滋腎育胎丸對腎陽虛型多囊卵巢綜合征模型小鼠血清抑制素B及干細(xì)胞因子的影響*

邢 佳 傅 萍# 陳婷婷

1 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

滋腎育胎丸對腎陽虛型多囊卵巢綜合征模型小鼠血清抑制素B及干細(xì)胞因子的影響*

邢 佳1傅 萍1#陳婷婷2

1 浙江省杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007 2 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

滋腎育胎丸 腎陽虛型 多囊卵巢綜合征 抑制素B 干細(xì)胞因子

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科常見的一種生殖功能障礙和代謝紊亂性疾病，其關(guān)鍵病理機(jī)制為卵泡發(fā)育異常和排卵障礙。近年來研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，抑制素B（INHB）、干細(xì)胞因子（SCF）與卵泡發(fā)育及排卵密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)以INHB、SCF為切入點(diǎn)，用cAMP/cGMP比值衡量小鼠模型的陰陽偏向，通過觀察滋腎育胎丸對腎陽虛型PCOS模型小鼠血清中INHB、SCF表達(dá)的影響，探討滋腎育胎丸的治療機(jī)制，為臨床運(yùn)用中醫(yī)藥診治腎陽虛型PCOS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：21日齡雌性ICR小鼠，54只，SPF級；浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將小鼠置于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心內(nèi)飼喂。實(shí)驗(yàn)期間同一室內(nèi)籠養(yǎng)，室溫18～22℃，12h光照，12h黑暗，自由飲水，飼料由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 藥物與試劑：滋腎育胎丸（60g裝），購自廣州白云山中一藥業(yè)有限公司；達(dá)英-35，由Schering GmbH& Co.Produktions KG提供，每粒含2mg醋酸環(huán)丙孕酮和0.035mg炔雌醇，使用時(shí)加蒸餾水制成0.3mg/kg混懸液；脫氫表雄酮（DHEA）粉劑，購自美國sigma公司；注射用大豆油（用于溶解DHEA），購自九三集團(tuán)海爾濱眾和商貿(mào)有限公司；氫化可的松注射液，購自天津金耀藥業(yè)有限公司；所有小鼠El isa試劑盒均由杭州昊鑫生物科技股份有限公司提供。

1.3 分組與飼養(yǎng)：適應(yīng)性喂養(yǎng)2日后，將21日齡雌性ICR小鼠隨機(jī)分為6組，分別設(shè)空白組、模型組、滋腎育胎丸低劑量組、滋腎育胎丸中劑量組、滋腎育胎丸高劑量組、達(dá)英-35組，每組各9只，全程喂以普通飼料。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 動(dòng)物模型的建立：采用脫氫表雄酮聯(lián)合氫化可的松法誘導(dǎo)腎陽虛型PCOS小鼠模型。模型組、滋腎育胎丸低劑量組、滋腎育胎丸中劑量組、滋腎育胎丸高劑量組、達(dá)英-35組每日予頸背部皮下注射9mg/100g DHEA油溶液0.1ml，26日后，加用氫化可的松25mg/kg體重后肢肌肉注射，日1次，連續(xù)14日；空白組每日予頸背部皮下注射注射用大豆油0.1ml，26日后，加用等體積生理鹽水后肢肌肉注射，日1次，連續(xù)14日。

1.4.2 預(yù)防性治療：滋腎育胎丸低、中、高劑量組全程分別予滋腎育胎丸1.13g/kg、4.50g/kg、2.25g/kg灌胃，共40天；達(dá)英-35組全程予達(dá)英-35蒸餾水混懸液0.3mg/kg灌胃，共40天；空白組、模型組予等體積生理鹽水灌胃。

1.4.3 標(biāo)本采集：末次給藥后12小時(shí)，對小鼠行頸椎脫臼法處死并采集標(biāo)本。

1.5 觀察指標(biāo)：①實(shí)驗(yàn)開始后每3天觀察一次小鼠一般狀態(tài)（活動(dòng)度、被毛顏色及光澤度等）；②從28日齡起小鼠陰門開放后每日行陰道涂片觀察脫落細(xì)胞改變直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束；③酶聯(lián)免疫吸附法（El isa）測定血清黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睪酮（T）、雌二醇（E2）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、抑制素B（INHB）、干細(xì)胞因子（SCF）水平。④對所取卵巢進(jìn)行病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。全部計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行方差分析或t檢驗(yàn)。兩組計(jì)量資料間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，首先行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性，則選用LSD或SNK法，若方差不齊，則選用Tamhane’s T2或Dunnet t's T3法。雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般狀態(tài)的變化：空白組小鼠喜動(dòng)活躍，動(dòng)作敏捷，大便正常，毛色光澤，肢尾溫暖，睡眠時(shí)間正常。模型組小鼠精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，大便稀溏，群聚蜷縮，活動(dòng)減少，毛色黯淡，肢尾冷，睡眠時(shí)間延長。各治療組小鼠造模成功后表現(xiàn)出與模型組相似的陽虛癥狀，隨著用藥時(shí)間的延長，部分小鼠精神狀態(tài)較前好轉(zhuǎn)，活動(dòng)增加，被毛光澤恢復(fù)，大便成形。

