小鼠肺爆震傷后不同時間點超氧化物歧化酶-1、丙二醛-5及肌醇酶-α表達變化研究

張玉彪， 柳云恩， 佟昌慈， 叢培芳， 劉 穎， 史秀云， 施 琳， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

·爆震傷·

小鼠肺爆震傷后不同時間點超氧化物歧化酶-1、丙二醛-5及肌醇酶-α表達變化研究

張玉彪， 柳云恩， 佟昌慈， 叢培芳， 劉 穎， 史秀云， 施 琳， 金紅旭， 侯明曉

沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學部 全軍重癥(戰(zhàn))創(chuàng)傷救治中心實驗室 遼寧省重癥創(chuàng)傷和器官保護重點實驗室，遼寧 沈陽 110016

目的 探討小鼠肺爆震傷后不同時間點超氧化物歧化酶(SOD)-1、丙二醛(MDA)-5及肌醇酶(IRE)-α表達的變化。方法 將64只小鼠分為空白對照組(8只)與爆震傷實驗組(56只)。爆震傷模型建立后，分別于3、6、12、24、48 h與1、2周7個時間點解剖8只小鼠。觀察每個時間點小鼠的呼吸與被毛狀態(tài)等，應用RT-PCR與Western-blot檢測小鼠肺組織SOD-1、MDA-5及IRE-α在基因與蛋白水平上的表達量。結果 爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達在3 h后開始上升，12 h時達到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達在3 h后開始上升，24 h時達到最高，48 h后下降，2周時恢復正常。結論 小鼠肺組織在發(fā)生爆震傷3 h后開始出現氧化應激反應，12～48 h時氧化應激反應達到高峰，隨后下降，到2周時基本恢復正常。

爆震傷； 小鼠； 肺； 氧化應激； 超氧化物歧化酶； 丙二醛； 肌醇酶

炸藥、煤氣罐、化學藥品及水下爆炸等可瞬間產生并釋放巨大的能量，產生一種超聲速的沖擊波，直接對機體造成損傷，這種損傷即爆震傷。沖擊波產生后可形成負壓，對肺產生一定的損傷，導致肺組織水腫與肺泡破裂，甚至血氣胸，造成死亡[1-3]。本研究通過建立小鼠肺爆震傷模型，觀察肺爆震傷后不同時間點反映氧化應激的指標分子與蛋白，探討肺爆震傷后氧化應激反應的變化，為爆震傷初期的救治提供相關依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57小鼠64只，6～8周齡，雄性，體質量為23～25 g，由北京維通利華公司提供。反轉錄試劑盒購于日本TAKARA公司，熒光定量試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，蛋白提取試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司，ECL顯色試劑盒購于美國BIO-RAD公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)-1抗體、丙二醛(malondialdehyde，MDA)-5抗體及肌醇酶(inositol requiring enzyme，IRE)-α抗體購于美國Abcam公司，二抗抗體購于美國Abcam公司。

1.2 研究方法

將小鼠置于正常飼養(yǎng)房間進行飼養(yǎng)，正常飲食水，環(huán)境12 h晝夜交替，適應1周。將64只小鼠分為空白對照組(8只)與爆震傷實驗組(56只)。空白對照組小鼠正常飼養(yǎng)；爆震傷實驗組小鼠經0.55 MPa沖擊波沖擊，建立肺爆震傷模型后，分別于3、6、12、24、48 h及1、2周共7個時間點解剖8只小鼠。分別留取4只肺病理標本與4只肺凍存標本，將病理標本置于4%多聚甲醛固定后進行熒光染色，凍存標本置于-80℃冰箱待測基因與蛋白表達。1.2.1 生理學觀察 觀察兩組小鼠被毛、飲食水、精神狀態(tài)、體質量及呼吸的變化。

