同步輻射串行晶體學(xué)靜電紡絲上樣實(shí)驗(yàn)技術(shù)

陳建樵1,2 汪啟勝1,2 李冰1,2 周歡1 崔瑩1 孫波1 王志軍1 何建華1

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同步輻射串行晶體學(xué)靜電紡絲上樣實(shí)驗(yàn)技術(shù)

陳建樵汪啟勝李冰周歡崔瑩孫波王志軍何建華

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所張江園區(qū) 上海201204） 2（中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

串行晶體學(xué)作為一種解析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的新方法，因其擁有室溫采集、輻射損傷低、時(shí)間分辨等優(yōu)勢(shì)而得到迅速發(fā)展。早期發(fā)展于自由電子激光的串行飛秒晶體學(xué)已成功實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)微小晶體結(jié)構(gòu)的解析。為了引入串行晶體學(xué)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，充分發(fā)揮第三代同步輻射的豐富資源和特點(diǎn)，基于上海光源BL17U1生物大分子線站，我們對(duì)串行晶體學(xué)上樣方法進(jìn)行了理論和實(shí)驗(yàn)研究，解決了靜電紡絲上樣方式在同步輻射上應(yīng)用的難題，用溶菌酶微小晶體論證了其可行性；同時(shí)探討了基于同步輻射的串行晶體學(xué)在毫秒時(shí)間尺度上的發(fā)展?jié)摿?，為光束線技術(shù)升級(jí)提供參考。

串行晶體學(xué)，同步輻射，靜電紡絲，室溫?cái)?shù)據(jù)采集，蛋白質(zhì)微晶

自20世紀(jì)70年代以來(lái)，同步輻射光源的應(yīng)用極大地促進(jìn)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Protein Data Bank, PDB)的統(tǒng)計(jì)顯示，所測(cè)定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)總量中有90%是利用X射線晶體衍射方法解析的。然而，基于同步輻射的X射線晶體學(xué)方法時(shí)常受到輻射損傷和蛋白質(zhì)晶體尺寸的限制，因此通常利用液氮提供100 K的低溫環(huán)境來(lái)增強(qiáng)蛋白質(zhì)晶體的輻射耐受能力。相對(duì)于室溫條件，這可以使得樣品的輻射劑量限制提高30倍，典型地約為30MGy。通常，同步輻射X射線晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)所用的晶體尺寸一般大于1000 μm，因而面對(duì)微米級(jí)蛋白質(zhì)晶體時(shí)，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)將面臨嚴(yán)峻的考驗(yàn)。

2011年，Chapman等首次利用基于X射線自由電子激光(X-ray Free Electron Laser, XFEL)的串行飛秒晶體學(xué)(Serial Femtosecond crystallography, SFX)方法實(shí)現(xiàn)了Photosystem I 200 nm?2 μm的微小晶體在室溫下的衍射數(shù)據(jù)收集。該方法對(duì)晶體尺寸的要求從幾十微米降至1 μm，甚至更小；且由于XFEL的飛秒級(jí)脈沖，探測(cè)設(shè)備在樣品損傷之前能夠收集足夠的衍射信號(hào)，即“損壞前衍射(Diffraction-before-destruction)”，從而更好地解決了輻射損傷問(wèn)題。串行晶體學(xué)方法的特點(diǎn)在于每顆晶體隨機(jī)取向地照射一張靜態(tài)衍射圖，再利用蒙特卡羅積分方法解析大量晶體的衍射數(shù)據(jù)，因此樣品消耗量較大，需要配套設(shè)計(jì)高效穩(wěn)定的樣品輸送裝置，目前廣泛應(yīng)用的上樣裝置有GDVN (Gas Dynamic Virtual Nozzle)、LCP jet (Lipidic Cubic Phase)、MESH (Microfluidic Electrokinetic Sample Holder) 等。

