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    活體熒光成像儀用于小鼠細(xì)菌感染的監(jiān)測

    2017-08-30 11:40:44張秋麗張艷春史榮輝付秋霞詹林盛
    中國醫(yī)學(xué)裝備 2017年8期
    關(guān)鍵詞:成像儀活體銅綠

    吳 濤 周 俊 陳 震 張秋麗 晉 晶 張艷春 史榮輝 付秋霞 詹林盛

    活體熒光成像儀用于小鼠細(xì)菌感染的監(jiān)測

    吳 濤①周 俊①陳 震①張秋麗①晉 晶①張艷春①史榮輝①付秋霞②詹林盛②

    目的:建立一種膿毒血癥小鼠模型,對細(xì)菌感染情況進行非損傷性成像。方法:采用活體熒光成像儀對發(fā)光細(xì)菌進行體外成像,通過小鼠尾靜脈注射銅綠假單胞菌(典型的革蘭氏陰性細(xì)菌)誘導(dǎo)膿毒血癥建立小鼠模型,利用活體成像分析小鼠體內(nèi)的細(xì)菌感染情況。結(jié)果:反映細(xì)菌熒光素酶活性的細(xì)菌生物發(fā)光讀數(shù)與通過常規(guī)計數(shù)確定的細(xì)菌菌落形成單位(CFU)數(shù)呈正相關(guān)。細(xì)菌感染小鼠的存活率對不同濃度水平的細(xì)菌感染有劑量和時間依賴性。結(jié)論:活體熒光成像儀可檢測細(xì)菌生物發(fā)光讀數(shù),可以應(yīng)用于監(jiān)測小鼠感染細(xì)菌增殖的變化。

    成像;細(xì)菌感染;膿毒血癥;存活率;監(jiān)測

    銅綠假單胞菌是一種重要的機會性病原體,可在囊性纖維化(cystic fibrosis,CF)或非CF支氣管擴張癥患者中引起慢性肺部感染[1-3]。研究微生物發(fā)病機制的常規(guī)模型,通常使用單獨的動物組來確定動物的存活率,如半數(shù)致死量(lethal dose,LD50)和(或)死亡時間分析,或通過在不同時間點處死動物,計數(shù)特定組織的細(xì)菌病原體來研究感染過程。相比之下,生物發(fā)光成像(bioluminescence imaging,BLI)模型允許從同一動物獲得感染和存活的時間和空間分析數(shù)據(jù)。本研究通過小鼠尾靜脈注射銅綠假單胞菌(典型革蘭氏陰性細(xì)菌)誘導(dǎo)膿毒血癥小鼠模型,通過體內(nèi)成像證實并分析小鼠的感染情況。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與菌株

    (1)實驗動物。選用60只雄性C57BL/6小鼠,6~8周齡,體重為18~22 g,購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級條件飼養(yǎng)。其中細(xì)菌感染實驗小鼠20只,采用隨機分組方法分為4組,每組5只;小鼠存活率實驗小鼠40只,采用隨機分組方法分為4組,每組10只。

    (2)菌株。銅綠假單胞菌Xen 13菌株,Perkin-Elmer,Waltham,MA。

    1.2 主要儀器與試劑

    (1)儀器設(shè)備。IVIS 50型活體熒光成像儀(美國Caliper公司);Spectra Max M5型多功能酶標(biāo)儀(美國Mocecular Devices公司);3K15型臺式冷凍離心機(美國Sigma公司);BS210S型電子天平(北京賽多利斯公司);YT-CJ-2ND超凈工作臺(北京亞泰科隆公司);ASV-3023型消毒鍋(日本SAKURA公司);THZ-C型恒溫振蕩器(江蘇太倉市實驗設(shè)備廠);MINI型恒溫培養(yǎng)箱(北京若比鄰電子公司);BCD-165C型冰箱(韓國三星公司);Thermo SCIENTIFIC型-80℃超低溫冰箱(美國熱電公司)。

    (2)試劑。LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基(北京化工試劑廠);磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS)、異氟烷購自山東科源制藥有限公司。

    1.3 實驗細(xì)菌的制備

    生物發(fā)光的銅綠假單胞菌Xen 13菌株(來源于PerkinElmer公司,Waltham,MA)用于本研究。對于每個實驗,將來自冷凍的細(xì)菌原種樣品接種到新鮮培養(yǎng)基中并生長至對數(shù)中期(約3 h)。通過連續(xù)稀釋和在腦-心浸液瓊脂上計數(shù)來計數(shù)細(xì)菌。將細(xì)菌用PBS洗滌兩次,并基于600 nm處的光密度,重懸細(xì)菌于PBS中,獲得適當(dāng)數(shù)目的菌落形成單位(colony forming units,CFU)。

