒng)一和PD-陽性臨界值公認標準的缺乏, 本研究采用大多數(shù)文獻所采用的方法進行檢查, PD-L1表達的檢測方法則采用羅氏公司的VENTANA PD-L1 (SP142)試劑盒進行檢測。最近的研究［16］發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中最多的免疫細胞。腫瘤發(fā)生初期這類細胞負責識別并清除腫瘤細胞, 但隨著腫瘤的發(fā)展, 這類免疫細胞又會助力癌變細胞的擴散、轉(zhuǎn)移, 這一新發(fā)現(xiàn)將改進并擴大這一免疫療法的應用, 因此對腫瘤微環(huán)境免疫細胞的PD-1/PD-L1檢測, 可為免疫治療選擇藥物提供參考。

目前, 原發(fā)性肺LELC腫瘤組織與腫瘤腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的PD-1/PD-L1表達及抗PD-1/PD-L1治療的研究報道甚少。在本組原發(fā)性肺LELC患者中, 原發(fā)性肺LELC腫瘤細胞的PD-1和PD-L1的陽性表達率分別為為14%(3/21)和57%(12/21)；腫瘤微環(huán)境免疫細胞的PD-1和PD-L1的陽性表達率分別為48%(10/21)和43%(9/21), 這提示原發(fā)性肺LELC腫瘤細胞與免疫細胞具有較高的PD-L1的陽性表達率,均＞40%, 但腫瘤細胞的PD-1陽性表達率較低, ＜20%；腫瘤微環(huán)境免疫細胞的PD1陽性表達率則＞40%, Tecentriq是第三個在PD-1/PD-L1這個節(jié)點阻斷這個免疫抑制信號通路的藥物, 是首個PD-L1抗體藥［17］, 這些患者能否在針對PD-1和PD-L1抗體的治療中獲益目前仍缺乏相應的臨床研究, 仍需進一步研究, 為PD-1/PD-L抗體藥物在原發(fā)性肺LELC的臨床應用奠定基礎。

綜上所述, 原發(fā)性肺LELC 是少見肺部惡性腫瘤, 臨床表現(xiàn)無特異性, EBER 檢測結(jié)果對診斷可能有提示作用, 治療上仍以經(jīng)驗為主, 原發(fā)性肺LELC腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境免疫細胞具有較高的PD-L1的陽性表達率, 應用PD-1/PD-L抗體的免疫治療也許可以使原發(fā)性肺LELC患者在治療中獲益, 但需進一步的研究探討。

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2017-06-22］

510120 廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胸外科(張鑫郭志華 李京沛)；汕頭大學醫(yī)學院胸外科(黃偉哲)