目前世界上先進(jìn)的第三代同步輻射光源超過(guò)20多臺(tái)，而能開(kāi)展SFX實(shí)驗(yàn)的自由電子激光裝置僅有不到5臺(tái)。若將這種串行晶體學(xué)的樣品輸送方法應(yīng)用于傳統(tǒng)的同步輻射X射線晶體學(xué)，將突破其面臨的難以解析微小晶體結(jié)構(gòu)的瓶頸，從而提高同步輻射的應(yīng)用效率，充分發(fā)揮其作用，因此開(kāi)展同步輻射串行晶體學(xué)(Serial Synchrotron crystallography, SSX)研究具有重要意義。結(jié)合同步輻射自身特點(diǎn)，目前已開(kāi)展研究微流體芯片、網(wǎng)格薄片等固定微小晶體的上樣方式，用于微小晶體的室溫?cái)?shù)據(jù)采集，但這種固定式上樣法樣品處理繁瑣。而SSX也可采用SFX更適用的約束流動(dòng)式上樣法實(shí)現(xiàn)室溫下持續(xù)輸運(yùn)含有微小晶體的細(xì)流到曝光區(qū)域，目前LCP jet和毛細(xì)管(capillary)上樣方式已成功驗(yàn)證了SSX在同步輻射毫秒級(jí)曝光下解析室溫微小晶體結(jié)構(gòu)的可行性。本文將著重探討另外一種約束流動(dòng)式上樣法——采取靜電紡絲原理形成微小射流來(lái)輸運(yùn)微小晶體的靜電紡絲上樣法，在上海光源BL17U1線站首次開(kāi)展并解決了其在同步輻射上的實(shí)現(xiàn)方法和應(yīng)用難題，論證其可行性及發(fā)展前景。

1 靜電紡絲上樣裝置簡(jiǎn)介

靜電紡絲原理是利用靜電場(chǎng)對(duì)帶極化電荷的液滴表面施加靜電力以克服液面張力，形成圓錐形液面即泰勒錐，并在液滴尖端產(chǎn)生微米級(jí)及以下的細(xì)小射流，在納米纖維等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

基于BL17U1線站現(xiàn)有設(shè)備，我們對(duì)靜電紡絲上樣裝置進(jìn)行兼容性設(shè)計(jì)，其主要有觀測(cè)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、靜電控制系統(tǒng)及樣品輸送系統(tǒng)，見(jiàn)圖1。

圖1 靜電紡絲上樣裝置示意圖

觀測(cè)系統(tǒng)兼容于上海光源BL17U1線站測(cè)角儀平臺(tái)，顯微鏡通過(guò)光束同軸的反射鏡觀察紡絲現(xiàn)象，使用BluIce可視化界面進(jìn)行紡絲射流的定位，電荷耦合元件(Charge Coupled Device, CCD)探測(cè)器型號(hào)為ADSC Q315r；真空系統(tǒng)由不銹鋼鋼管連接照射區(qū)絕緣真空罩和外部真空腔，外部真空腔連接真空泵（機(jī)械泵和分子泵）以及真空測(cè)量?jī)x，真空罩兩側(cè)的通光窗由聚酰亞胺(kapton)膜密封，以降低X射線的衰減程度；靜電控制系統(tǒng)是在Coaxial-Mixer處的四通管一端連接直流高壓電源的正極，內(nèi)部的子液與其接觸而帶正電荷，同時(shí)將連接真空罩的空心不銹鋼鋼管接地，使得毛細(xì)管端口的子液與其垂直方向間距3?5mm的鋼管間形成靜電場(chǎng)，其強(qiáng)度由高壓電源調(diào)整；樣品輸送系統(tǒng)使用兩個(gè)0.1 mL Hamilton注射器分別存儲(chǔ)母液和子液樣品，其中母液是含有蛋白質(zhì)微小晶體的原生長(zhǎng)溶液，子液是具有一定導(dǎo)電性的粘稠溶液，后端的兩臺(tái)微流體泵（極限流量0.01μL?min）各自控制兩類溶液的流量，樣品經(jīng)注射器端口的連通管（美國(guó)，IDEX Health & Science公司）可連接不同口徑(5?540 μm)的毛細(xì)管（美國(guó)Molex公司），并在四通管Coaxial-Mixer內(nèi)實(shí)現(xiàn)兩類溶液的同軸流動(dòng)，大大緩解了接口堵塞的問(wèn)題。