    1.4 細(xì)菌數(shù)量的確定

    (1)配制LB液體培養(yǎng)基。1 L去離子水中加入胰蛋白胨10 g,氯化鈉10 g、酵母提取物5 g,高壓滅菌后備用。

    (2)配制LB固體培養(yǎng)基。在LB液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂,高壓蒸氣消毒,待培養(yǎng)基溫度降低后加入抗生素倒平板,置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    (3)PBS。1 L去離子水中加入8 g氯化鈉、3.628 g磷酸氫二鈉、0.2 g氯化鉀、0.24 g磷酸二氫鉀,鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4,高壓滅菌后備用。

    (4)配制LB液體、固體培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿高壓滅菌后,以1%的菌量接種于100 ml培養(yǎng)基中,37 ℃搖床,待其菌液吸光度值在0.5時(約3 h)停止培養(yǎng)。將菌液轉(zhuǎn)移至50 ml滅菌離心管中,4 ℃,以20 cm離心半徑、4000 r/min離心15 min。棄上清,加入4 ml培養(yǎng)基及1 ml甘油后,用槍吹打均勻。微量離心管(eppendorf tube,EP)分裝1 ml菌液后,置于-80 ℃冰箱冷凍保存。菌液10倍系列稀釋,吸取100 μl細(xì)菌稀釋液涂板進行培養(yǎng)。根據(jù)1個OD 600(600 nm波長時的吸光度OD值)=1~3×108細(xì)胞/ml推算約略所需要的稀釋度,以便在取用0.1 ml的稀釋液涂抹在LB平板時,可得到菌落數(shù)為30~300 cfu。

    1.5 發(fā)光細(xì)菌的體外成像

    吸取菌液200 μl至酶標(biāo)板中,重復(fù)3孔。PBS 200 μl加入酶標(biāo)板的細(xì)菌原液孔中,用PBS進行倍比稀釋,每份菌液共計8孔。使用成像儀對發(fā)光細(xì)菌進行體外成像。

    1.6 細(xì)菌感染

    將4組20只細(xì)菌感染實驗小鼠(每組5只)用小鼠固定器固定,用吸取細(xì)菌溶液的注射器經(jīng)其尾靜脈注射細(xì)菌200 μl,感染每只實驗小鼠。注射結(jié)束后將小鼠放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

    1.7 小動物活體成像

    用1%~3%異氟烷麻醉小鼠至停止活動后,將其放入活體成像儀中,打開麻醉氣體開關(guān),并保持1%~2%的異氟烷持續(xù)麻醉。根據(jù)注射細(xì)菌數(shù)量不同,選取自動活體成像模式,1~5 min不等,成像結(jié)束后,將實驗動物放回動物飼養(yǎng)箱中。

    1.8 小鼠存活率

    將4組40只存活率實驗小鼠(每組10只)分別通過其尾靜脈注射5×107cfus/ml、1×108cfus/ml、1.5×108cfus/ml和2×108cfus/ml不同濃度的細(xì)菌200 μl,感染實驗小鼠。細(xì)菌注射后72 h觀察每組小鼠的存活數(shù)量,計算小鼠存活率。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

    采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示。兩組數(shù)據(jù)進行比較時采用t檢驗。多組間進行比較時:若組間方差齊時,采用單因素多水平設(shè)計定量資料方差分析(ANOVA);組間方差不齊時,采用非參數(shù)檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 細(xì)菌體外成像

    為了非侵入性地對細(xì)菌感染進行成像,采用生物發(fā)光的銅綠假單胞菌Xen 13菌株。首先對細(xì)菌進行體外成像,以證實熒光素酶活性與細(xì)菌數(shù)目成正相關(guān)(如圖1所示)。

    圖1 不同CFU數(shù)量的細(xì)菌熒光素酶活性的體外成像

    注:倍比稀釋后不同數(shù)量細(xì)菌200 μL加入酶標(biāo)板進行成像,探討熒光素酶活性與細(xì)菌CFU數(shù)目的關(guān)系。

    2.2 活體熒光成像監(jiān)測銅綠假單胞菌在小鼠體內(nèi)的感染

    生物發(fā)光強度與通過常規(guī)計數(shù)確定的細(xì)菌CFUs數(shù)相關(guān),表明生物發(fā)光成像可用于監(jiān)測細(xì)菌存活的變化(如圖2所示)。

    圖2 小鼠注射不同CFU數(shù)量的細(xì)菌后24 h的生物發(fā)光成像

    2.3 銅綠假單胞菌感染數(shù)量與死亡率相關(guān)

    在每只感染1×107,2×107,3×107或4×107CFUs銅綠假單胞菌的小鼠中,死亡率有劑量和時間依賴性;4×107CFU組中的所有(100%)小鼠在感染后24 h死亡,而3×107CFU組中的小鼠在感染后24 h或48 h死亡(80%),在2×107CFU組中的小鼠在感染后24 h(20%)死亡。1×107CFU組中的所有小鼠存活至實驗結(jié)束,如圖3所示。

