急性髓系白血病中環(huán)氧化酶-2、野生型P53的相關(guān)性分析

陳少微，陳秀花，覃艷紅，徐智芳，許蓮蓉*

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

急性髓系白血病中環(huán)氧化酶-2、野生型P53的相關(guān)性分析

陳少微，陳秀花，覃艷紅，徐智芳，許蓮蓉*

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，山西 太原 030001)

目的 分析環(huán)氧化酶-2 (COX-2)和野生型P53(WT-p53)在急性髓系白血病(AML)中表達(dá)相關(guān)性和意義。方法 采用RT-qPCR檢測(cè)COX-2和WT-p53在AML患者中的表達(dá)情況。結(jié)果 比較21例正常對(duì)照、37例初發(fā)AML和24例復(fù)發(fā)AML患者中COX-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.09±0.09、2.36±0.39、4.82±0.58，而WT p53 mRNA分別為0.99±0.13、0.48±0.06、0.20±0.05，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。COX-2和WT p53在AML中呈負(fù)相關(guān)，這與外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例有關(guān)。結(jié)論 COX-2過(guò)表達(dá)和WT p53低表達(dá)與AML復(fù)發(fā)有關(guān)，炎癥微環(huán)境可能通過(guò)調(diào)控兩者的表達(dá)及相互作用導(dǎo)致AML的復(fù)發(fā)。

白血病，髓樣，急性；環(huán)氧化酶-2；野生型P53；復(fù)發(fā)；炎癥

0 引言

急性髓系白血病(AML)是造血干祖細(xì)胞異常增殖和分化障礙所致的惡性克隆性疾病，復(fù)發(fā)是其治療難題，目前機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，AML復(fù)發(fā)可能與炎癥微環(huán)境有關(guān)[1]，炎癥微環(huán)境中存在大量免疫細(xì)胞及促炎因子，可激活多種信號(hào)通路，這些刺激使環(huán)氧化酶-2 (COX-2)表達(dá)上調(diào)，則基因異常，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖、保護(hù)細(xì)胞免受凋亡等，增加潛在致瘤性。故本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)初發(fā)和復(fù)發(fā)AML患者中COX-2和野生型P53 (WT p53)的表達(dá)水平，并研究?jī)烧叩谋磉_(dá)相關(guān)性及與患者臨床特征的關(guān)系，旨在探討可能導(dǎo)致AML復(fù)發(fā)的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)收集2016年3月至9月我院血液科的骨髓標(biāo)本共82例。除外急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)和行造血干細(xì)胞移植的AML患者61例，包括初發(fā)組37例和復(fù)發(fā)組24例；其中男31例，女30例；中位年齡44歲(15-74歲)。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[2]。以21例同期骨髓良性疾病患者為對(duì)照組，其中男11例，女10例，中位年齡42歲(20-67歲)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本處理

取患者骨髓標(biāo)本2ml于EDTA管中，提取單個(gè)核細(xì)胞，采用Trizol法提取RNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RT-qPCR引物，由上海生工生物工程有限公司合成。(表1)

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)

取2μl總RNA，按照PrimeScript? RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。取2μl的cDNA，按照SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒說(shuō)明配制20μl的擴(kuò)增體系，ABI7300進(jìn)行擴(kuò)增，β-actin為內(nèi)參照。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5s變性，60℃ 31s退火延伸，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次。Ct值為每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到預(yù)設(shè)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)。采用2-ΔΔCt法，相對(duì)表達(dá)量RQ=2-ΔΔCt，ΔΔCt =(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)對(duì)照組。

表1 各基因引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 5軟件。計(jì)量資料采用表示。比較資料采用One-Way ANOVA分析及卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)。采用t-test檢驗(yàn)分析兩者與患者臨床特征的關(guān)系。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML中COX-2和WT p53的表達(dá)水平

對(duì)照組、初發(fā)組和復(fù)發(fā)組中COX-2的相對(duì)表達(dá)量分別為1.09±0.09、2.36±0.39、4.82±0.58，而 WT p53分 別 為 0.99±0.13、0.48±0.06、0.20±0.05。同對(duì)照組相比，AML中COX-2表達(dá)增高，WT p53表達(dá)下降；和初發(fā)組相比，兩者的差異更顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(前者χ2=7.544， P=0.023；后者χ2=10.87，P=0.0044) (圖1-2)。

圖1 -2 C O X-2和WT p 5 3在正常組、初發(fā)組和復(fù)發(fā)組的表達(dá)水平

2.2 COX-2和WT p53 的表達(dá)相關(guān)性

對(duì) 照 組 中，COX-2和WT p53無(wú) 相 關(guān) 性(r=0.029，P=0.8985)，初發(fā)組和復(fù)發(fā)組中，兩者均呈負(fù)相關(guān)(初發(fā)組r=0.731，P＜0.0001；復(fù)發(fā)組r=0.677，P=0.0003) (圖3-5)。

