C-myc基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡在脂溢性角化病皮損中的意義

杜鎮(zhèn)，海藝貝，馮世軍，王艷心，王成，李保強(qiáng)

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；3.河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061000）

C-myc基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡在脂溢性角化病皮損中的意義

杜鎮(zhèn)1，海藝貝2，馮世軍3，王艷心1，王成1，李保強(qiáng)1

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000；3.河北省滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061000）

目的 觀察脂溢性角化?。⊿K）中C-myc基因表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況，探討脂溢性角化病的發(fā)病機(jī)制。方法 對(duì)66例脂溢性角化病皮損及10例正常皮膚組織采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)C-myc基因表達(dá)及原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)（TUNEL）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SK組皮損區(qū)C-myc基因陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比（21.94±19.45）%與對(duì)照組（0%）相比增加（P＜0.05）；66例SK皮損中有52例C-myc基因表達(dá)陽(yáng)性，對(duì)照組中均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，兩組陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TUNEL凋亡檢測(cè)中SK組的凋亡指數(shù)（53.01±31.97）與對(duì)照組（33.50±23.86）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Spearman相關(guān)性分析顯示，C-myc基因在SK皮損中陽(yáng)性細(xì)胞百分比與SK皮損中細(xì)胞凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 C-myc基因參與脂溢性角化病的發(fā)生發(fā)展，脂溢性角化病皮損中細(xì)胞凋亡有所增加。該結(jié)果對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制有一定的指導(dǎo)意義。

脂溢性角化病；免疫組織化學(xué)；C-myc基因；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年1月-2014年12月本院皮膚科就診的66例脂溢性角化病患者，經(jīng)臨床表現(xiàn)及病理學(xué)確診為SK。其中，男性39例，女性27例；平均（55.83±12.91）歲。正常組織10例。男性4例，女性6例；平均（48.00±12.61）歲。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.628，P=0.428；t=1.793，P=0.077）。

1.2 主要試劑與設(shè)備

C-myc基因工作液、即用型快捷型免疫組織化學(xué)Max VisionTM試劑盒羊抗鼠/兔和二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），TUNEL凋亡試劑盒（S7100）（購(gòu)自美國(guó) Millipore公司），S325石蠟切片機(jī)（英國(guó)Shandon Finesse公司），Wd750ASL23微波爐（廣東省順德格蘭仕集團(tuán)公司），BX40F4顯微鏡（日本Olympus公司），置入4℃冰箱保存（山東省青島海爾集團(tuán)公司），粘附載玻片（江蘇省海門(mén)世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色法 組織切片脫蠟至水，自來(lái)水沖洗，3%的過(guò)氧化氫H2O2室溫孵育10 min，枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)，血清封閉，滴加一抗，4℃過(guò)夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，吹干，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.3.2 脂溢性角化病組織標(biāo)本的凋亡檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，按TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，吹干，封片，鏡檢。用在配制末端轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT） 反應(yīng)液中不加TDT進(jìn)行標(biāo)記的組織切片作為陰性對(duì)照，用脫氧核糖核酸酶 I（Deoxyribonuclease I，DNase I）處理的組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野（×400倍），陽(yáng)性著色為棕黃色顆粒，不著色為陰性。計(jì)算5個(gè)視野中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比。結(jié)果評(píng)估根據(jù)Fromowitz[3]的綜合計(jì)分法進(jìn)行。在高倍鏡下（10×40）作如下評(píng)分：①陽(yáng)性程度：無(wú)著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。②陽(yáng)性細(xì)胞百分比：＜5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為 2分；51%～75%為 3分；＞76%為4分。兩項(xiàng)結(jié)果相加＜2分為陰性（－）；2～3分為弱陽(yáng)性（+）；4～5分為中度陽(yáng)性（++）；6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

其次，農(nóng)村化學(xué)品企業(yè)在中國(guó)農(nóng)村地區(qū)發(fā)展存在“污染天堂效應(yīng)”。在技術(shù)、市場(chǎng)以及資源等其他條件相同的情況下，環(huán)境規(guī)制對(duì)農(nóng)村化學(xué)品企業(yè)發(fā)展存在顯著的負(fù)向影響。此外，農(nóng)村招商引資優(yōu)惠、工業(yè)資本存量對(duì)農(nóng)村化學(xué)品企業(yè)的發(fā)展有顯著正向影響，技術(shù)因素對(duì)農(nóng)村化學(xué)品企業(yè)發(fā)展有顯著負(fù)向影響。

1.4.2 TUNEL凋亡檢測(cè)結(jié)果判定 正常細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，凋亡細(xì)胞呈不同程度的棕褐色。每張切片在凋亡細(xì)胞區(qū)域取5個(gè)高倍視野，計(jì)算平均每100個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)（%）表示凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Spearman法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C-myc基因在SK皮損中的陽(yáng)性表達(dá)

C-myc基因主要在角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核，廣泛分布于棘細(xì)胞層及基底層，表現(xiàn)為棕黃色（陽(yáng)性表達(dá)和陰性對(duì)照，見(jiàn)圖1、2），正常皮膚組織無(wú)表達(dá)（見(jiàn)圖3）。SK皮損區(qū)C-myc基因陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比（21.94±19.45）%與正常皮膚組織0%比較增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C-myc基因在SK皮損區(qū)-、+、++ 及 +++ 陽(yáng)性細(xì)胞例數(shù)分別為 14、28、22 和2，其陽(yáng)性率78.79%高于正常皮膚組織0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.436，P=0.000）。

2.2 細(xì)胞凋亡情況

TUNEL凋亡檢測(cè)中SK皮損組的凋亡指數(shù)（53.01±31.97）%與正常皮膚組織（33.50±23.86）%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.849，P=0.068）（見(jiàn)圖4、6），陰性對(duì)照組（見(jiàn)圖 5、7）。

