高產(chǎn)橙花叔醇的酵母細(xì)胞工廠創(chuàng)建

張麗麗 馬曉琳 王冬 郁彭 黃璐琦 張學(xué)禮 戴住波

[摘要]橙花叔醇為萜類精油成分，具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化等多種生物學(xué)活性。為了實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母中異源生產(chǎn)橙花叔醇，該研究首先將獼猴桃Actinidia chinensis來源的橙花叔醇合酶（NES）基因通過密碼子優(yōu)化、人工合成后轉(zhuǎn)入底盤菌株FPP001中獲得工程菌株NES001，其橙花叔醇產(chǎn)量達(dá)到271 mg·L-1。在進(jìn)一步工作中，橙花叔醇合酶的N端通過連接肽GGGS 融合法尼烯合酶（FPS）后得到橙花叔醇產(chǎn)量顯著提高的工程菌NES002，其產(chǎn)量是NES001的5980倍，達(dá)到16207 mg·L-1。最終，通過恢復(fù)NES002中色氨酸生物合成缺陷基因TRP1得到工程菌NES003，該菌在高密度發(fā)酵體系中橙花叔醇產(chǎn)量能達(dá)到1 71153 mg·L-1。該研究為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]精油；橙花叔醇；合成生物學(xué)；釀酒酵母

Construction of cell factories for high production of nerolidol

in Saccharomyces cerevisiae

ZHANG Lili1，2，3， MA Xiaolin1，2，3， WANG Dong2，3， YU Peng1， HUANG Luqi4， ZHANG Xueli2，3*， DAI Zhubo2，3*

（1 College of Biotechnology， Tianjin University of Science & Technology， Tianjin 300457， China；

2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China；

3.Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology， Chinese Academy of Sciences， Tianjin 300308， China；

4 State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract]Nerolidol is an important constituent of terpenoid essential oil and has excellent antitumor， antibacterial， and antioxidative properties For realizing heterogenous production of nerolidol， our research firstly integrated the codonoptimized Actinidia sinensis nerolidol synthase gene （NES） into the terpenoid chassis strain FPP001， and obtained NES001 that could produce 271 mg·L-1 nerolidol Then， the Nterminal of the NES was fused with FPS by linker peptide GGGS With this strategy， nerolidol production improved by 5980fold， reaching 16207 mg·L-1 Finally， by introduction of auxotrophic marker TRP1 in NES002， the resulting strain NES003 could produce 1 71153 mg·L-1 by high cell density fermentation method This study provides the basis for the fermentative production of nerolidol and other sesquiterpenoids

[Key words]essential oils； nerolidol； synthetic biology； Saccharomyces cerevisiae

橙花叔醇（nerolidol）是具有芳香性的倍半萜精油成分[1]，主要存在于中藥降香，陳皮等100多種香料植物中[2]。由于橙花叔醇特殊的香味，可用于配制玫瑰型、紫丁香型等多種花香型日化香精，被廣泛應(yīng)用于化妝品和洗滌領(lǐng)域；同時(shí)橙花叔醇具有抗瘧疾[3]，抗腫瘤[4]，抗?jié)僛5]，抗氧化[6]和抗菌[7]等多種生物活性，已被美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)作為食品調(diào)味劑[8]。目前，橙花叔醇的傳統(tǒng)獲得方法是從植物精油中濃縮、浸取而得，由于該方法存在提取效率低、浪費(fèi)植物資源、破壞生態(tài)環(huán)境等問題，不符合可持續(xù)發(fā)展的要求[9]。

近年來，利用合成生物學(xué)的原理，設(shè)計(jì)和改造微生物菌株來生產(chǎn)青蒿素，人參皂苷等中藥有效成分已被認(rèn)為是一種很有潛力的方法[1012]。釀酒酵母由于其遺傳背景清晰、遺傳改造技術(shù)和發(fā)酵方法成熟，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到構(gòu)建合成萜類化合物的底盤菌中。在釀酒酵母中，乙酰輔酶A在MVA途徑7個(gè)酶的催化下，可生成所有萜類化合物合成的前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。在倍半萜化合物生物合成途徑中，IPP和DMAPP可在法呢基焦磷酸合成酶（FPS）的作用下生成倍半萜類化合物的合成前體法呢烯基焦磷酸（FPP），F(xiàn)PP可在不同倍半萜合成酶的催化作用下生成橙花叔醇等各種倍半萜化合物，見圖1。