圖3 -5 C O X-2和WT p 5 3在正常組、初發(fā)組和復(fù)發(fā)組的表達(dá)相關(guān)性

2.3 COX-2、WT p53表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系

AML患者中COX-2、WT p53表達(dá)水平與年齡、性別、血小板計(jì)數(shù)、血紅蛋白濃度均無(wú)關(guān)（P＞0.05）。復(fù)發(fā)組中，隨著外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例增高，COX-2表達(dá)增高，而WT p53表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；初發(fā)組中無(wú)此差異（表2）。

表2 C O X-2和WT p 5 3表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系

表2 C O X-2和WT p 5 3表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系

臨床特征 初發(fā)組 RQ P值（各組間）≥60且＜90 2.05±0.28 0.49±0.43 4.44±0.56 0.20±0.07≥30且＜60 2.55±0.12 0.39±0.15 5.04±0.18 0.12±0.08 PLT（109/L）≥40 2.13±0.76 0.50±0.35 ＞0.05 3.92±0.19 0.31±0.11 ＞0.05＜40 2.52±0.51 0.44±0.17 4.22±0.56 0.22±0.13骨髓原始細(xì)胞比例（%）≥50 3.45±0.68 0.39±0.10 ＞0.05 5.52±0.61* 0.10±0.05* ＜0.05＜50 2.43±0.91 0.55±0.29 4.09±0.21 0.35±0.15復(fù)發(fā)組RQ P值（各組間）2.96±0.44 0.46±0.12 ＞0.05 4.46±0.08 0.23±0.02 ＞0.05女2.30±0.45 0.33±0.22 5.06±0.45 0.18±0.12年齡≥60 2.53±0.49 0.49±0.32 ＞0.05 4.52±0.39 0.21±0.06 ＞0.05＜60 2.16±0.22 0.44±0.12 4.89±0.22 0.19±0.02 WBC（109/L）≥10 2.52±0.02 0.44±0.43 ＞0.05 5.02±0.41Δ 0.11±0.05Δ ＜0.05＜10 1.99±0.87 0.34±0.22 4.12±0.33 0.39±0.11 HB（g/L）≥90 2.13±0.31 0.44±0.12＞0.05 COX-2 WT p53 COX-2 WT p53性別男4.50±0.21 0.28±0.06＞0.05

3 討論

王曉軍等發(fā)現(xiàn)COX-2在慢性粒細(xì)胞白血病中表達(dá)增高，與腫瘤負(fù)荷和病情演變有關(guān)[3]。高子芬等也發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤中COX-2過(guò)表達(dá)率達(dá)53.8%，是影響患者無(wú)事件生存期的獨(dú)立不良預(yù)后因素[4]。本研究也證實(shí)在AML中COX-2表達(dá)增高，且復(fù)發(fā)組高于初發(fā)組，這提示AML復(fù)發(fā)可能與COX-2過(guò)表達(dá)有關(guān)。

激活COX-2過(guò)表達(dá)的內(nèi)源性和外源性刺激，同時(shí)也調(diào)控WT p53的表達(dá)，兩者的啟動(dòng)子都需通過(guò)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，因此COX-2和WT p53表達(dá)存在一定的關(guān)聯(lián)[5]。Gharghabi等將COX-2抑制劑塞來(lái)昔布作用于肺癌細(xì)胞株，24小時(shí)后發(fā)現(xiàn)MDM-2表達(dá)下降，WT p53表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明WT p53/MDM-2負(fù)反饋通路被阻斷，抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)；而在48小時(shí)后WT p53表達(dá)下降，COX-2和MDM-2表達(dá)均增加，提示W(wǎng)T p53和COX-2表達(dá)存在負(fù)反饋調(diào)控作用[6]。故本研究對(duì)同一研究對(duì)象WT p53表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在AML中WT p53表達(dá)是降低的。通過(guò)分析COX-2和WT p53表達(dá)相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在AML中兩者確實(shí)呈負(fù)相關(guān)。