1.2.2 熒光染色法 將肺組織固定24 h后取材，然后脫水包埋切片與熒光染色。熒光染色按照試劑盒說明書進行。熒光顯微鏡下觀察染色情況并拍片。

1.2.3 RT-PCR法 取肺組織標本，研缽內研磨，按照Trizol提取RNA步驟操作，對所提取的RNA進行定量，然后反轉錄為cDNA，SYBR Green實時熒光定量PCR，以GAPDH為內參，對GAPDH、SOD-1、MDA-5及IRE-α進行擴增并分析，計算小鼠基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western-blot法 勻漿機將肺組織制成勻漿，加入蛋白裂解液，以12 000 r/min速度離心5 min，吸取上清液，酶標儀制作標準曲線。然后蛋白質定量，垂直電泳，膠體內的藍色條帶至分離膠底部時，完成電泳。濕轉法轉印，加入GAPDH、SOD-1、MDA-5及IRE-α一抗，置于4℃過夜，加入二抗室溫孵育，顯影定影并拍照。以GAPDH為內參，進行灰度值分析，計算蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 生理學變化 空白對照組小鼠的飲食水等情況正常，體質量增長正常。爆震傷實驗組小鼠爆震傷模型建立后呼吸急促，毛發(fā)無光澤，飲食水少于空白對照組，體質量增長慢于空白對照組，個別小鼠不增長；48 h后，爆震傷實驗組小鼠呼吸等指標接近空白對照組；2周后，爆震傷實驗組小鼠呼吸、毛發(fā)與空白對照組基本無差異。

2.2 熒光染色結果 爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達在3 h后開始上升，12 h時達到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達在3 h后開始上升，24 h時達到最高，48 h后下降，2周時恢復正常。見圖1。

2.3 RT-PCR結果 爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達在3 h后開始上升，12 h時達到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達在3 h后開始上升，24 h時達到最高，48 h后下降，2周時恢復正常。與空白對照組小鼠比較，差異有統計學差異(P<0.05)。見圖2。

圖2 SOD-1、MDA-5及IRE-α基因相對表達量(與空白對照組比較，①P<0.05)

2.4 Western-blot結果 爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達在3 h后開始上升，12 h時達到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達在3 h后開始上升，24 h時達到最高，48 h后下降，2周時恢復正常。與空白對照組小鼠比較，差異有統計學差異(P<0.05)。見圖3。

圖3 SOD-1、MDA-5及IRE-α蛋白相對表達量(與空白對照組比較，①P<0.05)

3 討論

當爆炸波沖擊機體時，部分震動被反射與衍射，部分被傳播。反射壓力高于入射壓力，機體經受的機械負荷取決于反射壓力，而不是入射壓力[4-5]。爆炸沖擊波可導致肺損傷，使肺上皮細胞通透性發(fā)生改變，出現血氣胸或肺水腫等[6-10]。SOD-1能夠清除機體新陳代謝過程中所產生的一些有害物質與自由基，在機體受到損傷時，SOD-1會自動調節(jié)以維護機體健康[11-13]。MDA為丙二醛膜脂過氧化的重要產物之一，而MDA-5是細胞膜內識別受體，自由基的產生與MDA有著很大的關系[14]。IRE-α作為細胞內質網上的感受蛋白，在發(fā)生氧化應激反應后，其可通過相關的蛋白促進細胞發(fā)生氧化應激而凋亡[12，15]。

本實驗通過建立C57小鼠肺爆震傷模型，觀察爆震傷后3、6、12、24、48 h與1、2周這7個時間點對小鼠生理學的影響及對肺氧化應激反應相關基因與蛋白的表達變化。小鼠爆震傷后，48 h內體質量相對降低，飲食水少于空白對照組，呼吸急促；不同時間點的熒光染色結果顯示，爆震傷后，小鼠肺組織發(fā)生氧化應激反應，24～48 h時氧化應激反應達到高峰，隨后下降，到2周時基本恢復正常，說明機體對外界的損傷具有一定的自我調節(jié)能力，可發(fā)揮保護作用；基因與蛋白檢測的結果顯示，爆震傷后，小鼠肺組織SOD-1表達在3 h后開始降低，1周后上升；MDA-5表達在3 h后開始上升，12 h時達到最高，24 h后下降，1周后再次上升；IRE-α表達在3 h后開始上升，24 h時達到最高，48 h后下降，2周時恢復正常，與熒光染色結果一致。

綜上所述，小鼠肺組織在發(fā)生爆震傷3 h后開始出現氧化應激反應，12～48 h時氧化應激反應達到高峰，隨后下降，到2周時基本恢復正常。因此，在爆震傷后，積極進行抗氧化應激等治療，減少機體的氧化應激反應，對臨床具有一定的指導意義。

[1] Kirkman E,Watts S,Cooper G.Blast injury research models[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2011,366(1562):144-159.

[2] Arul R,Adam MH,Spyros M,et al.Blast-related fracture patterns:a forensic biomechanical approach[J].J R Soc Interface,2011,8(58):689-698.

[3] Axel F,Dan B,Benedikt F,et al.The first aid and hospital treatment of gunshot and blast injuries[J].Dtsch Arztebl Int,2017,114(14):237-243.

[4] Archambeau BA,Young S,Lee C,et al.E-cigarette blast injury:complex facial fractures and pneumocephalus[J].West J Emerg Med,2016,17(6):805-807.