實(shí)驗(yàn)室前期，已構(gòu)建了1株過表達(dá)MVA途徑7個(gè)基因的底盤菌株NK2SQ，其可顯著增加釀酒酵母內(nèi)萜類化合物的合成通量[11]。在本研究中，底盤菌株NK2SQ中參與乙醇合成乙酰輔酶A的乙醇脫氫酶（ADH2）、乙醛脫氫酶（ALD6）和乙酰輔酶A合酶（ACS1）等酶基因的表達(dá)調(diào)控，獼猴桃Actinidia chinensis來源的橙花叔醇合酶（NES）基因（GenBank： JN2422431）密碼子優(yōu)化，NES與FPS酶蛋白融合，以及高密度發(fā)酵等策略進(jìn)一步用于提高細(xì)胞工廠合成橙花叔醇的能力。相關(guān)結(jié)果為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)橙花叔醇等倍半萜化合物奠定了基礎(chǔ)。

1材料

11工具酶與試劑PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自于大連寶生物工程公司；酵母基因組DNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國Axygen公司；氨芐青霉素、DNA清潔試劑盒與DNA回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母選擇培養(yǎng)基購自北京泛基諾科技有限公司；麥角固醇、鯊烯和橙花叔醇標(biāo)準(zhǔn)品購自美國SigmaAldrich公司；其他試劑均為分析純。

12質(zhì)粒，菌株及引物本次研究所用的質(zhì)粒，菌株及引物信息見表1，2。

HMGCoA 3hydroxy3methylglutaryl coenzyme A； IPP isopentenyldiphosphate； DMAPP dimethylallyldiphosphate； FPPfarnesyl pyrophosphate； ERG10 acetoacetylCoA thiolase； ERG13 HMGCoA synthase； HMG1 HMGCoA reductase； ERG12 mevalonate kinase； ERG8 phosphomevalonate kinase； ERG19 mevalonate pyrophosphate decarboxylase； IDI1 isopentenyl diphosphate isomerase 1； ERG20 FPP synthase； ADH2alcohol dehydrogenase； ALD6 acetaldehyde dehydrogenase； ACS1 acetylCoA synthetase； NES nerolidol synthase。

13培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：1% 蛋白胨，05% 酵母粉，1% 氯化鈉，100 mg·L-1氨芐青霉素；SMUra篩選培養(yǎng)基：08% 酵母選擇培養(yǎng)基（三缺，UraTrpHis），2%葡萄糖，001% Trp，0005% His；SMUraHis篩選培養(yǎng)基：08% 酵母選擇培養(yǎng)基（三缺，UraTrpHis），2% 葡萄糖，001%Trp；SMUraHisLeu篩選培養(yǎng)基：08% 酵母選擇培養(yǎng)基（四缺，UraTrpHisLeu），2% 葡萄糖，001% Trp。SMUraHisLeuTrp篩選培養(yǎng)基：08% 酵母選擇培養(yǎng)基（四缺，UraTrpHisLeu），2% 葡萄糖。上述液體培養(yǎng)基加2% 的Agar可配成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

高密度發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基參照人參皂苷高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制[12]。

2方法

21FPP001菌株的構(gòu)建構(gòu)建FPP001工程菌株所采用的方法為多片段同源重組。首先，模板和引物的搭配方案見圖2和表3，用PrimeSTAR HS高保真聚合酶擴(kuò)增和割膠回收得到用于同源重組的各

個(gè)片段。用SMUra培養(yǎng)基活化NK2SQ后將各個(gè)片段轉(zhuǎn)入醋酸鋰方法制備的感受態(tài)中，并用SMUraHis固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子再分別用SacⅡPGK1/ADH2Asc1，PacpTDH3/ACS1Asc1，SacⅡpTEF1/ALD6Asc1等 3對(duì)引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證后，得到工程菌FPP001。