通過(guò)分析兩者與患者臨床特征的關(guān)系，明確外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例的增高是影響COX-2和WT p53負(fù)調(diào)節(jié)的因素。一方面證實(shí)COX-2和WT p53相互作用導(dǎo)致白血病細(xì)胞增殖，致AML復(fù)發(fā)；另一方面我們推測(cè)COX-2和WT p53的相互作用可能與炎癥有關(guān)。在正常炎癥反應(yīng)中，炎癥病變使NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，致DNA損傷，則WT p53激活致無(wú)特異性誘導(dǎo)凋亡，兩者共同上調(diào)COX-2的表達(dá)，使正常細(xì)胞免受WT p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；一旦WT p53誘導(dǎo)凋亡作用消失，TATA盒就下調(diào)COX-2表達(dá)，恢復(fù)機(jī)體正常生理功能[7]。而AML患者經(jīng)化療后多免疫功能低下，是慢性非可控性炎癥的易感人群，慢性非可控性炎癥長(zhǎng)期作用于機(jī)體形成炎癥微環(huán)境[8]，處于炎癥微環(huán)境下，WT p53和COX-2動(dòng)態(tài)平衡被打破，持續(xù)表達(dá)的COX-2負(fù)反饋調(diào)控WT p53表達(dá)，而炎癥因子持續(xù)反式激活胞苷脫氨酶使TATA盒功能異常[9]，過(guò)表達(dá)的COX-2發(fā)揮炎-癌轉(zhuǎn)化橋梁作用，誘導(dǎo)體細(xì)胞突變；大多數(shù)突變體細(xì)胞被淘汰，少數(shù)則通過(guò)體細(xì)胞突變和炎癥相關(guān)表觀遺傳修飾等改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，經(jīng)去分化而獲得干細(xì)胞特性，發(fā)展為致癌起始細(xì)胞[10]，推測(cè)白血病干細(xì)胞由此而來(lái)。故我們推測(cè)炎癥微環(huán)境激活WT p53后上調(diào)COX-2的表達(dá)，過(guò)表達(dá)的COX-2負(fù)反饋調(diào)控WT p53表達(dá)，并發(fā)揮炎-癌轉(zhuǎn)化橋梁作用，致AML復(fù)發(fā)。

本研究證實(shí)，COX-2過(guò)表達(dá)和WT p53低表達(dá)與AML復(fù)發(fā)有關(guān)，而炎癥微環(huán)境調(diào)控兩者相互作用可能是導(dǎo)致AML復(fù)發(fā)的機(jī)制之一，這為AML復(fù)發(fā)的研究提供新的思路。

[1] Grivennikov SI, Greten FR, AKarin M.Immunity,inflammation,and cancer [J]. Cell,2010,140,883–899.

[2] NCCN Guidelines Version 2.2016 Panel Members Acute Myeloid Leukemia [J]. 2016,V2,21-25.

[3] 王曉軍,茹甫毅,吳雙有,等.COX-2、bFGF及TGFβ1在慢性粒細(xì)胞白血病中的表達(dá)意義[J]?，F(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué).2017,2，25 (04)：603-607。

[4] 時(shí)云飛,高子芬,劉翠,等.COX-2、p16INK4A、p53蛋白在經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤患者中的表達(dá)及其預(yù)后相關(guān)分析[J].中華血液學(xué)雜志.2015,36( 11 ):926-932。

[5] Benoit V, de Moraes E, Dar NA, et al. Transcriptional activation of cyclooxygenase-2 by tumor suppressor p53 requires nuclear factorkappaB [J]. Oncogene. 2006,25: 5708-5718.

[6] Gharghabi M, Rezaei F, Mir Mohammadrezaei F, et al. Celecoxib Treatment Alters p53 and MDM2 Expression via COX-2 Crosstalk in A549 Cells [J]. Iran J Pharm Res. 2016,15(2): 483-9.

[7] Arora R, Bharti V, Gaur P, et al. Operculina turpethum extract inhibits growth and proliferation by inhibiting NF-κB, Arch Oral Biol.2017,Mar 20,80: 1-9.

[8] 付婷,唐運(yùn)蓮,甘潤(rùn)良.非可控性炎癥的惡性轉(zhuǎn)化 [J].腫瘤醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2013；13（12）：2377-2382。

[9] Ryan C. Branski, Zhou H, Vlad C, et al. Cyclooxygenase-2 Signaling in Vocal Fold Fibroblasts [J]. Laryngoscope. 2010, Sep; 120(9): 1826-1831.

[10] 劉文斌,曹廣文.癌癥進(jìn)化發(fā)育學(xué):基于炎癥-癌轉(zhuǎn)化研究的學(xué)說(shuō) [J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志.2017,24(2):103-111。

The Correlation Analysis of COX-2 and WT-p53 Expression in Acute Myeloid Leukemia

CHEN Shao-wei, CHEN Xiu-hua, TAN Yan-hong, , XU Zhi-fang, XU Lian-rong*

The Second Hospital of Shanxi Medical University, Shanxi Taiyuan 030001, China.

Objective To analyze correlation and clinical significance of cyclooxygenase-2 (COX-2) and Wild type p53 (WT-p53) in acute myeloid leukemia (AML). Methods Expression level of COX-2 and WT-p53 was detected by RT-qPCR. Results The average relative quantity of COX-2 mRNA in 21 normal control patients, 37 incipient patients and 24 relapsed patients were 1.09±0.09, 2.36±0.39 and 4.82±0.58, respectively; while that of WT p53 in three groups were 0.99±0.13, 0.48±0.06, 0.20±0.05, respectively. COX-2 expression was negatively correlated with WT p53 expression in AML. This relationship was correlated with peripheral blood leukocyte count and leukemia cell percentage. Conclusions COX-2 over-expression and WT p53 low expression are related to the development of AML. The inflammatory micro-environment may lead to the recurrence of AML by regulating the expression and interaction of both.

Leukemia; Myeloid; Acute; Cyclooxygenase-2; WT p53; Relapse; Inflammation

10.19335/j.cnki.2096-1219.2017.08.36