玉米InDel標(biāo)記20重PCR檢測體系的建立

馮 博許理文王鳳格薛寧寧劉文彬,2易紅梅

田紅麗1呂遠(yuǎn)大3趙 涵3金石橋4張力科4蔚榮海2趙久然1

1北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心 /玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100097;2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林長春130118;3江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所,江蘇南京210014;4全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,北京100125

玉米InDel標(biāo)記20重PCR檢測體系的建立

馮 博1,2,**許理文1,**王鳳格1,*薛寧寧1劉文彬1,2易紅梅1

田紅麗1呂遠(yuǎn)大3趙 涵3金石橋4張力科4蔚榮海2趙久然1

1北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心 /玉米DNA指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100097;2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林長春130118;3江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所,江蘇南京210014;4全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心,北京100125

為構(gòu)建玉米多重PCR檢測體系,提高分子標(biāo)記檢測效率,利用10份代表性玉米材料對(duì)238對(duì)InDel引物進(jìn)行單重PCR評(píng)估,共得到192對(duì)擴(kuò)增效率高、穩(wěn)定性好的引物。根據(jù)軟件評(píng)估結(jié)果、擴(kuò)增質(zhì)量、產(chǎn)物范圍、染色體均勻分布原則從192對(duì)引物中優(yōu)選出30對(duì)綜合表現(xiàn)較好的引物形成擴(kuò)增產(chǎn)物范圍在80~200 bp和200~400 bp的兩組核心引物組合,每套組合中有10對(duì)引物分布在不同染色體上。在核心引物組合的基礎(chǔ)上綜合考慮染色體分布、堿基片段范圍、引物熒光顏色,逐一添加引物,最終形成兩組玉米20重PCR體系,一組40重?zé)晒鈽?biāo)記毛細(xì)管電泳。

玉米;InDel;多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上改進(jìn)的,在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物,對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段的技術(shù),這個(gè)概念由Chambercian等和Mullis等[1-2]率先提出。多重PCR技術(shù)可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因,具有節(jié)省珍貴的試驗(yàn)樣品、節(jié)省時(shí)間提高效率、降低成本的優(yōu)點(diǎn),所以自從多重PCR技術(shù)報(bào)道以來,受到眾多研究者的重視,并且迅速發(fā)展至多個(gè)研究領(lǐng)域,多重PCR技術(shù)己經(jīng)成為生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域一種重要的檢測手段[3]。

目前,在動(dòng)物和人類上得到了較廣泛深入的研究及應(yīng)用。以前的多重體系較多基于SSR引物,人類STR[4](short tandem repeat)中已經(jīng)地成功組建了26重PCR體系[5],玉米中成功組建了10重PCR體系[6]。隨著InDel[7-8]新型標(biāo)記的開發(fā),人們首先在動(dòng)物及人類上構(gòu)建多重PCR復(fù)合擴(kuò)增體系[9-10],已在人類上成功組建3組16重PCR,48重?zé)晒饷?xì)管電泳[11]。在玉米等植物上的研究較少,主要原因是在玉米上開發(fā)的InDel標(biāo)記較少,本實(shí)驗(yàn)室基于玉米核心種質(zhì)自交系的重測序數(shù)據(jù),全面挖掘玉米基因組上的InDel位點(diǎn),并評(píng)估其多態(tài)性,分析位點(diǎn)兩側(cè)序列的保守性,獲得一批InDel引物(未發(fā)表)。本試驗(yàn)準(zhǔn)備借鑒多重PCR在動(dòng)物及人類上的研究成果探索以InDel標(biāo)記構(gòu)建玉米多重PCR體系的方案。該體系的建立具有現(xiàn)實(shí)意義,既可為大規(guī)模、高通量玉米指紋庫構(gòu)建創(chuàng)造有利條件又可提高玉米遺傳研究和標(biāo)記輔助育種的效率[12-13]。