2.2 各組小鼠陰道脫落細(xì)胞的變化：空白組小鼠以4-5天為1個(gè)正常動(dòng)情周期，呈現(xiàn)動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情間期、動(dòng)情后期4個(gè)時(shí)期規(guī)律出現(xiàn)。模型組小鼠脫落細(xì)胞持續(xù)角化，完全失去正常動(dòng)情周期。各治療組小鼠在觀察初期脫落細(xì)胞主要表現(xiàn)為無核角化細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞，失去正常動(dòng)情周期，隨著用藥時(shí)間的延長，部分小鼠動(dòng)情周期逐漸恢復(fù)正常。

2.3 各組小鼠血清性激素水平、cAMP/cGMP比值的改變：見表1、表2。

表1 各組小鼠血清性激素水平的變化（±s，n=9）

表1 各組小鼠血清性激素水平的變化（±s，n=9）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

分組空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組達(dá)英-35組LH（ng/L）1412.99± 23.19 1787.09±102.44★1656.85± 38.02 1512.19± 12.38 1467.46± 29.48▲1461.33± 27.13▲T（nmol/L）134.62±1.84 147.22±3.06★144.91±4.02 138.25±2.34 136.16±2.61▲137.64±1.78▲E2（ng/L）49.07±0.50 34.52±3.89★38.60±0.94 41.33±3.32 45.70±1.40▲44.75±1.33▲FSH(IU/L) 8.08±0.24 7.38±0.16★7.45±0.10 7.56±0.11 7.97±0.07▲7.74±0.15▲LH/FSH 5.25±0.16 7.27±0.36★6.67±0.17 6.00±0.12 5.53±0.14▲5.67±0.20▲

表2 各組小鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP比值的變化（±s，nmol/L，n=9）

表2 各組小鼠血清cAMP、cGMP、cAMP/cGMP比值的變化（±s，nmol/L，n=9）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組達(dá)英-35組cAMP 8.41±0.37 7.06±0.58★7.43±0.29 7.58±0.43 7.92±0.24 7.77±0.23 cAMP/cGMP 1.80±0.14 1.28±0.13★1.38±0.11 1.46±0.10▲1.61±0.84▲1.54±0.77▲cGMP 4.67±0.21 5.54±0.23★5.40±0.38 5.20±0.16 4.93±0.20 5.07±0.18

2.4 滋腎育胎丸對小鼠血清INHB、SCF的影響：見表3。

表3 滋腎育胎丸對小鼠血清INHB、SCF的影響（±s）

表3 滋腎育胎丸對小鼠血清INHB、SCF的影響（±s）

注：與空白組比較，★P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

SCF（ng/L）104.89±7.68 63.95±8.20★77.48±6.05 84.87±7.72▲91.45±9.92▲89.51±7.89▲例數(shù)組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組達(dá)英-35組9 9 9 9 9 9 INHB（ng/L）16.18± 6.62 29.08± 8.41★26.00±12.59 24.93± 8.22 18.27± 8.12▲28.30± 9.98

2.5 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的改變：空白組（A、B）卵巢內(nèi)存在各級卵泡，顆粒細(xì)胞層致密、排列整齊，膜細(xì)胞層薄，間質(zhì)細(xì)胞致密、排列整齊，白膜薄，表面光整。模型組（C、D）小鼠卵巢內(nèi)囊性擴(kuò)張的卵泡增多，卵泡腔顯著擴(kuò)張，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞及放射冠消失，顆粒細(xì)胞層變薄且排列疏松，膜細(xì)胞不規(guī)則增生、排列欠整齊，卵巢間質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，白膜增厚、表面欠光整。滋腎育胎丸低劑量組（E、F）、滋腎育胎丸中劑量組（G、H）部分小鼠卵巢病理切片顯示顆粒細(xì)胞層數(shù)較模型組略增多，卵泡膜細(xì)胞層較模型組略變薄。滋腎育胎丸高劑量組（I、J）和達(dá)英-35組（K、L）顆粒細(xì)胞層數(shù)較模型組明顯增多，形態(tài)規(guī)則，排列整齊，白膜和卵泡膜細(xì)胞層較模型組變薄。具體見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)

