小鼠膽鹽依賴脂肪酶蛋白原核表達載體的構(gòu)建與蛋白制備

楊奕+宋還雷+錢林溪

[摘要] 目的 構(gòu)建小鼠膽鹽依賴脂肪酶（BSDL）重組蛋白的大腸埃希菌原核表達載體，制備具有生物學(xué)活性的小鼠BSDL蛋白。 方法 首先應(yīng)用PCR合成mBSDL的cDNA序列，克隆至原核表達載體pET-28b，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌表達菌種BL21（DE3）感受態(tài)細胞，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達。使用His Trap FF crude柱純化重組mBSDL蛋白。Western blot鑒定后采用尿素濃度梯度降低法進行透析復(fù)性。 結(jié)果 成功構(gòu)建原核表達載體pET-28b-mBSDL，實現(xiàn)該蛋白在E.coli BL21（DE3）表達菌種中的高效表達，并且表達蛋白主要存在于包涵體中。Western blot示獲得較好的純化效果且純化后成功復(fù)性。 結(jié)論 成功構(gòu)建mBSDL基因的原核表達質(zhì)粒并制備具有活性功能的膽鹽依賴脂肪酶，為進一步研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 重組蛋白表達；原核表達載體；mBSDL蛋白；蛋白純化

[中圖分類號] R392 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（b）-0008-04

Construction of prokaryotic expression vector and preparation of mouse bile salt dependent lipase protein

YANG Yi SONG Huanlei QIAN Linxi

Xinhua Hospital Affiliated to School of Medicine of Shanghai Jiaotong University Shanghai Institute for Pediatric Research Shanghai Key Laboratory of Pediatric Gastroenterology and Nutrition， Shanghai 200092， China

[Abstract] Objective To construct a prokaryotic expression system for mBSDL in E. coli BL21 （DE3） cells and prepare the active mBSDL protein. Methods mBSDL cDNA was amplifed via PCR and inserted into the prokaryotic expression vector pET-28b. The expression of recombinant protein was induced by IPTG in E. coli BL21 cells. Then it was purified via His Trap FF crude purification system and refolded via dialysis system. The specificity of mBSDL protein was analyzed by Western blot. Results The prokaryotic expression vector pET-28b-mBSDL expressing mBSDL protein was successfully constructed and transformed into E. coli BL21（DE3） cells. The mBSDL protein was present as insoluble inclusion bodies in the bacterial extract. Western blot reveled that the purification of this recombinant protein was successful. Conclusion mBSDL protein in E. coli prokaryotic expression system is established successfully. The study provides some foundation for the further analysis of mBSDL protein.

[Key words] Recombinant protein expression； Prokaryotic expression； mBSDL protein； Protein purification

膽鹽依賴脂肪酶（bile salt dependent lipase，BSDL）為脂肪酶族成員，主要存在于哺乳動物的胰液中，經(jīng)合成分泌進入十二指腸，膽鹽激活后聯(lián)合胰腺內(nèi)其他相關(guān)脂肪酶參與三酰甘油、膽固醇酯、磷脂及脂溶性維生素的消化和吸收[1]。BSDL還可見于乳腺及乳汁中，濃度為100～200 μg/mL[2]。近期研究表明，除促進消化外，還具有促進細胞增殖、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[3-5]。BSDL蛋白的多種生理功能，對于疾病的診斷及治療具有明顯的促進作用[6-8]。目前國內(nèi)少有關(guān)于BSDL蛋白的研究報道。研究BSDL蛋白在體內(nèi)外的功能，獲得高質(zhì)量的蛋白是前提條件。本研究旨在采用分子克隆技術(shù)及大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)制備具有生物學(xué)活性的小鼠BSDL蛋白。為后續(xù)課題進一步研究BSDL蛋白的生物學(xué)功能奠定實踐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株、質(zhì)粒及實驗動物 pET-28b載體購自Novagen公司；克隆宿主菌株E.coli Top10、表達宿主菌株E.coli BL21 （DE3）為本實驗室保存。C57BL/6J雌性小鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院動物實驗中心提供。動物合格證號：SYXK（滬）2003-0031。