1 材料與方法

1.1 材料

共10份(表1),涵蓋普通玉米、甜玉米、糯玉米,具廣泛代表性。其中包括2份玉米自交系和8份常用玉米雜交種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 采用王鳳格等的改良CTAB法[14]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 單重PCR反應(yīng)體系:200μmol L–1DNA模板2μL、2×Taq Plus Master Mix 10μL、0.25μmol L–1引物2μL,總體積20μL。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s,60℃退火35 s, 72℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。在多重PCR體系中將單重PCR體系引物濃度調(diào)整為0.5μmol L–1,引物用量為0.2μL,在體系優(yōu)化過程中調(diào)整部分引物濃度,其余與單重PCR相同。

表1 供試材料Table 1 Test materials in this study

1.2.3 熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳 對(duì)于單重PCR,在96孔板的各孔中分別加入9μL去離子甲酰胺、0.2 μL GS3730-500分子量內(nèi)標(biāo)和2μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物。95℃變性5 min,于4℃保存10 min,2000 r min–1離心1 min,于ABI3730XL DNA分析儀上進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳。對(duì)于多重PCR,采用產(chǎn)物原液,其余與單重PCR電泳一致。

1.2.4 數(shù)據(jù)收集與分析 采用Date Collection軟件收集原始數(shù)據(jù),用本單位自主研發(fā)的SSR Analyser(V1.2.4)指紋分析器統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)。

1.2.5 InDel引物開發(fā)設(shè)計(jì)與評(píng)估 引物位點(diǎn)開發(fā)階段的篩選條件為InDel長度在3~10 bp、兩側(cè)序列保守性高、染色體上均勻分布。引物設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)是利用Primer3設(shè)計(jì)引物,為有效構(gòu)建多重PCR,所有引物設(shè)計(jì)時(shí)采用統(tǒng)一設(shè)置參數(shù),主要參數(shù)包括Tm值(60±2℃)、擴(kuò)增產(chǎn)物片段范圍(80~400 bp)、GC含量(40%~60%)。引物擴(kuò)增質(zhì)量篩選原則是熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳圖譜中峰值高于1000、無非特異峰、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好。

1.2.6 InDel引物多重組合 多重PCR核心引物組的篩選:在192對(duì)候選引物中,將擴(kuò)增產(chǎn)物片段分為80~200 bp和200~400 bp兩組,每組引物按染色體均勻分布、片段范圍平均差異20 bp左右選擇一對(duì)引物,挑選出10對(duì)引物,形成核心引物組合。擴(kuò)增產(chǎn)物片段范圍在80~200 bp的引物按四色(ABI合成)或二色熒光(國內(nèi)合成)分別挑選出一套核心引物組合。對(duì)核心引物組合及候選引物進(jìn)行軟件評(píng)估,并對(duì)所評(píng)估的引物按與核心引物組合相互作用的大小排序。試驗(yàn)評(píng)估在核心引物組合的基礎(chǔ)上進(jìn)行逐一添加引物,優(yōu)先選擇引物之間干擾弱的引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選與確定

根據(jù)引物擴(kuò)增質(zhì)量篩選原則,對(duì)于單重PCR擴(kuò)增,從238對(duì)熒光引物中篩選出192對(duì),其在染色體上的分布情況(表2),大多數(shù)引物在染色體上均勻分布,平均相差20 bp有1對(duì)引物。第1染色體上引物分布最多,共30對(duì);第4和第7染色體上分布最少,共13對(duì)。擴(kuò)增產(chǎn)物片段范圍在80~300 bp的引物分布均勻,350 bp以上的分布較少。表2左側(cè)數(shù)列為擴(kuò)增產(chǎn)物片段范圍,引物的熒光顏色可根據(jù)需要及組合方式自行標(biāo)記?？捎杀?信息根據(jù)染色體分布和擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小自由組建多重引物組合。

表2 192對(duì)候選引物名單Table 2 List of 192 candidate primers

(續(xù)表2)

(續(xù)表2)