2 影響因素

2.1 靜電紡絲形成

靜電紡絲的形成主要由溶液性質(zhì)（導(dǎo)電性、質(zhì)量密度、粘度、表面張力），環(huán)境變量（介電常數(shù)、靜電場(chǎng)分布）及操作參數(shù)（流量、施加電壓）決定，其理論模型如圖2所示。本實(shí)驗(yàn)主要考慮靜電紡絲形成的射流半徑和流速，以及穩(wěn)定長(zhǎng)度。靜電紡絲的射流口徑?jīng)Q定了微小晶體尺寸的適用范圍和X射線打擊位置，可控制在微米級(jí)以下，與噴口距離的關(guān)系見(jiàn)式(1)；射流的流量對(duì)應(yīng)不同半徑的流速，影響晶體的曝光時(shí)間和命中概率；穩(wěn)定射流隨著長(zhǎng)度的增加而變細(xì)，達(dá)到一定長(zhǎng)度時(shí)細(xì)流內(nèi)部的電荷排斥力會(huì)導(dǎo)致射流不穩(wěn)定或破裂成分散的小液滴，這對(duì)SFX的飛秒時(shí)間脈沖有潛在價(jià)值，但對(duì)于同步輻射光束的時(shí)間尺度而言，一定長(zhǎng)度的穩(wěn)定射流更適合作為曝光區(qū)域。

2.2 電壓與流量控制

為了控制靜電紡絲形成滿足要求的穩(wěn)定射流，根據(jù)靜電紡絲理論，需要提供一個(gè)臨界初始流量（由溶液的性質(zhì)決定）；控制電壓在一定范圍內(nèi)存在自我反饋調(diào)節(jié)機(jī)制以達(dá)到穩(wěn)定；當(dāng)電壓超出控制范圍而不能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定射流時(shí)，需再調(diào)節(jié)流量、溶液性質(zhì)或電極間的距離。

本實(shí)驗(yàn)直流高壓電源控制范圍在0?5000V，以體積分?jǐn)?shù)30%丙三醇溶液為測(cè)試樣品，采用內(nèi)徑100 μm 的毛細(xì)管，離接地端不銹鋼管口間距為3mm，研究了在0.2?1μL?min流量?jī)?nèi)達(dá)到穩(wěn)定射流的電壓范圍。由于導(dǎo)電端離端口有一定距離不能真實(shí)反映兩電極端的電場(chǎng)強(qiáng)度，因此以電源讀數(shù)為依據(jù)，如圖3所示在電壓升高的過(guò)程中，液滴的滴落頻率加快，當(dāng)達(dá)到臨界電壓值時(shí)液面擾動(dòng)消失而開(kāi)始在尖端出現(xiàn)穩(wěn)定射流；繼續(xù)升高電壓，圓錐液面高度降低但仍保持穩(wěn)定；直到最高電壓時(shí)開(kāi)始再次出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象；雖再反向降低電壓至滴落現(xiàn)象出現(xiàn)，其臨界電壓值因穩(wěn)定弛豫現(xiàn)象而比之前的值降低了100?200 V，但為了保證更好穩(wěn)定性而取更小范圍的控制電壓域。由圖4可知，在靜電紡絲的低流量區(qū)域，隨著流量增加，控制電壓閾值增大且穩(wěn)定范圍略微擴(kuò)大；同時(shí)由于丙三醇溶液導(dǎo)電性較差，可適當(dāng)添加質(zhì)量濃度1% NaCl以增強(qiáng)溶液導(dǎo)電性，同時(shí)有利于擴(kuò)展最低流量的限制。

