PEG1000/ (NH4)2SO4雙水相萃取磨盤(pán)柿葉總黃酮的研究

羅曉（龍口出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺(tái)264000）

PEG1000/ (NH4)2SO4雙水相萃取磨盤(pán)柿葉總黃酮的研究

羅曉
（龍口出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東煙臺(tái)264000）

采用PEG1000/（NH4）2SO4雙水相體系萃取柿葉分離總黃酮，考察了PEG1000、（NH4）2SO4和MgCl2用量、離心時(shí)間、pH值等因素對(duì)萃取率的影響。結(jié)果表明最佳萃取條件為：PEG1000（0.55g·mL-1），（NH4）2SO4（0.6g·mL-1），MgCl2（0.04g·mL-1），pH值為7，離心時(shí)間3min。萃取率可達(dá)94%。磨盤(pán)柿葉黃酮對(duì)DPPH自由基、超氧自由基、羥基自由基均有一定的清除作用。

雙水相；柿葉；黃酮；萃取

柿子在我國(guó)各地普遍栽培，京津唐地區(qū)以磨盤(pán)柿聞名。磨盤(pán)柿以個(gè)大，形似“磨盤(pán)”而得名。柿蒂，柿霜，柿葉均可入藥，《本草再新》中記載柿葉“味苦、性寒、無(wú)毒”，“專入肺經(jīng)”。柿葉中含有單寧、膽堿、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、糖、黃酮等活性物質(zhì)，特別是Vc含量遠(yuǎn)高于常見(jiàn)的水果和蔬菜。柿葉煎服或代茶飲，有促進(jìn)新陳代謝、降壓、預(yù)防動(dòng)脈硬化及鎮(zhèn)咳化痰作用，此外，柿葉還有祛斑的功效。

黃酮類化合物是柿葉中的主要活性物質(zhì)，具有抗癌、抗菌、抗氧化、降壓、降脂等功能，在醫(yī)學(xué)上可用于治療冠心病、腦血栓、消除自由基。

雙水相萃取技術(shù)是一種液-液萃取分離技術(shù)，廣泛用于生物活性物質(zhì)的提取和分離[1，2]，文中采用PEG1000/（NH4）2SO4雙水相法對(duì)磨盤(pán)柿葉黃酮進(jìn)行萃取分離，并對(duì)其抗氧化作用進(jìn)行了研究，為磨盤(pán)柿葉黃酮的提取分離奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

磨盤(pán)柿葉（采集于河北遵化，干燥、粉碎，過(guò)40目篩備用）。

1.2 儀器及試劑

752紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（杭州）；HH-8恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋（江蘇）；BS124S電子天平（北京）；DELTA 320酸度計(jì)（成都）；800型離心機(jī)（江蘇）

NaOH、HCl、Al（NO3）3、NaNO2、無(wú)水乙醇、PEG1000、（NH4）2SO4、DPPH、鄰苯三酚、H2O2，以上均為分析純。蘆丁（標(biāo)準(zhǔn)品，含量≥95%）、

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線采用NaNO2-A（l NO3）3-NaOH顯色法[1]，在510nm下測(cè)定吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此可以計(jì)算溶液中黃酮含量。

1.3.2 磨盤(pán)柿葉總黃酮的提取選用L（934）正交表

1.3.3 雙水相萃取柿葉中總黃酮吸取3.0mL的柿葉黃酮粗提液于10mL離心管中，依次加入4.0mL PEG1000溶液和4.0mL（NH4）2SO4溶液，調(diào)節(jié)pH值，在2000r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心3min，以加速相分離過(guò)程。用注射器吸取上下相溶液進(jìn)行分析，分別測(cè)定上、下相體積；按標(biāo)準(zhǔn)曲線法顯色后于510nm處測(cè)定其吸光度，得出雙水相中上、下相中柿葉黃酮的含量，計(jì)算萃取率：

式中V1、V2：分別是上、下相體積；c1、c2：分別是上、下相中黃酮的濃度。

并通過(guò)單因素試驗(yàn)分別考查PEG1000、（NH）42SO4、MgCl2用量及離心時(shí)間和pH值等對(duì)磨盤(pán)柿葉中總黃酮萃取率的影響。

1.3.4 磨盤(pán)柿葉黃酮的抗自由基能力的測(cè)定

1.3.4.1 柿葉黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用分別取1%磨盤(pán)柿葉黃酮溶液和1%Vc溶液1.0mL，置于10mL比色管中，加入3.0mL 0.04mg·mL-1的DPPH乙醇溶液，室溫避光反應(yīng)30min，同時(shí)以無(wú)水乙醇為空白，于517nm處測(cè)定吸光值，按下式計(jì)算：

式中A0：1.0mL蒸餾水+3.0mLDPPH溶液的吸光度值；As：1.0mL樣品溶液+3.0mLDPPH溶液的吸光度值；Ac：1.0mL樣品溶液+3.0mL無(wú)水乙醇的吸光度值。

