基于線粒體D—loop序列的泰山赤鱗魚(yú)多態(tài)性分析

閆莉莉++于杰++趙富麗++洪敏++程妍++孟超

摘 要：通過(guò)對(duì)24條泰山赤鱗魚(yú)DNA提取、PCR技術(shù)對(duì)線粒體D-loop序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化并進(jìn)行序列測(cè)定后，得到的核苷酸片段約900 bp。運(yùn)用MEGA5.10軟件計(jì)算其成對(duì)序列遺傳距離，并根據(jù)D-loop序列建立了鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）系統(tǒng)樹(shù)。通過(guò)DNASP軟件計(jì)算出這24個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性參數(shù)其多態(tài)性參數(shù)為：多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（S）為71，單倍型個(gè)數(shù)（H）為19，單倍型多樣性（h）為0.96，核苷酸多樣性（π）為0.011 12，平均核苷酸差異數(shù)（k）為8.739。研究發(fā)現(xiàn)泰山赤鱗魚(yú)具有較高的單倍型多樣性，但其核苷酸多樣性較低。所構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，24個(gè)個(gè)體均形成兩大分支，由于線粒體DNA屬于母系遺傳，由此可推斷該群體的24個(gè)個(gè)體可能來(lái)源于兩個(gè)不同的母系祖先。

關(guān)鍵詞：赤鱗魚(yú) 線粒體DNA D-loop 系統(tǒng)樹(shù)

中圖分類號(hào)：S86 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-098X（2017）06（b）-0245-02

泰山赤鱗魚(yú)又名螭霖魚(yú)，屬鯉科，突吻魚(yú)屬，是泰山的著名特產(chǎn)。2013年被列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[1]。它分布的海拔一般是270～800 m，對(duì)高、低溫也不適應(yīng)，對(duì)水質(zhì)的要求高。它生長(zhǎng)緩慢，游速快，而且不容易人工養(yǎng)殖。具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊的藥用價(jià)值，含有12種以上礦物質(zhì)、18種以上的脂肪酸，其中抗衰老的多種不飽和脂肪酸含量尤其豐富[2]，可減輕動(dòng)脈粥樣硬化、貧血等。

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，由于泰安降雨量的減少、旅游資源開(kāi)發(fā)、人工過(guò)度捕撈等眾多因素的影響，赤鱗魚(yú)野生資源急劇減少，瀕臨滅絕。為研究保護(hù)其種群的正常生長(zhǎng)、繁殖，該研究采集了來(lái)自泰山不同地方的赤鱗魚(yú)樣品，分析了其種群多態(tài)性，為該魚(yú)種群的保護(hù)管理提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

（1）選取泰山不同地區(qū)24條大小體重相近的泰山赤鱗魚(yú)。

（2）分別將≤30mg切碎的腎臟組織放置已經(jīng)滅菌的1.5 mL離心管中，利用試劑盒方法提取DNA。

（3）用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。

（4）設(shè)計(jì)引物，引物為DL-F：5`-ACCCCTGGCTCCC AAAGC-3，DL-R：5`-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3`[3]。

（5）PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增體系：DNA 1.0 uL、上游引物1.0 uL、下游引物1.0 uL、dNTP Mixture 2.0 uL、10×Buffer 2.5 uL、Taq DNA聚合酶0.6 uL、去離子水16.9 uL、合計(jì)25 uL。擴(kuò)增程序：94°C 5 min、94°C 30sec、54°C 1 min、72°C 2 min 72°C 10 min，30 cycle。

（6）PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序。

2 結(jié)果分析

該實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了24條赤鱗魚(yú)的線粒體DNA控制區(qū)即D-loop（Displacement loop）基因片段，其堿基序列為900bp左右。A、T、C、G四種堿基在24個(gè)個(gè)體的平均含量分別為A32.45%，T33.3%，C21.8%，G13.45%。AT含量高于CG含量，可見(jiàn)，赤鱗魚(yú)mtDNA中堿基T含量最高，堿基G含量最低，與脊椎動(dòng)物mtDNA堿基組成一致。

以24個(gè)個(gè)體D-loop序列構(gòu)建的NJ[4]系統(tǒng)樹(shù)分別如圖1所示。

應(yīng)用MEGA5.10軟件[5]，根據(jù)線粒體D-loop序列算出24個(gè)個(gè)體間的遺傳距離，個(gè)體間的平均遺傳距離為0.011 4。通過(guò)DNASP軟件[6]計(jì)算出這24個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性參數(shù)為：多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（S）為71，單倍型個(gè)數(shù)（H）為19，單倍型多樣性（h）為0.96，核苷酸多樣性（π）為0.011 12，平均核苷酸差異數(shù)（k）為8.739。由此可以看出，該群體具有較高的單倍型多樣性，但核苷酸多樣性較低。

3 討論

通常序列分析（測(cè)序）是最為有效的揭示遺傳結(jié)構(gòu)的方法[7]。線粒體DNA具有分子小而穩(wěn)定、母系遺傳、進(jìn)化速率快特點(diǎn)，成為群體遺傳學(xué)的理想分子標(biāo)記[8]。研究表明，泰山赤鱗魚(yú)具有極高的單倍型多樣性（0.96）。但其核苷酸多樣性（0.011 12）較低。該研究中樣本的D-loop序列所構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹(shù)表明，兩種方法所得到的系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，24個(gè)個(gè)體均形成兩大分支，由于線粒體DNA屬于母系遺傳，由此可推斷該群體的24個(gè)個(gè)體可能來(lái)源于兩個(gè)不同的母系祖先。

該研究對(duì)泰山赤鱗魚(yú)的遺傳多樣性研究的結(jié)果表明，其線粒體D-loop區(qū)存在較豐富的多樣性。

參考文獻(xiàn)

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