1.1.2 試劑 EcoR I、Nde I 限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗BSDL抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；卡那霉素、IPTG、DNA marker、BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司；protein marker、TRIzol RNA提取試劑、ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Thermo Scientific公司；PCR產(chǎn)物膠純化回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 pET-28b-mBSDL原核表達載體的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)小鼠BSDL基因的DNA序列，設(shè)計一對擴增引物，上游引物為5'-CGCCATATGGCAAAGTTGGGGG？鄄CTG-3'，下游引物為5'-ATAGAATTC TTAGAAGCCA？鄄ATGGTGG-3'。在引物兩端分別插入EcoR I和Nde I的酶切位點和保護堿基。取10日齡雌性C57BL/6J小鼠乳腺組織100～200 mg，TRIzol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。以2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進行PCR反應(yīng)。結(jié)束后擴增產(chǎn)物進行1% 瓊脂糖電泳（100 V，30 min），膠回收擴增目的基因片段后，用EcoR I和Nde I雙酶切PCR產(chǎn)物和pET-28b空載體。酶切產(chǎn)物進行電泳，回收目的片段和質(zhì)粒大片段用T4連接酶4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細胞，加LB培養(yǎng)基，復(fù)蘇培養(yǎng)1.5 h后，離心。將菌體沉淀均勻涂布至含有100 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)皿中。倒置于37℃培養(yǎng)箱中過夜，次日自培養(yǎng)皿挑取單菌落接種到加入卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)4 h后，取2 μL菌液進行PCR鑒定。收集細菌提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定后，將含目的片段的質(zhì)粒DNA送上海生工公司測序。

1.2.2 重組mBSDL蛋白的原核表達 用CaCl2法制備E.coli BL21（DE3）表達菌種的感受態(tài)細胞，將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞，涂布于含有100 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上，電泳篩選陽性表達株。挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)后取40 mL菌液接種于4 L表達培養(yǎng)基（含100 μg/mL卡那霉素），37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)2～3h，OD600達到0.4～0.6后，加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.5～1 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3～5 h。誘導(dǎo)前后各取1 mL菌液，離心沉淀進行SDS-PAGE分析。收集表達產(chǎn)物，離心后采用酶解和超聲結(jié)合的方法進行菌體裂解。冰浴下超聲破菌，離心后取上清、沉淀進行SDS-PAGE 分析，確定目的蛋白是否表達。

1.2.3 重組mBSDL蛋白包涵體的處理 菌體沉淀用適量的包涵體洗滌緩沖液重懸后，攪拌洗滌20～30 min，于4℃，12000 r/min離心15 min，棄去上清液。重復(fù)一次。再用適量的50 mmol/L Tris pH 8.0溶液洗滌一遍，以去除殘留的EDTA。之后于4℃ 12 000 r/min離心15 min，棄去上清液。沉淀用適量的包涵體溶解緩沖液重懸后，室溫5～6 h直至大部分溶解。離心收集上清液。

1.2.4 重組mBSDL的純化和Western blot鑒定 使用His Trap FF crude 柱純化重組mBSDL蛋白。平衡柱后用1 mL注射器將澄清的包涵體溶液注入流路，流速≤1 mL/min。在上樣過程中，連續(xù)不斷地攪拌樣品以防止沉淀。用10～15個柱床體積的結(jié)合緩沖液沖洗，直到吸收曲線穩(wěn)定在基線。洗脫時用含50、100、500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液分部洗脫。分部洗脫時，洗脫5個柱床體積，每個濃度咪唑收集2個柱床體積洗脫液，并進行SDS-PAGE檢測。

純化后蛋白進行Western blot分析。一抗用抗BSDL抗體，二抗用辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG抗體。TBST洗滌后，將ECL發(fā)光液均勻鋪在條帶正面，覆蓋保鮮膜，放入美國Bio-Rad公司ChemiDoc XRS儀器中收集信號。

1.2.5 重組mBSDL蛋白純化后復(fù)性與酶活測定 采用尿素濃度梯度降低法進行透析復(fù)性。將洗脫液置于透析袋內(nèi)，采用7 mol/L的尿素溶液作為起始透析液，每4～8小時逐漸稀釋降低透析外液中的尿素濃度，依次為6、5、4、3、2、1、0 mol/L。透析液中加入0.5 mol/L甘氨酸、10%甘油、0.4～1.0 mol/L Tris等重折疊介質(zhì)。采用速率法計算酶活性。雙蒸水調(diào)零，Nanodrop 2000分光光度計測量純化后蛋白樣品的OD405值，根據(jù)標準曲線方程計算得出酶活性。BSDL酶活性單位定義為：37℃，pH 7.5條件下，每分鐘催化1 pmol底物的脂肪酶的酶量為一個酶活性單位。

2 結(jié)果

2.1 mBSDL基因擴增鑒定

mBSDL基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，在預(yù)期位置出現(xiàn)約為1797 bp的單一條帶，與預(yù)期值相符。見圖1。