圖3 高壓上升過(guò)程中的穩(wěn)定射流

除電壓控制外，流量控制也是靜電紡絲應(yīng)用的關(guān)鍵控制變量，在SFX中類似的MESH方法已實(shí)現(xiàn)了0.14?3.1μL?min的流量控制，這意味著樣品的消耗量更少、命中效率更高以及適用的微晶尺寸更小，因此實(shí)現(xiàn)靜電紡絲上樣系統(tǒng)的流量控制具有重要的實(shí)用價(jià)值。流量控制范圍除了受到電壓和溶液性質(zhì)的影響外，還與毛細(xì)管口徑有一定關(guān)系。然而只追求更低的流量并不適合于同步輻射串行晶體學(xué)，因?yàn)楦偷牧髁繒?huì)導(dǎo)致靜電紡絲半徑變小而流速加快，使得微晶曝光時(shí)間縮短，在同步輻射光通量不增加的情況下，獲取的衍射點(diǎn)強(qiáng)度滿足不了要求。因此，靜電紡絲在同步輻射應(yīng)用的關(guān)鍵是需要滿足射流半徑要求的前提下降低流量，而LCP上樣和毛細(xì)管上樣能實(shí)現(xiàn)同步輻射的應(yīng)用實(shí)質(zhì)也在于它們能在低流量下依靠管壁和高粘度LCP的約束，獲取與毛細(xì)管口徑相當(dāng)?shù)纳淞鳎ǖ湫偷?00 μm），以至于流速可減緩到微米每毫秒，從而匹配探測(cè)器的毫秒曝光時(shí)間，因此控制射流速度才是電壓和流量控制的主要選擇依據(jù)。

2.3 輻射劑量與流速

微小晶體的輻射劑量可由RADDOSE-3D軟件按照不同的晶體參數(shù)、線站光束參數(shù)及曝光時(shí)間計(jì)算。以微晶樣品尺寸10 μm×10 μm×30 μm為示例，BL17U1的光通量3.8×10s(12.4 keV，240mA)，聚焦光束尺寸為67 μm×23 μm (×)，在晶體無(wú)角度偏轉(zhuǎn)的理想情況下以室溫3MGy?nm輻射劑量為限制，則最長(zhǎng)曝光時(shí)間可為0.72s。那么晶體的流速在光斑50 μm照射下至少需達(dá)到0.069μm?ms，顯然靜電紡絲流速遠(yuǎn)大于此。

對(duì)于射流的速度選擇主要依據(jù)探測(cè)器的有效采集時(shí)間內(nèi)只出現(xiàn)一粒晶體的概率，這由光斑尺度、晶體尺度、晶體富集度以及射流半徑?jīng)Q定。無(wú)論LCP、毛細(xì)管還是靜電紡絲等約束流動(dòng)方式均可簡(jiǎn)化為如圖5所示的射流照射理想模型。假定射流半徑范圍在/2?，只允許一粒晶體通過(guò)射流橫截面，則相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)關(guān)系見(jiàn)式(2)。其中：代表兩粒晶體間的平均間隔距離；表示射流速度；代表探測(cè)器有效時(shí)間內(nèi)實(shí)際采集范圍；代表探測(cè)器在有效時(shí)間范圍只獲取一顆晶體衍射數(shù)據(jù)的概率見(jiàn)式(3)，當(dāng)晶體間距滿足一定概率分布函數(shù)()時(shí)則概率如式(4)。對(duì)于靜電紡絲射流的半徑會(huì)隨著長(zhǎng)度增加而減小，則由初始位置到結(jié)束位置的加權(quán)平均取值如式(5)；晶體尺度由晶體體積對(duì)應(yīng)的理想球體直徑取值。

圖5 理想射流照射模型

(3)

(4)

以晶體尺度為20 μm為例，流量范圍0.1?3μL?min下，不同變量參數(shù)條件下晶體最長(zhǎng)曝光時(shí)間與流量間的關(guān)系見(jiàn)圖6(a)，可知其主要受到光斑尺寸和射流半徑的影響。照射概率與流量間的關(guān)系見(jiàn)圖6(b)，其受到的影響因素較多，其中晶體富集度對(duì)照射概率影響起主要作用，可作為重要的控制變量來(lái)提高命中概率。

圖6 不同條件下晶體最長(zhǎng)曝光時(shí)間(a)、固有照射概率(b)與流量的關(guān)系

Fig.6 Maximum expose time (a) and intrinsic probability of hits (b) related to flow rate in different conditions.