22NES系列菌株的構(gòu)建用醋酸鋰的方法制備FPP001感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒pRS313NES轉(zhuǎn)入FPP001感受態(tài)細(xì)胞，并用SMUraHisLeu固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證后，得到工程菌NES001。

用醋酸鋰的方法制備FPP001感受態(tài)細(xì)胞，將質(zhì)粒PRS313FPSGGGSNES轉(zhuǎn)入FPP001感受態(tài)細(xì)胞，并用SMUraHisLeu固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子再用SacIIpTEF1/NESAsc1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序，得到工程菌NES002。

以ZDTRP1intergup/ZDTRP1intergdown為引物，BY4742基因組為模板，使用 PrimeSTAR HS高保真聚合酶擴(kuò)增和割膠回收得到用于同源重組的片段TRP1。用醋酸鋰的方法制備NES002感受態(tài)細(xì)胞，將片段TRP1轉(zhuǎn)入NES002感受態(tài)細(xì)胞，并用SMUraHisLeuTrp固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子。直接將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序，得到工程菌NES003。

23發(fā)酵及產(chǎn)物提取搖瓶發(fā)酵：挑取平板上的單克隆于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r·min-1過夜制備種子液。將種子液接種以1%的接種量接種于含15 mL相應(yīng)液體選擇培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，30 ℃，250 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 d，然后加入15 mL正十二烷，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)6 d。最后，將三角瓶中液體轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，5 000 r·min-1離心5 min，收集有機(jī)相，用正己烷稀釋10倍，過有機(jī)尼龍膜（022 μm）后備用。

高密度發(fā)酵：經(jīng)火焰接種環(huán)，將300 mL種子液加入含3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的7 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程中參數(shù)設(shè)定值分別為：溫度30 ℃，pH 50，溶氧30%，空氣流量3～20 L·min-1，攪拌轉(zhuǎn)速300～1 000 r·min-1，溶氧與攪拌轉(zhuǎn)速、通氣相偶聯(lián)。補(bǔ)料策略為：溶氧值大于60%時(shí)，向發(fā)酵罐中加入補(bǔ)料培養(yǎng)基至發(fā)酵液中葡萄糖濃度為10 g·L-1。尾氣管通入含有300 mL正十二烷的吸收瓶，發(fā)酵112 h后向發(fā)酵罐中加入200 mL正十二烷，500 r·min-1攪拌1 h，收集有機(jī)相，用正己烷稀釋100倍，過有機(jī)尼龍膜（022 μm）后備用。

24橙花叔醇、麥角固醇及鯊烯的檢測(cè)正己烷配制橙花叔醇，麥角固醇和鯊烯對(duì)照品溶液，使用GCMS進(jìn)行樣品的定性和定量分析[12]。橙花叔醇GCMS測(cè)定條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣體積1 μL，不分流，溶劑延時(shí)3 min；色譜柱：HP5ms （025 mm×30 m）；色譜條件：45 ℃，1 min，10 ℃·min-1到300 ℃保溫5 min；MS條件：Full Scan： 50～750 amu。麥角固醇和鯊烯GCMS測(cè)定條件：進(jìn)樣口溫度300 ℃，進(jìn)樣體積1 μL，不分流，溶劑延時(shí)12 min；色譜柱：HP5 ms（025 mm×30 m）；色譜條件：80 ℃，1 min；20 ℃·min-1到300 ℃保溫18 min；MS條件：SIM69，109，135，363，411。