1.3.4.2 柿葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用取3支10mL比色管分別加入7.5mmol·L-1鄰二氮雜菲溶液0.2mL，加入7.5mmol·L-1硫酸亞鐵銨溶液0.2mL，加入pH≈7.4磷酸鹽緩沖溶液1mL，在2，3號(hào)比色管加入7.5mmol·L-1H2O21.0mL，在3號(hào)比色管中再加入1.0mL柿葉黃酮溶液，用去離子水定容至刻度，在37℃水浴中反應(yīng)1h，冷水冷卻，以水為參比，在508nm處測(cè)其吸光度值，按下式計(jì)算：

式中A1：不加雙氧水和黃酮的吸光度值；A2：只加H2O2的吸光度值；A3H2O2和黃酮均加的吸光度值。1.3.4.3柿葉黃酮對(duì)超氧自由基的清除作用取3mL pH值接近8.0的磷酸鹽緩沖溶液于10mL比色管中，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，分別加入同體積不同濃度的待測(cè)液溶液和0.6mL 30mmol·L-1的鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中預(yù)熱5min，加入0.5mL 1mol·LHCl終止反應(yīng)，于420nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)1。以同體積的去離子水代替樣品，吸光度記為A0，作空白對(duì)照?？紤]到待測(cè)液本身可能在420nm處有吸收，用同體積的去離子水代替鄰苯三酚溶液，得A2，按下式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-A（l NO）33-NaOH顯色法，在510nm下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

由最小二乘法得出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：

A=0.0114c-0.0018，濃度在0～60μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，據(jù)此式可求溶液中黃酮含量。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乙醇為溶劑提取磨盤(pán)柿葉總黃酮，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 L9（34）orthogonal experimental results

最優(yōu)組合為A3B1C2D2，即柿葉中黃酮的最佳提取工藝為：70%乙醇，回流時(shí)間1h，提取溫度80℃，固液比為1∶15。影響因素的主次順序?yàn)榛亓鳒囟龋净亓鲿r(shí)間＞乙醇濃度＞固液比。

2.3 雙水相萃取柿葉中黃酮

2.3.1 PEG1000用量對(duì)黃酮萃取率的影響根據(jù)1.3.3的方法，固定其他條件不變，改變PEG1000的用量，計(jì)算黃酮萃取率。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 PEG1000用量對(duì)萃取率的影響Fig.2 Effectof PEG1000 contenton extraction rate

由圖2可知，當(dāng)PEG1000的用量為（0.55g·mL-1）時(shí)，柿葉中黃酮的萃取率可達(dá)到90%，所以確定PEG1000的最佳用量比為（0.55g·mL-1）。

2.3.2 （NH4）2SO4用量對(duì)黃酮萃取率的影響固定其他萃取條件不變，只改變硫酸銨用量，計(jì)算黃酮萃取率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 硫酸銨用量對(duì)萃取率的影響Fig.3 Effectof ammonium sulfate dosage on extraction rate

由圖3可知，隨著硫酸銨用量的增加，黃酮萃取率先升高，然后下降，當(dāng)硫酸銨用量比為（0.6g·mL-1）時(shí)，黃酮的萃取率最高達(dá)到90%。故確定硫酸銨的用量為（0.6g·mL-1）。

2.3.3 離心時(shí)間對(duì)黃酮萃取率的影響固定其他萃取條件不變，改變離心時(shí)間，計(jì)算黃酮萃取率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 離心時(shí)間對(duì)黃酮萃取率的影響Fig.4 Effectof centrifugation time on extraction rate of flavonoids

由圖4可見(jiàn)，當(dāng)離心時(shí)間為3min時(shí)，黃酮萃取率達(dá)到90%，3～5min內(nèi)趨于穩(wěn)定，故選擇離心時(shí)間為3min。

2.3.4 MgCl2對(duì)黃酮萃取率的影響固定其他萃取條件不變，改變MgCl2的添加量，計(jì)算黃酮萃取率，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 MgCl2用量對(duì)黃酮萃取率的影響Fig.5 EffectofMgCl2content on the extraction rate of flavonoids

加入MgCl2有助于縮短分相時(shí)間，提高相分離速度，由圖5可見(jiàn)MgCl2的用量比為（0.04g·mL-1）時(shí)，黃酮的萃取率最大。所以選擇MgCl2的添加量為（0.04g·mL-1）。MgCl2起到鹽析作用，增加水溶性，使水溶性蛋白質(zhì)物質(zhì)析出到下相中。