2.2 成功構(gòu)建mBSDL蛋白的原核表達載體

重組表達質(zhì)粒pET-28b-mBSDL雙酶切后形成兩條DNA片段，一條為原核表達載體片段，另一條為目的產(chǎn)物片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。測序驗證正確，與NCBI 數(shù)據(jù)庫提供的序列相似度為99.66%（圖3），成功構(gòu)建pET-28b-mBSDL重粒。

2.3 成功誘導(dǎo)mBSDL蛋白表達

將原核表達載體pET-28b-mBSDL 轉(zhuǎn)化大腸埃希菌表達菌種BL21（DE3）感受態(tài)細胞，菌落PCR，凝膠電泳結(jié)果示：多個單克隆均為陽性，單克隆1、單克隆2和單克隆3均獲得較大量的表達（圖4）。單克隆擴大培養(yǎng)后，應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，對蛋白表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE 蛋白變性電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未誘導(dǎo)組相比，IPTG 誘導(dǎo)后出現(xiàn)明顯的高表達蛋白條帶，且與預(yù)期蛋白的大小相符（67kD）。細菌總蛋白、誘導(dǎo)后細菌裂解上清液及細菌包涵體蛋白的SDS-PAGE電泳提示，重組mBSDL蛋白主要存在于包涵體中（圖5）。

2.4 重組mBSDL蛋白的純化復(fù)性

Western blot分析結(jié)果示純化后雜蛋白去除。根據(jù)蛋白質(zhì)標準判斷，目的蛋白相對分子質(zhì)量略小于70 kD，為67 kD，與預(yù)期蛋白大小相符（圖6）。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)計算目的條帶的灰度值，目的蛋白純度約為98%。隨后對復(fù)性的mBSDL進行測活，活性達到5.268 U/mL（30 s），5.358 U/mL（60 s）。

3 討論

分子克隆技術(shù)和原核表達系統(tǒng)是蛋白表達和生物合成最常用的方法[9]。本研究采用小鼠乳腺組織總RNA為模板，通過RT-PCR成功擴增出mBSDL基因編碼區(qū)全長序列，定向插入pET-28b載體中，雙酶切和測序均證實該重組質(zhì)粒的正確性。成功構(gòu)建了pET-28b-mBSDL原核表達載體，該研究所采用的pET表達系統(tǒng)利用T7啟動子，融合6個組氨酸便于蛋白質(zhì)純化，操作相對方便、快捷、需時較短，表達量大，僅需讀框正確即可[10]。IPTG誘導(dǎo)目的蛋白高表達后，分別提取細菌總蛋白，上清可溶蛋白和胞質(zhì)不可溶蛋白進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白主要存在于包涵體中。

包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸埃希菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，0.1～3.0 μm大小[11]。包涵體中的表達產(chǎn)物占總蛋白的50%以上[11-12]。因包涵體內(nèi)還含有其他非表達產(chǎn)物如宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、脂類及糖類等物質(zhì)，所以需要進行重組蛋白質(zhì)的純化。本實驗使用His Trap FF crude 柱，不同濃度咪唑分部洗脫非特異性結(jié)合蛋白，進行重組mBSDL蛋白純化并進行Western blot分析鑒定，最終獲得純度約為98%的mBSDL蛋白。細胞中功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。但由于包涵體在形成過程中，多肽濃度較高，無充足時間進行折疊，導(dǎo)致包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)、無定形的聚集體，不具有生物學(xué)活性[13]。因此，純化后必須人工復(fù)性，以恢復(fù)表達蛋白的天然構(gòu)象和生物學(xué)活性。本實驗采用連續(xù)尿素濃度梯度降低法進行透析復(fù)性處理。尿素濃度從7～0 mol/L緩慢降低，酶活測定提示該蛋白成功再折疊。此方法操作簡單，成本低，可行性大，是mBSDL蛋白可靠且有效的復(fù)性方法。BSDL蛋白N末端域為膽汁鹽結(jié)合、催化和N-糖基化的部位[14]。BSDL的水解活性是由絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸催化三聯(lián)體形成的[15]。BSDL的N-糖基化位點為第187位天冬酰胺[16]。研究表明，該糖基化作用改變多肽的構(gòu)象，增加了BSDL蛋白的穩(wěn)定性，且這一作用對其活性尚無明顯影響[16]。

本研究成功構(gòu)建了小鼠BSDL基因的原核表達質(zhì)粒，并對該基因的原核表達產(chǎn)物進行鑒定分析，成功表達出具有活性功能的重組mBSDL蛋白。這為下一步mBSDL蛋白的生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-04-12 本文編輯：蘇暢）