3結(jié)果與分析

31橙花叔醇釀酒酵母細(xì)胞工廠創(chuàng)建及產(chǎn)物鑒定橙花叔醇合成酶基因（NES）能以釀酒酵母中生成的FPP為底物合成目標(biāo)產(chǎn)物橙花叔醇，見圖1。實(shí)驗(yàn)室前期，已構(gòu)建了1株過表達(dá)MVA途徑7個(gè)基因的底盤菌株NK2SQ，其可顯著增加釀酒酵母內(nèi)萜類化合物的合成通量[11]。為了進(jìn)一步強(qiáng)化底盤菌的性能，底盤菌株NK2SQ中參與乙醇合成乙酰輔酶A的乙醇脫氫酶（ADH2）、乙醛脫氫酶（ALD6）和乙酰輔酶A合酶（ACS1）等3個(gè)酶基因被過表達(dá)：PCR克隆得到的ADH2，ACS1，ALD6基因分別與相應(yīng)的強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1，TDH3，TEF1和終止子連接后，利用同源重組一次整合到NK2SQ基因組的NDT80位點(diǎn)，見圖2。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過缺陷培養(yǎng)基的篩選、PCR和測(cè)序驗(yàn)證后得到倍半萜類化合物底盤菌FPP001，PCR驗(yàn)證結(jié)果見圖3A。

AFPP001 PCR驗(yàn)證圖；BNES001 PCR驗(yàn)證圖；CNES002 PCR驗(yàn)證圖；MTrans 2K plus marker；A圖中泳道1～3分別是3個(gè)基因及相應(yīng)的啟動(dòng)子的PCR驗(yàn)證圖，泳道4～6為對(duì)照菌PCR驗(yàn)證圖； B圖中泳道1～2分別是NES001和對(duì)照菌PCR驗(yàn)證圖；C圖中泳道1～2分別是NES002和對(duì)照菌PCR驗(yàn)證圖。

在此基礎(chǔ)上，將人工合成的NES基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子TEF1下獲得質(zhì)粒pRS313NES，再將pRS313NES轉(zhuǎn)入到釀酒酵母底盤菌FPP001中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)缺陷培養(yǎng)基的篩選，PCR與測(cè)序驗(yàn)證后得到工程菌NES001，見圖3B。底盤菌FPP001和工程菌NES001在缺陷培養(yǎng)基中發(fā)酵6 d后，利用GCMS對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，發(fā)現(xiàn)工程菌株NES001能在1460 min出現(xiàn)與反式橙花叔醇對(duì)照品相同質(zhì)譜圖的新峰見圖4，其產(chǎn)量為271 mg·L-1，見圖5。

A Nerolidol 代表橙花叔醇對(duì)照品，F(xiàn)PP001代表工程菌FPP001發(fā)酵產(chǎn)物，NES001代表工程菌NES001發(fā)酵產(chǎn)物； B反式橙花叔醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖； C工程菌NES001發(fā)酵產(chǎn)物中橙花叔醇質(zhì)譜圖。

32蛋白質(zhì)融合方法優(yōu)化橙花叔醇釀酒酵母細(xì)胞工廠生物合成途徑上各個(gè)酶的空間靠近對(duì)中間產(chǎn)物的流向有著非常重要的影響。拉近合成途徑中的2個(gè)（或多個(gè)）功能相關(guān)的酶的空間距離，從而在空間上更有利于2個(gè)催化反應(yīng)的進(jìn)行，能有效提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此，利用連接肽將功能相關(guān)的酶進(jìn)行融合，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)工程優(yōu)化重要策略[13]。在橙花叔醇的生物合成途徑中，法呢基焦磷酸合成酶（FPS）能催化IPP和DMAPP合成NES酶的底物法呢基焦磷酸（FPP）。為進(jìn)一步提高橙花叔醇的產(chǎn)量，利用連接肽GGGS將FPS融合到NES酶的N端，轉(zhuǎn)入底盤菌FPP001得到橙花叔醇產(chǎn)量顯著提高的工程菌NES002，其產(chǎn)量是初始菌株NES001的5980倍，達(dá)到16207 mg·L-1。

工程菌營(yíng)養(yǎng)缺陷基因的恢復(fù)能提高菌株的發(fā)酵性能。在NES002菌株的基礎(chǔ)上，恢復(fù)了其缺陷基因TRP1，轉(zhuǎn)化子經(jīng)缺陷培養(yǎng)基篩選和測(cè)序驗(yàn)證后得到工程菌NES003。 NES003在缺陷培養(yǎng)基中發(fā)酵6 d后，其橙花叔醇產(chǎn)量達(dá)到19560 mg·L-1，見圖5。較菌株NES002產(chǎn)量提高了2069%。

