PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞永生化細胞系的建立*

張鵬飛 張 硌* 陸 琤 周晨辰

PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞永生化細胞系的建立*

張鵬飛①張 硌①*陸 琤①周晨辰①

目的：建立PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)永生化細胞系，為全面研究PLEKHQ1基因功能提供細胞實驗材料。方法：采用慢病毒感染的方法將猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因導入已鑒定出基因型的MEF中，建立永生化細胞系；利用聚合酶鏈反應(PCR)檢測SV40大T抗原基因在MEF中的整合情況，利用反轉錄PCR及凝膠成像的方法觀察SV40大T抗原基因在MEF中的表達。結果：SV40大T抗原基因已整合至MEF中，且此類MEF已擴大培養(yǎng)及穩(wěn)定傳代半年之久。結論：成功建立的PLEKHQ1基因敲除MEF永生化細胞系，可為進一步研究PLEKHQ1基因功能提供細胞實驗材料。

基因PLEKHQ1；SV40大T抗原基因；慢病毒感染；胚胎成纖維細胞；永生化

基因PLEKHQ1(pleckstrin homology domain containing，family Q member 1Q1)，屬于含有PH結構域的蛋白超家族，生物信息學分析顯示，Q1可能參與細胞因子與受體的相互作用，并且可能在程序性細胞死亡調控過程中發(fā)揮作用[1-2]。但目前對其功能的研究尚無專業(yè)文獻報道。建立永生化的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)系是研究PLEKHQ1基因功能調控的重要基礎。由于分離MEF工作量大，原代MEF生存周期短，傳代次數(shù)有限，因此建立永生化的MEF很有必要，從而為細胞的長期培養(yǎng)和功能研究提供理想的方法和手段。本研究采用慢病毒感染的方法，將猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)大T抗原基因導入分離的已鑒定出基因型的MEF中，使其永生化[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)質粒與細胞。慢病毒包裝質粒PMD、SPA及pCDH-SV40；人胚腎上皮細胞(293T)，均由本研究實驗室保存。

(2)實驗動物。實驗動物為首次懷孕的C57BL/6雌鼠1只，懷孕12.5～14.5 d(懷9只胎鼠)，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級條件飼養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

(1)3111型細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；CLASS ⅡTYPE A2型超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾公司)；C1000 Touch型PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Thermo LABOFUGE 400R型低溫離心機(美國Thermofisher公司)；DYY-6D型電泳儀(北京市六一儀器廠)；WD-9413B型凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠)。

(2)KOD-FX高成功率聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)酶(日本TOYOBO公司)；高糖培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)均為美國GIBCO公司；胎牛血清(澳大利亞Hyclon公司)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。Q1引物由上海英俊生物有限公司合成。SV40大T抗原基因引物由北京天一輝遠有限公司合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠胚胎成纖維細胞的分離及原代培養(yǎng)

細胞分離及原代培養(yǎng)流程為：①取1只為首次懷孕的C57BL/6雌性妊娠小鼠(懷9只胎鼠)，斷頸處死；②無菌條件下取出小鼠子宮，分離胎鼠，PBS充分洗滌；③編號，將9只胎鼠的組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊，適量的胰蛋白酶消化液，輕輕吹打數(shù)次，室溫或37 ℃消化3～5 min；④加等體積含血清培養(yǎng)基終止消化，靜置3～5 min后收集上層懸液，實驗重復操作5次；⑤將15 ml的離心管放入吊籃式離心機中，1000 r/min，離心5 min，培養(yǎng)液[DMBM＋10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)]重懸細胞至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；⑥換液，細胞匯合度達80%以上后按1∶3～1∶5傳代[4-8]。

1.3.2 原代MEF細胞基因型鑒定

以1～9#小鼠組織MEF細胞為模板，進行PCR。Q1基因引物序列上游引物：GCTCATGGCAACAGCCCTCA；下游引物：GAGCCTTCCAGCCACAGTCTTAGG。擴增產(chǎn)物為283 bp。

PCR擴增反應體系：根據(jù)KOD-FX使用說明，按20 μl反應體系進行擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s、59 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；72 ℃ 5 min終止反應。

1.3.3 SV40大T抗原慢病毒的包裝及感染

(1)將PMD、SPA及pCDH-SV40以1∶3∶4的比例與100 μl無血清DMEM混勻，Lipofectamine 2000以2∶1(體積與質粒質量之比)比例與100 μl無血清DMEM混勻，室溫孵育5 min后，再將二者混勻，然后室溫孵育20 min后，將混合液加入293T細胞中，完成轉染。轉染8 h后換液，24～36 h后收上清，并將培養(yǎng)皿補至5 ml。約72 h后再次收取上清，3 000 r/min，離心5 min，取上清用0.22 μm濾器過濾后加入超濾管，3000 r/min，離心5 min，得約200 μl濃縮病毒，-40℃保存或立刻使用。

(2)將WT和KO型MEF細胞各鋪12孔板的一孔，約104細胞，然后取20 μl的濃縮病毒進行感染，3 d后換液。連續(xù)培養(yǎng)10 d后觀察SV40大T抗原基因在MEF細胞中的整合及表達情況。

1.3.4 SV40大T抗原基因在MEF細胞中的整合及表達

(1)PCR擴增。以連續(xù)培養(yǎng)10 d后的MEF細胞為模板，進行PCR。SV40大T抗原基因上游引物：5'-CGCAGTGAGTTTTTGTTAGA-3'；下游引物：5'-TGTGGTATGGCTGATTATGA-3'。擴增產(chǎn)物為391 bp。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；98℃變性10 s、56 ℃退火30 s、68 ℃延伸1 min，循環(huán)34次；72 ℃ 5 min終止反應。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