2.3.5 pH值對(duì)黃酮萃取率的影響圖6考察了不同pH時(shí)對(duì)磨盤(pán)柿葉中黃酮的萃取率的影響。

圖6 pH值對(duì)黃酮萃取率的影響Fig.6 Effectof pH on extraction rate of flavonoids

pH值的變化改變了磨盤(pán)柿葉黃酮的電性和表面性質(zhì)，同時(shí)也改變了無(wú)機(jī)離子的分配情況，從而影響兩相之間的電位差。從圖6中可以看出，pH值為7～8時(shí)，黃酮萃取率最高，并趨于平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH＞8時(shí)，溶液開(kāi)始變渾濁，且隨著pH值繼續(xù)增大，溶液不分相。

2.3.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)確定，分離純化磨盤(pán)柿葉中黃酮的最佳雙水相體系是：3mL粗提液，加4mLPEG1000（0.55g·mL-1），4mL硫酸銨（0.6g·mL-1），1mLMgCl2（0.04g·mL-1），pH值為7，離心時(shí)間3min。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Tab.2 Verification experiment

可見(jiàn)，在最佳條件下，萃取率可達(dá)94.37%。

2.3.7 磨盤(pán)柿葉黃酮抗自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果磨盤(pán)柿葉黃酮抗自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 對(duì)自由基的清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of scavenging free radical

通過(guò)對(duì)比，結(jié)果表明磨盤(pán)柿葉黃酮具有較高的清除DPPH自由基和超氧自由基能力，清除率均超過(guò)75%，其中對(duì)DPPH自由基清除效果與Vc相當(dāng)，略高于Vc；而對(duì)超氧自由基清除率比Vc高15%。而磨盤(pán)柿葉黃酮溶液對(duì)羥自由基的清除能力明顯低于Vc溶液，只有56%，比Vc低了20%。

3 結(jié)論

（1）運(yùn)用乙醇提取法對(duì)磨盤(pán)柿葉中的黃酮進(jìn)行提取，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，確定了最佳提取工藝條件：乙醇濃度為70%，回流時(shí)間為1h，提取溫度為70℃，固液比為1∶10。影響因素的大小順序?yàn)椋夯亓鳒囟龋净亓鲿r(shí)間＞乙醇濃度＞固液比。

（2）采用雙水相萃取技術(shù)對(duì)磨盤(pán)柿葉中黃酮進(jìn)行分離，得到了最佳萃取條件：3mL粗提液，加入4mL（0.55g·mL-1）PEG1000，4mL（0.6g·mL-1）硫酸銨，1mL（0.04g·mL-1）MgCl2，pH值為7，離心時(shí)間3min。在此條件下黃酮的萃取率可達(dá)94%以上。

（3）抗自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磨盤(pán)柿葉黃酮對(duì)DPPH自由基、超氧自由基的清除率均高于Vc，可達(dá)75%以上；但對(duì)羥基自由基的清除率只有56%，明顯低于Vc。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系適合于磨盤(pán)柿葉黃酮的萃取分離，成本低且不易引起生物活性物質(zhì)變性或失活。

［1］郭輝,張中玉,羅宇倩,等.雙水相萃取法分離竹葉黃酮的工藝研究［J］.2012,34（2）:24-28.

［2］董樹(shù)國(guó),賴紅偉,陸釗.雙水相萃取在黃酮類化合物分離分析中的應(yīng)用［J］.廣州化工,2009,37（7）:43-44.

［3］尉芹，王冬梅，馬希漢,等.杜仲黃酮含量測(cè)定方法研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)（白然科學(xué)版），2001,29（5）:199-122.

［4］陸強(qiáng),鄧修.提取與分離天然產(chǎn)物中有效成分的新方法-雙水相萃取技術(shù)［J］.中成藥，2000,22（9）:22-23.

Study on extraction of total flavonoids from persimmon leaves by PEG1000/（NH4）2SO4aqueous two-phase extraction technique

LUO Xiao
（longkou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yantai264000,China）

Using PEG1000/（NH4）2SO4aqueous two-phase extraction technique to separate the total flavonoids extracted from Persimmon leaves.Effect of the dosages of PEG1000,（NH4）2SO4and MgCl2,centrifugation time and pH on the extraction rate was studied.The results showed that the best extraction conditions were as followes: polyethylene glycol 1000（0.55g·mL-1）,ammonium sulphate（0.6g·mL-1）,MgCl2（0.04g·mL-1）,pH=7,centrifugation time was 3min.And the extraction rate reached 94%.The total flavonoids from mopan persimmon leaves had a certain scavenging effecton DPPH free radical,superoxide free radical,and hydroxyl radical.

persimmon;flavonoids;aqueous two-phase extraction

R284.2

A

2017-02-27

羅曉（1988-），女，助理工程師，2012年畢業(yè)于山東師范大學(xué)，化學(xué)工程與工藝專業(yè)，大學(xué)本科，主要從事食品化礦分析工作。進(jìn)行正交試驗(yàn)法考察溫度、時(shí)間、提取劑濃度、固液比等因素對(duì)提取磨盤(pán)柿葉總黃酮的影響，按最優(yōu)條件提取磨盤(pán)柿葉總黃酮得粗提液。

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170729