33NES003高密度發(fā)酵進(jìn)一步提高橙花叔醇產(chǎn)量酵母菌的高密度發(fā)酵既可提高產(chǎn)物的生產(chǎn)率，又能充分利用生物反應(yīng)器的容積和降低分離成本[12，1415]。本研究中，利用實(shí)驗(yàn)室前期建立的萜類發(fā)酵工藝對(duì)高產(chǎn)菌NES003進(jìn)行高密度發(fā)酵。工程菌NES003發(fā)酵72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，112 h時(shí)菌的生長(zhǎng)A600能達(dá)到22517，此時(shí)橙花叔醇的產(chǎn)量達(dá)1 71154 mg·L-1，與搖瓶發(fā)酵相比，提高了775倍，見圖6。其中，發(fā)酵尾氣中橙花叔醇的含量約占總量的210%，發(fā)酵罐和尾氣瓶中分別為1 67633，3521 mg·L-1，發(fā)酵產(chǎn)物存在一定揮發(fā)性。另外鯊烯和麥角固醇等競(jìng)爭(zhēng)性分支途徑的代謝物分別為9410，31564 mg·L-1。

4討論

近年來，蛋白質(zhì)融合技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種有效提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量的手段，例如：ZHOU等把SmCPS，SmKSL進(jìn)行融合，以及BTS1（GGPP合酶），ERG20（FPP合成酶）的融合等方法應(yīng)用于次丹參酮二烯工程菌的構(gòu)建，釀酒酵母工程菌次丹參酮二烯的產(chǎn)量達(dá)到了365 mg·L-1[16]。ZHAO等通過構(gòu)建Erg20p（F96WN127W）tVoGES融合酶，并對(duì)中間連接肽和酶順序進(jìn)行優(yōu)化，運(yùn)用其他代謝手段，釀酒

酵母工程菌香葉醇產(chǎn)量達(dá)到662 mg·L-1，產(chǎn)量比原來報(bào)道的最高香葉醇產(chǎn)量高出了7倍多[17]。本研究將功能相關(guān)的NES和FPS進(jìn)行融合，將橙花叔醇的產(chǎn)量提高了5980倍，為利用融合蛋白技術(shù)提高目標(biāo)化合物產(chǎn)量提供了強(qiáng)有力的支持。

在發(fā)酵過程中，TRP1營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記的缺失會(huì)對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)表型產(chǎn)生影響，例如使用TRP1功能缺陷的NES002進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí)，雖然我們?cè)谂囵B(yǎng)基中添加了適量的色氨酸作為補(bǔ)充，但其細(xì)胞生物量指標(biāo)A600未超過3000，然而當(dāng)利用NES003進(jìn)行發(fā)酵時(shí)其菌株A600顯著提高超過7倍，可以達(dá)到22517。另外，工程菌株中競(jìng)爭(zhēng)性分支途徑的代謝物鯊烯的含量一直維持在很低水平，提示代謝流主要流向橙花叔醇合成方向，下一步改造將圍繞提高萜類化合物整體代謝流展開。

橙花叔醇是具有怡人香味的萜類精油化合物，在化妝品和食品領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用，目前全球需求范圍在10～100 t[18]。利用合成生物學(xué)原理，創(chuàng)建人工酵母細(xì)胞生產(chǎn)橙花叔醇可為橙花叔醇的制備提供新的來源。本研究通過底盤菌株優(yōu)化，外源橙花叔醇合酶的轉(zhuǎn)入，蛋白質(zhì)融合以及高密度發(fā)酵等策略，最終獲得可生產(chǎn)1 71153 mg·L-1橙花叔醇的酵母細(xì)胞工廠NES003。本研究為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)橙花叔醇等倍半萜化合物提供了基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯呂冬梅]