(2)反轉錄PCR分析。提取原代MEF細胞和永生化MEF細胞的RNA，逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，進行PCR。PCR反應體系及條件與鑒定整合情況一致。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2 結果

2.1 分離出的MEF細胞基因型鑒定結果

取PCR產(chǎn)物10 μl，加入6×Gel Loading后混勻，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像分析儀進行分析。1 μ9#MEF細胞的基因型如圖1所示。

圖1 1～9#原代MEF細胞的基因型凝膠成像

其中，1#、2#、3#、5#、6#和8#為雜合型細胞，4#、7#和9#基因型尚需進一步確定。本研究利用變性的方法進行確定，具體如下：分別取已確定為WT和KO基因型的PCR擴增產(chǎn)物各5 μ，然后分別與4#、7#和9#進行95 ℃變性5 min，自然冷卻至室溫。將上述各樣品進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像分析儀進行分析，其結果如圖2所示。

圖2 4#、7#和9#原代MEF細胞基因型變性后的凝膠成像

由此可以判斷4#、7#和9#的基因型分別為：KO、WT和KO，本研究選取了4#和7#進行慢病毒感染，即選取一對WT和KO型MEF細胞進行感染。

2.2 SV40大T抗原基因在MEF細胞中的整合

以質粒pCDH-SV40為模板作陽性對照，原代WT、KO型的MEF細胞為模板作陰性對照，采用PCR擴增的方法，鑒定SV40大T抗原基因在培養(yǎng)10 d后的MEF細胞中的整合情況。對PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像分析儀進行分析。結果如圖3所示。

圖3 SV40大T抗原基因在MEF細胞中的整合凝膠成像

2.3 SV40大T抗原基因在MEF細胞中的表達

以原代WT、KO型的MEF細胞的cDNA作陽性對照，采用PCR擴增的方法，鑒定SV40大T抗原基因在培養(yǎng)10 d后的MEF細胞中的表達情況。對PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，并利用凝膠成像分析儀進行分析。結果如圖4所示。

圖4 SV40大T抗原基因在MEF細胞中的表達凝膠成像

3 結論

相關文獻及前期實驗均已證明：原代培養(yǎng)的MEF細胞增殖能力弱，生長緩慢，生存周期短，極大地限制了對MEF細胞的相關研究。因此，永生化MEF細胞是當前組織工程學領域研究的熱點。

SV40是20世紀60年代初從猿猴腎細胞發(fā)現(xiàn)并分離出來的病毒，具有轉化動物細胞和誘發(fā)腫瘤的特性[9]。SV40大T抗原基因目前廣泛應用于建立轉基因動物模型和永生化各種人類及動物細胞的研究中，導入SV40大T抗原基因能加快轉化細胞的生長速率，并保留其原代細胞的許多分化表型[10-13]。

生物信息學分析顯示，Q1可能參與細胞因子與受體的相互作用，并且可能在程序性細胞死亡調控中發(fā)揮作用。本研究所建立的PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞永生化細胞系與原代MEF細胞相比，具有長久傳代、穩(wěn)定連續(xù)培養(yǎng)及反復凍存的特點。因此，使用永生化PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞系可為PLEKHQ1基因功能的相關研究提供細胞、蛋白質、DNA及RNA樣本，并且可減少因個體遺傳差異和生理狀態(tài)等對實驗的重復性帶來的影響。

本研究利用該方法建立的永生化PLEKHQ1基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞系已穩(wěn)定傳代半年之久，并且在形態(tài)結構上與原代細胞無明顯差異。

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Establishment of immortalized cell line of mouse embryonic fibroblasts derived from PLEKHQ1 gene knockout mice/

ZHANG Peng-fei, ZHANG Luo, LU Cheng, et al// China Medical Equipment,2017,14(8):158-160.

Objective: To establish an immortalized mouse embryonic fibroblast (MEF) cell line of PLEKHQ1 gene knockout mice in order to comprehensively research function of PLEKHQ1 gene and provide cell experiment materials. Methods: The method of slow virus infection was adopted to transfect gene of simian virus 40(SV40)large T antigen into MEF cell which have been identified genotype to establish an immortalized cell lines. Polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the integration of the genome of SV40 large T antigen in the mice embryonic fibroblast cell. Expression of SV40 large T antigen gene in MEF cell was identified by reverse transcription PCR and gel imaging. Results: The mRNA of SV40 T antigen gene has been integrated in cells of the immortalized cell line, and through observation, stable growth and serial propagation of the immortalized MEF cell have achieved for half the year. Conclusion: Successful establishment of the PLEKHQ1 knockout immortalized MEF cell line can provide cell experimental material for further study of PLEKHQ1 function.

PLEKHQ1; SV40 large T antigen; Slow virus infection; Embryonic fibroblast; Immortalization

Department of Medical Engineering, The 307thHospital of PLA, Beijing 100071, China.

1672-8270(2017)08-0158-03

R392-33

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.08.044

2017-04-31

國家自然科學基金(31400739)“PH結構域蛋白PLEKHQ1協(xié)調巨噬細胞遷移與激活的機制研究”

①解放軍307醫(yī)院醫(yī)學工程科 北京 100071

*通訊作者：marbleluo@126.com

張鵬飛,女,(1984- ),碩士，助理工程師。解放軍第307醫(yī)院醫(yī)學工程科，從事細胞信號轉導研究工作。