    圖3 不同CFU數(shù)量的細(xì)菌注射小鼠72 h后的存活曲線圖

    3 討論

    臨床中一旦確定為慢性感染,盡管頻繁使用抗生素治療,銅綠假單胞菌菌株仍可以保留在患者的肺中。銅綠假單胞菌感染具有高病死率,經(jīng)常導(dǎo)致彌散性感染,引起菌血癥及膿毒性休克[4-5]。為更好地觀察銅綠假單胞菌感染小鼠后在不同器官中的積聚及生物分布情況,本研究從小鼠尾靜脈注射發(fā)光細(xì)菌,通過體內(nèi)BLI分析熒光素酶陽性的器官,并確定肝臟是銅綠假單胞菌集聚的主要器官。BLI是一種用于檢測小型哺乳動物內(nèi)部發(fā)光細(xì)胞的方法。通過BLI可以非侵入性方式描述和研究宿主體內(nèi)病毒、寄生蟲和細(xì)菌病原體的傳播。目前,BLI正在成為一種用于研究藥物誘導(dǎo)的肝毒性、感染的免疫反應(yīng)和對活體動物治療效果進行量化的有效技術(shù)[6-8]。同一組動物可以在感染過程中根據(jù)需要的時間進行成像。BLI模型的潛在優(yōu)點是:①研究所需的動物數(shù)量更少;②隨著時間的推移,具有在同一動物中跟蹤疾病過程的能力;③潛在識別意外的傳播途徑[9-11]。病原體在感染的動物體內(nèi)發(fā)光,采用可檢測極少量光的高靈敏度照相機對其進行成像[12-13]。

    在本研究中,非發(fā)光的綠膿桿菌可以被遺傳修飾以表達lux基因(luxCDABE),成為可檢測信號的工程微生物,通過生物發(fā)光產(chǎn)生光的細(xì)菌luxCDABE操縱子適合在許多種細(xì)菌中用作生物報告物。與真核熒光素酶系統(tǒng)不同,luxCDABE操縱子編碼細(xì)菌熒光素酶和產(chǎn)生熒光素酶底物所必需的其他酶,消除了對發(fā)光需補充外源底物的要求。在氧的存在下,熒光素酶催化反應(yīng),產(chǎn)生光作為副產(chǎn)物。由組成型啟動子驅(qū)動的luxCDABE報告分子,其中細(xì)菌密度與發(fā)光直接相關(guān),提供了監(jiān)測綠膿桿菌生長的手段。此外,由于生物發(fā)光僅由活細(xì)菌產(chǎn)生,因此細(xì)菌存活也可以用luxCDABE報告物監(jiān)測。在不添加底物或滅活細(xì)菌的情況下檢測來自luxCDABE的生物發(fā)光信號,使其成為用于實時監(jiān)測細(xì)菌和高通量生物技術(shù)的理想報告物[14-16]。發(fā)光細(xì)菌的體外成像證實,細(xì)菌的熒光素酶活性與細(xì)菌的數(shù)目呈正相關(guān)。采用銅綠假單胞菌的細(xì)菌感染進行非侵入性成像。

    本研究建立了膿毒血癥小鼠模型。通過體內(nèi)成像分析小鼠的細(xì)菌感染情況。細(xì)菌的生物發(fā)光讀數(shù)與通過常規(guī)計數(shù)確定的細(xì)菌數(shù)相關(guān),表明活體熒光成像儀可以應(yīng)用于監(jiān)測細(xì)菌存活的變化。

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    The monitoring for mice with bacterial infection by using vivo fluorescence imager/

    WU Tao, ZHOU Jun, CHEN Zhen, et al//China Medical Equipment,2017,14(8):161-164.

    Objective: To establish a mouse model of sepsis and execute noninvasive imaging for mouse of bacterial infection. Methods: In vivo fluorescence imager was applied to achieve vitro imaging for luminous bacteria, and Pseudomonas aeruginosa (typical Gram-negative bacteria) was injected through tail vein to induce septicopyemia for establishing mouse model. And then, The bacterial infection of the mice were analyzed by using vivo imaging technique. Results: Bacterial bioluminescence readings which could reflect the activity of bacterial luciferase were positively correlated with bacterial colony forming units (CFU) which were confirmed through routine counting. The survival rate of infected mice depended on dose and time of bacterial infection of various concentration. Conclusion: In vivo fluorescence imager can detect bacterial bioluminescence readings and it can be used to monitor the changes of bacterial propagation for infected mice.

    Imaging; Bacterial infection; Sepsis; Survival rate; Monitoring

    Department of Blood Transfusion, Land Force General Hospital of PLA, Beijing, 100700 China.

    1672-8270(2017)08-0161-04

    R-331

    A

    10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.08.045

    2017-03-19

    ①陸軍總醫(yī)院輸血科 北京 100700

    ②軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液免疫室 北京 100850

    吳濤,男,(1971- ),博士,副主任技師。陸軍總醫(yī)院輸血科,從事臨床輸血研究工作。

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