2.4 真空與子液

靜電紡絲在同步輻射上應(yīng)用的最大困難在于高強(qiáng)度的X射線對(duì)空氣等介質(zhì)的電離作用嚴(yán)重干擾了靜電紡絲所需的靜電場(chǎng)分布，導(dǎo)致液滴尖端的射流失敗，參見(jiàn)圖7。雖然可以通過(guò)衰減光通量和減小光斑尺寸來(lái)降低干擾，但同時(shí)也降低了衍射數(shù)據(jù)質(zhì)量。因此，我們考慮通過(guò)提供真空環(huán)境(10Pa)形成射流以消除干擾。然而水溶液樣品在真空中易蒸發(fā)而凝結(jié)，且高鹽度的母液在噴口處會(huì)沉淀而堵塞，導(dǎo)致靜電紡絲的形成不穩(wěn)定。為解決這些問(wèn)題，本文參考同軸靜電紡絲原理，配置不易蒸發(fā)的外層子液來(lái)形成靜電紡絲從而保護(hù)射流中心的母液，例如常見(jiàn)的丙三醇、甲基丙二醇(2-Methl-1,3- Propanediol, MPD)、聚乙二醇 (Polyethylene glycol, PEG)等實(shí)驗(yàn)溶劑；并且中心區(qū)的母液樣品可無(wú)需帶高壓和添加調(diào)節(jié)劑，這使得母液可以保持樣品原始生長(zhǎng)環(huán)境，又避免了靜電荷對(duì)晶體的潛在影響。

圖7 靜電紡絲在空氣電離干擾下的變化

子液的選擇原則在于液體的粘性和可用性。首先考慮其是否能抵抗低真空，其次考慮是否與母液兼容。由于在噴口處兩相流混合的時(shí)間由溶液性質(zhì)和流速等決定，因此可以在子液中添加反應(yīng)物以進(jìn)行不同時(shí)間尺度的結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)研究，這是同軸射流的一個(gè)潛在應(yīng)用。其中MPD是一種理想的選擇，這類溶液對(duì)附著在毛細(xì)管尖端的糖類或鹽類沉淀的防護(hù)效果較佳；在流速增加情況下，高粘度的丙三醇和PEG溶液與MPD相比，保護(hù)效果是較差的；油脂類須考慮其脫氣現(xiàn)象以及對(duì)后端真空組件的影響。

實(shí)驗(yàn)時(shí)采用的母液含15% NaCl，在真空中快速脫水而形成沉淀，丙三醇常作為晶體生長(zhǎng)的沉淀劑和同步輻射晶體學(xué)中的晶體樣品冷凍保護(hù)劑，并有實(shí)驗(yàn)觀察到25%?40%丙三醇在低真空下能產(chǎn)生穩(wěn)定的電紡絲，故采取在低濃度鹽溶液中添加30% 丙三醇作為外層子液。

2.5 樣品準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)樣品采用SFX方法學(xué)研究常用的溶菌酶晶體作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，以便實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比。將高純度的溶菌酶(40000U?mg)配置成濃度12 mg?mL，并添加0.5mol?L醋酸；母液的配制為0.5 mol?L醋酸、6% PEG6000、質(zhì)量濃度15% NaCl、pH 3.4。采用懸滴法結(jié)晶，液滴中蛋白溶液與母液的比例為1.5:0.5，結(jié)晶板置于4 oC環(huán)境中，12 h后即可得到大量尺寸均勻的溶菌酶微晶樣品，典型尺寸是10mm×10mm×30mm，如圖8所示。

根據(jù)子液的選擇原則，制備的溶菌酶樣品采取含有質(zhì)量濃度1% NaCl和體積分?jǐn)?shù)30%丙三醇的溶液作為子液，穩(wěn)定時(shí)間范圍在2 h，電壓控制在3000?5000 V。該樣品能在樣品傳輸系統(tǒng)中長(zhǎng)時(shí)間保持均勻性而不易在管內(nèi)沉淀，對(duì)于易沉淀的樣品則需額外增加搖擺儀。