2.2 10重核心引物組合

10重核心引物組合經(jīng)軟件評(píng)估引物間無干擾。10重PCR電泳結(jié)果表明10對(duì)引物可以同時(shí)成功擴(kuò)增(圖1)。10份材料驗(yàn)證多重組合穩(wěn)定性較高,又在實(shí)驗(yàn)室選取200份材料對(duì)多重組合進(jìn)行驗(yàn)證,均取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。10重PCR的擴(kuò)增片段大小與單重PCR擴(kuò)增出的片段大小一致、沒有非特異峰、同色熒光引物擴(kuò)增片段無交叉;雖然10對(duì)引物的擴(kuò)增效率差異較大,但隨后擴(kuò)增體系優(yōu)化的過程中各引物濃度有所調(diào)整。10重核心引物組合名單詳見表3。

2.3 20重引物組合的確定

2.3.1 80~200 bp四色熒光引物組合 在10重核心引物組合的基礎(chǔ)上添加至20重引物組合,20對(duì)引物均成功擴(kuò)增。用10份材料驗(yàn)證多重組合穩(wěn)定性較高,又在實(shí)驗(yàn)室選取200份材料對(duì)多重組合進(jìn)行驗(yàn)證,均取得較好的試驗(yàn)結(jié)果。在染色體上分布均勻、多重PCR的擴(kuò)增片段大小與單重PCR擴(kuò)增出的片段大小一致、引物擴(kuò)增片段無交叉、擴(kuò)增效率較高、擴(kuò)增效果較穩(wěn)定。由于引物擴(kuò)增片段大小以及引物自身擴(kuò)增效率的原因采用相同引物濃度無法實(shí)現(xiàn)等效擴(kuò)增,根據(jù)引物擴(kuò)增效率對(duì)擴(kuò)增體系進(jìn)行優(yōu)化,即對(duì)各引物擴(kuò)增濃度進(jìn)行調(diào)整,調(diào)整濃度后各引物擴(kuò)增效率與調(diào)整前有明顯改善(圖2)。

2.3.2 二色熒光組合 借鑒組建80~200 bp 20重引物組合的經(jīng)驗(yàn),利用FAM和ROX二色熒光組建了擴(kuò)增片段范圍在80~200 bp、200~400 bp的20重PCR組合,所有引物均成功擴(kuò)增(圖3)。

圖1 鄭單958的10重核心引物擴(kuò)增結(jié)果圖

圖2 鄭單958的80~200 bp 20重引物PCR效果圖

圖3 鄭單958的80~200 bp及200~400 bp 20重引物PCR效果圖

2.4 40重電泳

將采用FAM和ROX二色熒光標(biāo)記的80~200 bp、200~400 bp的2個(gè)20重PCR組合電泳,獲得了二色熒光標(biāo)記40重電泳組合(圖4)。10份材料驗(yàn)證多重組合穩(wěn)定性較高。又在實(shí)驗(yàn)室選取200份材料對(duì)多重組合進(jìn)行驗(yàn)證,均取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。ABI3730XL DNA分析儀為五色熒光毛細(xì)管電泳儀,一色為內(nèi)標(biāo),四色可以標(biāo)記引物,因此理論上可以做到80重?zé)晒鈽?biāo)記毛細(xì)管電泳組合,將極大地提高InDel基因型分型的效率。40對(duì)引物基本信息見表4。

3 討論

InDel遍布于真核生物整個(gè)基因組的頻率僅次于SNP,位居第二,在玉米基因組也是如此,平均126 bp,大約是SNP(60.8)的2倍。InDel在玉米基因組上分布不均,在非編碼區(qū)平均85 bp一個(gè),在編

碼區(qū)平均每2500 bp一個(gè)[15-16]。InDel引物在組建多重PCR時(shí)自身二態(tài)性標(biāo)記的特點(diǎn)有明顯優(yōu)勢,每個(gè)引物只有2個(gè)等位基因、不會(huì)出現(xiàn)新的等位基因、目標(biāo)產(chǎn)物片段大小確定,所以在組建多重PCR時(shí)能夠避免引物片段大小有交叉、能夠保證引物充分?jǐn)U增易于實(shí)現(xiàn)多重PCR以及多重電泳。所用InDel引物設(shè)計(jì)時(shí)均采用相同的退火溫度,多個(gè)引物可采用同一程序同時(shí)擴(kuò)增。InDel引物通用性強(qiáng)、穩(wěn)定性高,應(yīng)用目前SSR引物的擴(kuò)增程序即可成功擴(kuò)增,不涉及到擴(kuò)增程序上的優(yōu)化,為組建多重PCR提供了更大的可能性。InDel引物沒有連續(xù)多峰和三峰的現(xiàn)象,便于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析;兼容熒光毛細(xì)管電泳平臺(tái)、芯片平臺(tái)、KASP平臺(tái),易于數(shù)據(jù)的整合。

