組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖凋亡的影響

黃玉琴

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院， 湖北 襄陽441000)

組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖凋亡的影響

黃玉琴

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院， 湖北 襄陽441000)

目的 探討MS-275對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法 MTT法檢測(cè)MS-275和順鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的影響，并計(jì)算半抑制濃度IC50；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MS-275和順鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡的影響；Western-Blot法檢測(cè)各組BCL2、survivin及p21蛋白的表達(dá)。結(jié)果 MS-275和順鉑兩單藥均可抑制SKOV3的增殖，各濃度組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),聯(lián)合用藥時(shí)可顯著降低順鉑半抑制濃度(P<0.05)；同時(shí)兩單藥組可促進(jìn)SKOV3細(xì)胞凋亡(P<0.05)，聯(lián)合用藥時(shí)凋亡作用更顯著(P<0.05)；MS-275和順鉑可顯著抑制SKOV3細(xì)胞BCL-2和survivin蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)p21的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 MS-275抗SKOV3細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡及增強(qiáng)順鉑敏感性的機(jī)制可能與抑制HDAC活性，抑制BCL-2和survivin蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21蛋白表達(dá)有關(guān)。

MS-275；順鉑；卵巢癌；SKOV3

(ChinJLabDiagn,2017,21:1448)

組蛋白去乙?；?HDACs)主要通過調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；癄顟B(tài)從而調(diào)控染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的表達(dá)。組蛋白的乙?；癄顟B(tài)由兩個(gè)酶家族調(diào)節(jié)：組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙酰化酶(HADCs)。HDACs家族分為18種不同亞型；Ⅰ類(HDAC1-3和8)、Ⅱ a類(HDAC4、5、7和9)、Ⅱ b類(HDAC6和10)、Ⅲ類(SIRT1-7)和Ⅳ(HDAC11)[1]。而HDAC抑制劑(HDACIs)可分為5類，包括短鏈脂肪酸、羥肟酸、環(huán)狀四肽、脂族酸和苯甲酰胺。其中MS-275是一種苯甲酰胺類HDAC抑制劑。在多種腫瘤實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，包括胰腺癌[2]、乳腺癌[3]、肺癌[4]及黑色素瘤[5]等實(shí)體腫瘤。本研究主要以卵巢癌SKOV3細(xì)胞為研究對(duì)象，探討MS-275對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖凋亡及化療敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

SKOV3細(xì)胞株購自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心，注射用順鉑(凍干型)購自齊魯制藥有限公司，MS-275購自美國(guó)Cayman公司，McCoy's 5A液體培養(yǎng)基購自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，MTT 試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗人BCL-2、survivin及p21抗體購自美國(guó)Santa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SKOV3細(xì)胞于McCoy's 5A液體培養(yǎng)基(10%胎牛血清)在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)，0.25%胰酶(含EDTA)消化傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/ml， 100 μl/孔接種于96孔板中，PBS填充邊緣孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)，MS-275(2、4、6、8、10 μmol/L)，DDP(2.5、5、10、20和40 μg/ml)，聯(lián)合用藥組為MS-275 (5 μmol/L)聯(lián)合DDP(2.5、5、10、20和40 μg/ml)濃度梯度處理各組細(xì)胞，設(shè)置3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔、對(duì)照孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入20 μl MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，后每孔加入150 μl Formanzan溶解液，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570nm下各孔吸光度，細(xì)胞抑制率%=1-(OD加藥孔-OD調(diào)零孔)/(OD對(duì)照孔-OD調(diào)零孔)。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

藥物處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液于15 ml離心管內(nèi)，2 ml PBS清洗，每孔加入0.25%胰酶400 μl，于培養(yǎng)箱消化約1 min，后將前述收集的細(xì)胞培養(yǎng)液加入6孔板終止消化，小心吹散細(xì)胞，收集細(xì)胞液于15 ml離心管內(nèi)，2 000 rpm離心3 min，棄上清，1 ml PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mlEP管內(nèi)，2 000 rpm離心3 min，棄上清，每管加入Annexin V-FITC結(jié)合液150 μl，Annexin V-FITC 5 μl，碘化丙啶染色液5 μl，避光室溫孵育20 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 Western-Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

各組藥物處理后細(xì)胞，細(xì)胞裂解液冰上處理30 min，取上清液，BCA測(cè)定蛋白含量，加入上樣Buffer，沸水浴5 min，SDS-PAGE凝膠電泳，分離后蛋白電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗(兔抗人BCL-2、survivin和p21多克隆抗體)在4℃條件下過夜12 h，分別加入HRP標(biāo)記羊抗兔抗體作用1 h，TBST洗膜3次， ECL顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1MS-275對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度MS-275及順鉑單藥處理SKOV3細(xì)胞48h后均能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖(見表1)，其中MS-275單藥組IC50為5.98±2.19μmol/L，順鉑單藥組IC50為11.39±3.04μg/ml。因此，聯(lián)合用藥組時(shí)MS-275固定濃度為5μmol/L，聯(lián)合用藥組與順鉑單藥組比較各濃度間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見表2)，同時(shí)聯(lián)合用藥組時(shí)順鉑IC50為5.60±2.35μg/ml，順鉑單藥組IC50與聯(lián)合用藥組順鉑IC50比較，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.876，P<0.05)，結(jié)果顯示，MS-275可顯著抑制SKOV3細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)SKOV3對(duì)順鉑的敏感性，降低順鉑的半抑制濃度。