圖2 各組小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)

3 討論

多囊卵巢綜合征（PCOS）病理環(huán)節(jié)的根本在于卵泡發(fā)育異常和排卵障礙。陰陽學(xué)說[3]認(rèn)為，cAMP/cGMP比值能全面衡量機(jī)體的陰陽偏向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠卵巢病理切片符合小鼠PCO樣改變，結(jié)合小鼠血清性激素變化、cAMP/cGMP比值改變及腎陽虛癥狀，說明腎陽虛型PCOS小鼠模型建立成功。

現(xiàn)代學(xué)者研究[1，2]發(fā)現(xiàn)，INHB、SCF為卵巢局部因子，與卵泡的發(fā)育及排卵有著密切的關(guān)系。INHB是一種糖蛋白，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[1]血清INHB水平在PCOS患者中表達(dá)升高，推測INHB與PCOS的發(fā)病有關(guān)。Hendrix等研究發(fā)現(xiàn)[4]，過量的INHB抑制了垂體FSH的合成與分泌，使卵泡生長受阻并過早閉鎖，形成多囊卵巢。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠血清INHB水平高于空白組、FSH水平低于空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與以上結(jié)論相符。

SCF為多肽類物質(zhì)，是卵巢局部生長因子之一[5]。有關(guān)研究顯示[6]，較高水平的SCF有利于卵細(xì)胞的受精和優(yōu)質(zhì)胚胎的形成。SCF為酪氨酸激酶受體(c-kit)的配體，它與靶細(xì)胞上的c-kit受體結(jié)合，激活下游信號通路，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，抑制SCF/c-kit信號通路會(huì)影響原始卵泡發(fā)育、初級卵泡生長及體內(nèi)成熟卵泡的排出[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腎陽虛型PCOS小鼠血清SCF水平明顯低于空白組（P＜0.05），由此，我們推測SCF的表達(dá)水平下降可使SCF/c-kit信號通路的活性下調(diào)，進(jìn)而抑制卵泡發(fā)育及成熟卵泡的排出。

滋腎育胎丸是全國著名中醫(yī)婦科專家、廣州中醫(yī)藥大學(xué)羅元愷教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床上可用于多囊卵巢綜合征的治療。滋腎育胎丸由菟絲子、熟地黃、人參、杜仲、首烏、枸杞子、阿膠、鹿角霜、巴戟天、桑寄生、續(xù)斷、黨參、白術(shù)、艾葉、砂仁組成，以溫補(bǔ)腎陽為主，佐以益氣養(yǎng)血。方中菟絲子為君藥，能補(bǔ)腎益精固胎；人參、黨參、白術(shù)大補(bǔ)元?dú)猓宦菇撬a(bǔ)元陽、生精髓；配以巴戟天、杜仲、續(xù)斷、桑寄生益腎固沖；首烏、枸杞子、熟地黃、阿膠填補(bǔ)肝腎，滋陰養(yǎng)血；艾葉溫經(jīng)散寒，調(diào)經(jīng)止血；砂仁理氣和中。全方腎、肝、脾同治，能良好地促進(jìn)卵泡發(fā)育、誘發(fā)排卵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明滋腎育胎丸高劑量組小鼠的卵巢組織形態(tài)與空白組基本一致，且高劑量滋腎育胎丸能顯著降低腎陽虛型PCOS小鼠血清T、LH/FSH、INHB，升高血清E2、cAMP/cGMP、SCF，并能改善其腎陽虛癥狀，證明滋腎育胎丸對腎陽虛型PCOS有良好的治療作用。我們猜測其治療機(jī)制可能是通過降低INHB來解除INHB對FSH的過度抑制，同時(shí)增加SCF的表達(dá)，上調(diào)SCF/c-kit信號通路的活性，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育及排卵，糾正其內(nèi)分泌紊亂狀態(tài)，最終達(dá)到治療腎陽虛型PCOS的目的。

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2017-03-31

廣東省羅元愷滋腎育胎丸中青年科研基金項(xiàng)目滋腎育胎丸對腎虛型PCOS模型小鼠cAMP/cGMP、AMH、INHB、SCF影響的研究，編號：HX201502-140203；國家中醫(yī)藥管理局傅萍全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目，編號：國中醫(yī)藥人教發(fā)〔2014〕20號；浙江省傅萍名老中醫(yī)專家傳承工作室研究項(xiàng)目，編號：GZS2012023

# 通訊作者：傅 萍，E-mai l：fupingss@163.com