圖1 C-myc基因在SK皮損中陽(yáng)性表達(dá)（Max Vision×100）

圖2 PBS代替一抗在SK皮損中陰性表達(dá)（Max Vision×100）

圖3 C-myc基因在正常皮膚組織中陰性表達(dá)（Max Vision×100）

圖4 SK皮損中細(xì)胞凋亡情況 （TUNEL×100）

圖5 反應(yīng)液中不加TDT時(shí)SK皮損中細(xì)胞凋亡情況（TUNEL×100）

圖6 正常皮膚組織中細(xì)胞凋亡情況 （TUNEL×100）

圖7 反應(yīng)液中不加TDT時(shí)正常組織中細(xì)胞凋亡情況（TUNEL×100）

2.3 相關(guān)性分析

C-myc基因在SK皮損中陽(yáng)性細(xì)胞百分比與SK皮損中細(xì)胞凋亡指數(shù)相關(guān)性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.098，P=0.436）。

3 討論

myc基因家族在許多腫瘤發(fā)展中處于重要地位，尤其是C-myc基因作為其中一員在許多惡性腫瘤的增殖與凋亡中發(fā)揮著重要的作用。目前，已知C-myc基因在胃癌及食管癌等腫瘤中高表達(dá)[4-5]。脂溢性角化病雖為常見(jiàn)的良性皮膚腫瘤，其病理表現(xiàn)為角化過(guò)度，角化不全，棘層肥厚，乳頭瘤樣增生，但臨床中也有惡變的報(bào)道[6-7]。因此，檢測(cè)C-myc基因在脂溢性角化病組織病損中的表達(dá)情況，有助于為脂溢性角化病的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，C-myc基因在SK皮損與正常皮膚組織中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與國(guó)外相關(guān)報(bào)道一致[8]。細(xì)胞增殖失控將導(dǎo)致尤其是惡性腫瘤的發(fā)生，顯然SK作為良性腫瘤其增殖并非無(wú)限，因此實(shí)驗(yàn)采用TUNEL法檢測(cè)SK細(xì)胞的凋亡情況，研究發(fā)現(xiàn)SK細(xì)胞凋亡指數(shù)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]，但整體發(fā)現(xiàn)SK皮損細(xì)胞凋亡程度較對(duì)照組有所增加。與PESCE等[10]研究較一致，且其認(rèn)為凋亡增加可能是由于表皮生長(zhǎng)因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）及125I-EGF 聯(lián)合下調(diào)的結(jié)果。另外，張春玲等[11]發(fā)現(xiàn)，凋亡基因Fas在SK中的表達(dá)較正常表皮細(xì)胞早，雖然兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但作為Fas的配體FasL在SK中比正常表皮表達(dá)更明顯。也有不同的報(bào)道，AHMED等[12]認(rèn)為SK的發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡受阻有關(guān)。有研究證實(shí)，作為凋亡抑制蛋白Survivin在SK 病損中高表達(dá)[8-9，13]，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，SK細(xì)胞的凋亡輕度增加與細(xì)胞增殖間的相互作用可能是其良性表現(xiàn)的原因。也有研究推測(cè)腫瘤抑制基因PTEN部分拮抗Survivin蛋白活性使得SK表現(xiàn)出良性過(guò)程[13]。細(xì)胞凋亡指數(shù)與C-myc基因在SK皮損中陽(yáng)性細(xì)胞百分比相關(guān)性無(wú)顯著意義。因此，不能表明C-myc基因的表達(dá)增加對(duì)脂溢性角化病細(xì)胞凋亡產(chǎn)生怎樣的影響，但研究發(fā)現(xiàn)C-myc基因不僅在SK，而且在原位鱗狀細(xì)胞癌（Bowen病）、鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)[8]?？梢?jiàn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖可能發(fā)揮著重要的作用。雖然脂溢性角化病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但C-myc基因作為雙向調(diào)節(jié)腫瘤增殖與凋亡基因在SK皮損中的高表達(dá)，必然對(duì)該病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生不可忽視的作用。

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Significance of C-myc expression and cell apoptosis in seborrheic keratosis

Zhen Du1,Yi-bei Hai2,Shi-jun Feng3,Yan-xin Wang1,Cheng Wang1,Bao-qiang Li1
(1.The Affiliated Hospital of Chengde Medical University,Chengde,Hebei 067000,China;2.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou,Guangdong 510000,China;3.Cangzhou Central Hospital,Cangzhou,Hebei 061000,China)

ObjectiveTo observe the expression of C-myc and apoptosis in seborrheic keratosis (SK)and investigate the pathogenesis of SK.MethodsImunohistochemistry was used to detect the expression of C-myc,and the apoptosis of cell were detected by TUNEL in 66 SK lesions and 10 normal controls.ResultsThere was no significant difference in gender and age between the two groups(P＞0.05).The percentage of C-myc positive cells(21.94±19.45)%in SK lesions were significantly higher than that in the control groups(0)(P ＜0.05).The protein of C-myc was positively expressed in 52 cases of the 66 SK lesions while none was expressed in the control groups (P＜0.05).There was no significant difference in apoptotic index between SK lesions(53.01±31.97)and the control groups(33.50±23.86)by TUNEL(P＞0.05).There were no significant correlation between the percentage of C-myc protein positive cells and the apoptosis index in SK lesions by spearman analysis (P＞0.05).Conclusions C-myc protein is involved in the occurrence and development of SK,and the apoptosis of SK is increased.

seborrheic keratosis;immunohistochemistry;C-myc;TUNEL

R739.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.008

1005-8982（2017）11-0041-04

2017-02-03

李保強(qiáng)，E-mail：dermlbq@126.com