表1 不同濃度MS-275和順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制率

表2 MS-275聯(lián)合順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞的抑制率

2.2 MS-275對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

依據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取MS-275濃度5 μmol/L，順鉑濃度10 μg/ml作用SKOV3細(xì)胞48 h后檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，兩單藥組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩單藥組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而聯(lián)合用藥組與兩單藥組細(xì)胞凋亡率相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(如圖1)。

圖1 MS-275對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

2.3 MS-275對(duì)SKOV3細(xì)胞BCL-2、survivin和p21表達(dá)的影響

Western結(jié)果顯示，MS-275可顯著增加SKO3細(xì)胞中p21蛋白的表達(dá)，降低survivin和bcl-2蛋白的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)與順鉑聯(lián)用時(shí)，p21蛋白表達(dá)更高，與兩單藥組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，survivin和bcl-2表達(dá)水平顯著降低，與兩單藥組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

圖2 MS-275對(duì)SKOV3細(xì)胞BCL-2、survivin和p21表達(dá)的影響

3 討論

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤，多數(shù)患者就診已屬晚期，手術(shù)治療和化療治療效果差，遠(yuǎn)期存活率低。近年來對(duì)卵巢癌的表觀遺傳學(xué)研究為卵巢癌的治療提供了一種新思路。卵巢癌惡性進(jìn)展的分子基礎(chǔ)包括遺傳和表觀遺傳學(xué)的改變，而基因的表達(dá)由表觀遺傳學(xué)控制，如DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等[6]。其中，組蛋白修飾是通過影響組蛋白之間的功能作用或組蛋白與DNA的連接而改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)。組蛋白的乙?；癄顟B(tài)由兩個(gè)酶家族調(diào)節(jié);它們是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白脫乙酰酶(HDAC)。HDAC家族分為四類：Ⅰ類(HDAC1-3和8)，Ⅱa類(HDAC4,5,7和9)，Ⅱb類(HDAC6和10)，Ⅲ類[sirtuins，(SIRT1-7)]和Ⅳ類(HDAC11)。近年來研究表明，賴氨酸殘基的乙?；癄顟B(tài)失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?；虻耐蛔儭⑦^表達(dá)或易位改變均可影響HAT和HDAC活性，從而使組蛋白乙酰化狀態(tài)失衡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。BCL-2基因的異?；罨瘏⑴c惡性腫瘤的增殖和凋亡，通常認(rèn)為，順鉑主要引起癌細(xì)胞DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而研究表明，BCL-2在卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性方面發(fā)揮了重要作用[7]。Survivin是凋亡家族成員，影響多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞存活、增殖和侵襲等，在大多數(shù)正常組織中，survivin表達(dá)極低，而在腫瘤組織中高表達(dá)，包括卵巢癌[8]。Survivin的高表達(dá)與腫瘤的惡性增殖、低凋亡、化療耐藥、轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)和不良預(yù)后密切相關(guān)[9，10]。p21是一種細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子，通過抑制Cyclin E-CDK2和Cyclin D1-CDK4的激活，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期，此外，通過調(diào)控細(xì)胞周期參與腫瘤細(xì)胞的凋亡[11]。

本文研究了MS-275單藥或聯(lián)合順鉑作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞，結(jié)果顯示，一定條件下，MS-275可顯著抑制SKOV3細(xì)胞活性，而與順鉑聯(lián)用時(shí)可增強(qiáng)順鉑敏感性，對(duì)細(xì)胞活性抑制作用更顯著。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，MS-275可誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡。此外，本文還檢測(cè)了SKOV3細(xì)胞中BCL-2、Survivin和p21蛋白表達(dá)情況，Western-Blot結(jié)果顯示，MS-275可抑制BCL-2和Survivin蛋白的表達(dá)，增加p21的表達(dá)水平。由此說明，MS-275抗SKOV3細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡及增強(qiáng)順鉑敏感性的機(jī)制可能與抑制HDAC活性，抑制BCL-2和survivin蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21蛋白表達(dá)有關(guān)。

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Effect of histone deacetylase inhibitor MS-275 on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cell line SKOV3

HUANGYu-qin.

(XiangYangNo.1Pelople’sHospital,HubeiUniversityofMedicine，Xiangyang441000，China)

Objective To investigate the effect of MS-275 on the proliferation and apoptosis and its mechanism of SKOV3 cells.Methods The proliferation inhibitory rates of SKOV3 cells treated with MS-275 or DDP alone and the combination of MS-275 and DDP were detected by MTT assay，and calculate the half inhibitory concentration (IC50).The apoptosis rate of SKOV3 cells treated with MS-275 or DDP alone and the combination of MS-275 and DDP were determined by flow cytometry.The expression levels of BCL-2、survivin and p21 proteins in SKOV3 cells were examined by Western-Blotting.Results MS-275 and cisplatin alone could inhibit the proliferation of SKOV3,each concentration group has significant difference(P<0.05),United can significantly reduce the half inhibitory concentration of cisplatin(P<0.05).MS-275 or DDP alone can promote apoptosis of SKOV3 cell(P<0.05),MS-275 and cisplatin significantly inhibited the expression of BCL-2 and surviving,and enhanced the expression of p21 in SKOV3 cells (P<0.05).Conclusion The mechanism of MS-275 anti-SKOV3 cell proliferation,promoting apoptosis and enhancing cisplatin sensitivity may be related to inhibition of HDAC activity,inhibition of BCL-2 and survivin protein expression,and promotion of p21 protein expression.

MS-275;cisplatin;ovarian cancer;SKOV3

1007-4287(2017)08-1448-04

R737.31

A

2016-07-28)