圖8 溶菌酶微小晶體樣品

2.6 操作流程

樣品的提取操作：首先將懸滴法生長(zhǎng)的小液滴收集到小管中，可進(jìn)一步過(guò)濾掉大顆粒的晶體，防止堵塞，本實(shí)驗(yàn)樣品尺度均小于100mm可不必此操作；然后按10mL的富集度要求，吸取上層清液或添加下槽母液，然后用0.1 mL的注射器直接一次吸取晶體溶液并安裝在微流體泵上。在操作過(guò)程中應(yīng)盡量保證樣品溶液中不存留小氣泡，以防阻隔子液的導(dǎo)電性和干擾射流的穩(wěn)定。同時(shí)將配制好的子液安裝在第二臺(tái)微流體泵上。

連接和密封好各接口后，采用機(jī)械真空泵進(jìn)行抽真空并達(dá)到穩(wěn)定真空度10Pa作為實(shí)驗(yàn)條件即可，也可進(jìn)一步使用分子泵，以達(dá)到效果更好的超低真空要求(10Pa)。然后將導(dǎo)通電壓設(shè)置為3000 V，同時(shí)開(kāi)啟子液泵0.2 μL?min，待子液開(kāi)始聚集時(shí)加大電壓以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的靜電紡絲，再開(kāi)啟樣品泵0.2μL?min。前期毛細(xì)管和連接部位內(nèi)的殘留空氣會(huì)持續(xù)產(chǎn)生氣泡，待氣泡消失穩(wěn)定后在BluIce操作界面中確定打擊位置，設(shè)置光斑大小和曝光時(shí)間，開(kāi)始持續(xù)收集衍射圖。如果衍射點(diǎn)未被觀測(cè)到，則調(diào)節(jié)流量和電壓來(lái)減少子液流速或增加母液流速來(lái)保證射流穩(wěn)定，以獲取衍射圖。

2.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在光斑50mm×50mm和曝光時(shí)間1 s的條件下，采用靜電紡絲方法連續(xù)收集多套衍射圖，并通過(guò)BL17U1線站上的SpotFinder和ADXV軟件對(duì)衍射圖的有效衍射點(diǎn)進(jìn)行初步篩選和識(shí)別，先用SpotFinder初步篩選了其中750張連續(xù)收集的衍射圖，衍射點(diǎn)強(qiáng)度下限(spot intensity cut)設(shè)置為40，其統(tǒng)計(jì)的衍射點(diǎn)總數(shù)統(tǒng)計(jì)分布如圖9所示?？倲?shù)在300以下的衍射圖中大部分被識(shí)別的衍射點(diǎn)為探測(cè)器等外在因素影響下產(chǎn)生的干擾點(diǎn)，在同一位置連續(xù)重復(fù)出現(xiàn)，視為無(wú)效；而對(duì)衍射點(diǎn)總數(shù)500以上的衍射圖的視為有效衍射，共有8張，故有效擊中率在1%左右。對(duì)其它多組數(shù)據(jù)進(jìn)行相同處理，結(jié)果保持一致。進(jìn)而用ADXV識(shí)別衍射點(diǎn)，其中參數(shù)Min I/Sigma值為5，Min Spot Spacing值為6，對(duì)篩出的原始衍射圖進(jìn)行衍射點(diǎn)識(shí)別，示例見(jiàn)圖10，單張衍射圖所識(shí)別的衍射點(diǎn)數(shù)量在20?30，其中存在一部分探測(cè)器噪點(diǎn)，空氣散射和探測(cè)器本底造成的背景像素點(diǎn)計(jì)數(shù)在50?70，整個(gè)衍射點(diǎn)的強(qiáng)度較弱，范圍較小，不能采用現(xiàn)有軟件進(jìn)行指標(biāo)化，需進(jìn)一步提高信噪比和軟件處理能力。