[5] Simone F,Raphael S,Rosa D,et al.Pre- and posttreatment with hydrogen sulfide prevents ventilator-induced lung injury by limiting inflammation and oxidation[J].PLoS One,2017,12(4):e0176649.

[6] 柳云恩.爆震沖擊波對大鼠腦組織炎癥因子IL-1β、IL-6及IL-10表達影響[J].創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學,2016,6(4):336-340.

[7] Asakura T,Ogura K,Goshima Y.IRE-1/XBP-1 pathway of the unfolded protein response is required for properly localizing neuronal UNC-6/Netrin for axon guidance in C.elegans[J].Genes Cells,2015,20(3):153-159.

[8] Evan C,Fu D,Robert HG,et al.Diffusion tensor imaging reveals white matter injury in a rat model of repetitive blast-induced traumatic brain injury[J].J Neurotrauma,2014,31(10):938-950.

[9] Yashodhar PB,Shwetha KS,Amarnath SM,et al.Regulation of lung injury and fibrosis by p53-mediated changes in urokinase and plasminogen activator inhibitor-1[J].Am J Pathol,2013,183(1):131-143.

[10] Valeriy P,Fanyong M,Angelo M,et al.Alterations of lung microbiota in a mouse model of LPS-induced lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2015,309(1):L76-L83.

[11] Zhao SJ,Ka C,Ma D.Perioperative “remote” acute lung injury:recent update[J].J Biomed Res,2017,31(3):197-212.

[12] Anna AB,Fanyong M,Tian Y,et al.Prostacyclin post-treatment improves LPS-induced acute lung injury and endothelial barrier recovery via Rap1[J].Biochim Biophys Acta,2015,1852(5):778-791.

[13] Edward SM,Nathaniel K,Nadiezhda CM,et al.Nitric oxide inhibits neointimal hyperplasia following vascular injury via differential,cell-specific modulation of SOD-1 in the arterial wall[J].Nitric Oxide,2015,44:8-17.

[14] Effi W,May KW,Natalya PM,et al.Dephosphorylation of the RNA sensors RIG-I and MDA5 by the phosphatase PP1 is essential for innate immune signaling[J].Immunity,2013,38(3):437-449.

[15] Li Y,Yong LC,Ming S,et al.A single-institution experience with open irreversible electroporation for locally advanced pancreatic carcinoma[J].Chin Med J (Engl),2016,129(24):2920-2925.

Changes of SOD-1,MDA-5 and IRE-α expression in the lungs of rats at different time points after blast injury

ZHANG Yu-biao,LIU Yun-en,TONG Chang-ci,CONG Pei-fang,LIU Ying,SHI Xiu-yun,SHI Lin,JIN Hong-xu,HOU Ming-xiao

(Emergency Medicine Department of General Hospital of Shenyang Military Command, Laboratory of Rescue Center of Severe Wound and Trauma PLA, Severe Trauma and Organ Protection key Laboratory of Liaoning Province，Shenyang 110016, China)

Objective To investigate the changes of superoxide dismutase(SOD)-1,malonaldehyde(MDA)-5 and inositol enzyme(IRE)-α expression in rats at different time points after injury.Methods A total of 64 cases of rats were divided into the blank control group(n=8) and exploratory shock group(n=56).The model was established at 3 hours,6 hours,12 hours,24 hours,48 hours,1 week and 2 weeks on 8 rats.The respiratory and hair status of rats at each time point were observed.The expression of SOD-1,MDA-5 and IRE-α in lung tissue were detected by RT-PCR and Western-blot.Results The expression of SOD-1 began to reduce after 3 hours of blast injury,and increased after 1 week.The expression of MDA-5 increased after 3 hours,reached the peak after 12 hours and reduced after 24 hours,then once again increased after 1 week.The expression of IRE-α increased after 3 hours,reached the peak after 24 hours,reduced after 48 hours and returned to normal after 2 weeks.Conclusion Oxidative stress begins to occur after 3 hours of lung injury,and reaches the peak at 12～48 h,then reduces and returns to normal at 2 weeks.

Blast injury; Rats; Lung; Oxidative stress; Superoxide dismutase; Malonaldehyde; Alcoholase

全軍十二五面上項目(CSY12J002)；全軍重大新藥創(chuàng)制項目(2013ZX09J13109-02B)；全軍十二五面上項目(CSY13J002)； 總后衛(wèi)生部重大新上(ASM14L008)

張玉彪(1987-)，男，黑龍江齊齊哈爾人，技師，博士

侯明曉，E-mail：houmingxiao188@163.com

2095-5561(2017)04-0193-05 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.04.01

2017-08-05