圖9 750張衍射圖的衍射點(diǎn)總數(shù)統(tǒng)計(jì)分布（靜電紡絲）

圖10 ADXV篩選的有效衍射點(diǎn)示例

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用了毛細(xì)管上樣方式對(duì)同一批晶體樣品進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。毛細(xì)管內(nèi)徑100 μm，在曝光時(shí)間1 s、光斑尺寸100 μm、光強(qiáng)不加衰減、流量0.5 μL?min的條件下連續(xù)采集衍射數(shù)據(jù)。采用相同的ADXV衍射點(diǎn)強(qiáng)度參數(shù)識(shí)別并統(tǒng)計(jì)了其中500張衍射圖中衍射點(diǎn)，其總數(shù)分布結(jié)果如圖11所示，其中17張為有效衍射圖，但存在同一衍射圖包含多顆晶體衍射點(diǎn)的情況，其原始衍射圖識(shí)別點(diǎn)示例見(jiàn)圖12，部分衍射圖可通過(guò)軟件進(jìn)行指標(biāo)化，可分辨出溶菌酶的P4空間群。與靜電紡絲相比，其背景強(qiáng)度更大，但識(shí)別的衍射點(diǎn)數(shù)量更多，主要由于其流速相對(duì)靜電紡絲慢了2?3個(gè)量級(jí)，較好匹配了現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)裝置的曝光時(shí)間和探測(cè)器采集的有效時(shí)間。

圖11 500張衍射圖的衍射點(diǎn)總數(shù)統(tǒng)計(jì)分布（毛細(xì)管）

圖12 毛細(xì)管上樣獲得的有效衍射圖示例

通常SFX實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的后處理需要應(yīng)用CrystFEL軟件對(duì)幾千張可用衍射圖進(jìn)行有效衍射點(diǎn)的篩選識(shí)別、合并和解析。由于我們實(shí)驗(yàn)采用的探測(cè)器有效采集時(shí)間為0.2 s，并存在0.95 s的讀出時(shí)間，因此相鄰照射間存在2 s的時(shí)間間隔，嚴(yán)重影響擊中效率并造成樣品的大量浪費(fèi)。假定按1%有效命中率，一套有效的數(shù)據(jù)至少需要100000張衍射圖，實(shí)驗(yàn)需持續(xù)55.6 h，樣品消耗量662.4 μL。此外，在毫秒級(jí)時(shí)間曝光下，衍射點(diǎn)強(qiáng)度降低，與背景之間的信噪比減小而不易分辨。與毛細(xì)管上樣方式的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較表明靜電紡絲在速度降低兩三個(gè)量級(jí)后，可能獲得更多更強(qiáng)的衍射點(diǎn)，但由于最低流量和射流半徑的限制，不易匹配現(xiàn)有探測(cè)器曝光時(shí)間；且更快的流速允許樣品在曝光時(shí)間內(nèi)旋轉(zhuǎn)的角度更小，理論上比旋轉(zhuǎn)法產(chǎn)生的衍射點(diǎn)更弱。

本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了靜電紡絲在同步輻射上進(jìn)行串行晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)的可行性，但由于現(xiàn)有條件的限制，擊中效率及衍射圖質(zhì)量都有待提高。未來(lái)探測(cè)器在性能上的提升（讀出速度降至毫秒級(jí)）及光斑尺寸的進(jìn)一步減小，將會(huì)提高擊中效率和有效衍射；通過(guò)增強(qiáng)光通量密度，采取真空腔以減小空氣散射減少背景，可提高信噪比，使得較弱的衍射點(diǎn)強(qiáng)度增大更易識(shí)別，有利于實(shí)現(xiàn)更短的曝光時(shí)間和更高的命中效率，從而匹配靜電紡絲射流較快的速度，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，減少樣品消耗量，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)在毫秒級(jí)及以下時(shí)間范圍的、基于同步輻射的串行晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)具有重要意義。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)探討了靜電紡絲上樣法的不同影響因素，尤其是溶液性質(zhì)、電壓與流量控制；并結(jié)合上海光源BL17U1線站平臺(tái)特點(diǎn)，以溶菌酶為測(cè)試樣品，利用同軸紡絲和加裝真空腔的方式克服了X射線空氣電離對(duì)其影響，驗(yàn)證了靜電紡絲應(yīng)用于同步輻射串行晶體學(xué)的可行性，為未來(lái)在上海光源上利用串行晶體學(xué)新方法開(kāi)展蛋白質(zhì)微晶體結(jié)構(gòu)研究積累了經(jīng)驗(yàn)，也為將來(lái)開(kāi)展基于自由電子激光裝置的串行晶體學(xué)研究提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

對(duì)比于同步輻射串行晶體學(xué)其它上樣方法，靜電紡絲除擁有串行晶體學(xué)的室溫采集和輻射損傷小的特點(diǎn)外，其較大的流量控制范圍0.1?3μL?min能滿足10 nm?10 μm較大范圍的微小晶體；真空環(huán)境避免了空氣電離的干擾，而采用同軸紡絲不僅克服真空和高壓對(duì)晶體的影響，且能保持樣品原生環(huán)境，擴(kuò)大了該方法對(duì)高要求樣品的適用范圍，并具有在子液中添加反應(yīng)劑來(lái)研究蛋白結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)的潛力；此外，與LCP和毛細(xì)管相比，該方法有更小的衍射背景，盡管流速較快，但隨著探測(cè)器的性能提升和光通量的增強(qiáng)，可以彌補(bǔ)對(duì)低流速的要求以提升命中效率和減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間。當(dāng)然，由于該方法影響因素較多，沒(méi)有固定參考標(biāo)準(zhǔn)和方案以適應(yīng)不同條件微小晶體要求，對(duì)真空環(huán)境下穩(wěn)定射流控制時(shí)間需進(jìn)一步提高，靜電紡絲上樣裝置仍然需要進(jìn)一步改良和完善。

面對(duì)未來(lái)同步輻射更高強(qiáng)度更小光斑的發(fā)展趨勢(shì)，以及探測(cè)器性能的突破，同步輻射串行晶體學(xué)將在結(jié)構(gòu)生物學(xué)上發(fā)揮更重要的作用。

致謝 感謝西北工業(yè)大學(xué)尹大川教授課題組對(duì)本實(shí)驗(yàn)的支持與幫助。

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Electrospinning sample delivery for serial crystallography using synchrotron radiation

CHEN JianqiaoWANG QishengLI BingZHOU HuanCUI YingSUN BoWANG ZhijunHE Jianhua

1(Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Zhangjiang Campus, Shanghai 201204, China) 2(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Background: As a novel approach to solve the protein structure, serial femtosecond crystallography (SFX) has been developed rapidly owing to the advantages of the room-temperature data collection, lower radiation damage and time-resolved study. The first X-ray free-electron laser (XFEL) based SFX experiment has offered a new method to structure determination of protein microcrystals successfully. Purpose: The aim is to introduce SFX into the widely-available third-generation synchrotron radiation (SR). Methods: The electrospinning sample delivery system is a potential method to be applied on SR. The theoretical and experimental researches on electrospinning were studied using BL17U1 beamline in Shanghai synchrotron radiation facility (SSRF). Results: A microjet containing microcrystals was produced from the liquid meniscus and controlled by an electrostatic field. The air ionization problem disturbing electrospinning in SR experiment was solved by providing vacuum condition and coaxial electrospinning technique. Using lysozyme microcrystals as a model sample, the feasibility of electrospinning was demonstrated. Conclusion: It is shown that the serial crystallography on millisecond time scale is suitable for SR, which provides a reference for the future beamline upgrading.

Serial crystallography, Synchrotron radiation, Electrospinning, Room-temperature data collection, Protein microcrystal

TL99

10.11889/j.0253-3219.2017.hjs.40.080102

中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)（B類）(No.XDB08030101)、中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)(No.2015213)、國(guó)家自然科學(xué)基金(No.U1632126)資助

陳建樵，男，1992年出生，2014年畢業(yè)于四川大學(xué)，現(xiàn)為碩士研究生，從事同步輻射晶體學(xué)相關(guān)研究

何建華，E-mail: hejianhua@sinap.ac.cn

2017-04-11，

2017-04-28

Strategic Priority Research Programmes (B) of Chinese Academy of Sciences (No.XDB08030101), Youth Innovation Promotion Association of Chinese Academy of Sciences (No.2015213), National Natural Science Foundation of China (No.U1632126)

CHEN Jianqiao, male, born in 1992, graduated from Sichuan University in 2014, master student, focusing on synchrotron crystallography

HE Jianhua, E-mail: hejianhua@sinap.ac.cn

2017-04-11, accepted date: 2017-04-28