表3 20對(duì)引物基本信息Table 3 Basic information of 20 primers

圖4 40重?zé)晒鈽?biāo)記毛細(xì)管電泳效果圖

表4 40對(duì)引物基本信息(按圖中引物出現(xiàn)的先后順序,先藍(lán)色后紅色)Table 4 Basic information of 40 primers(the sequence ranking of primers from blue to red)

(續(xù)表4)

(續(xù)表4)

利用InDel標(biāo)記將候選引物按擴(kuò)增產(chǎn)物片段范圍、染色體分布進(jìn)行分類,構(gòu)建10對(duì)核心引物組合后逐一添加引物的方案使本試驗(yàn)最終成功地組建了兩組20重PCR,一組40重?zé)晒鈽?biāo)記毛細(xì)管電泳。本試驗(yàn)成功組建20重PCR的試驗(yàn)方法、試驗(yàn)程序以及試驗(yàn)流程,為今后多重PCR體系的構(gòu)建提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)。后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步研究的空間還很大,可以繼續(xù)組建20重以上的多重復(fù)合體系,理論上可以實(shí)現(xiàn)80重?zé)晒鈽?biāo)記毛細(xì)管電泳,在標(biāo)記上具有較高的通量。理論上的80重?zé)晒饷?xì)管電泳,在一個(gè)孔中即可實(shí)現(xiàn)對(duì)80個(gè)位點(diǎn)的基因型分型分析,一塊96孔板就可以實(shí)現(xiàn)7680個(gè)位點(diǎn)的基因型分型分析、一塊384板則可實(shí)現(xiàn)30 720個(gè)位點(diǎn)的基因型分型分析。20個(gè)引物同時(shí)擴(kuò)增提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確性;減少了繁瑣的試驗(yàn)操作、節(jié)省了試驗(yàn)樣本、試驗(yàn)耗材、試驗(yàn)時(shí)間,工作效率提高了20倍。本研究獲得的20重PCR組合以及40重?zé)晒鈽?biāo)記毛細(xì)管電泳將在較大范圍內(nèi)具有應(yīng)用價(jià)值,今后可以應(yīng)用到更多有關(guān)玉米品種真實(shí)性和純度鑒定中,同時(shí)也可以為分子植物育種[17]提供技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

利用10份玉米材料結(jié)合InDel標(biāo)記,成功組建了兩組20重PCR體系、一組40重?zé)晒饷?xì)管電泳,以及一套組建PCR復(fù)合體系的試驗(yàn)方案,為今后利用InDel及其他分子標(biāo)記組建多重PCR復(fù)合體系,分子標(biāo)記輔助育種的背景選擇以及將多重PCR復(fù)合體系應(yīng)用于玉米品種鑒定提供了重要的思路和研究方法。

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Establishment of Multiplex PCR System with 20 Pairs of InDel Markers in Maize

FENG Bo1,2,**,XU Li-Wen1,**,WANG Feng-Ge1,*,XUE Ning-Ning1,LIU Wen-Bin1,2,YI Hong-Mei1,TIAN Hong-Li1,LYU Yuan-Da3,ZHAO Han3,JIN Shi-Qiao4,ZHANG Li-Ke4,YU Rong-Hai2,and ZHAO Jiu-Ran1

1Maize Research Center,Beijing Academy of Agriculture&Forestry Sciences/Beijing Key Laboratory of Maize DNA Fingerprinting and Molecular Breeding,Beijing 100097,China;2Faculty of Agronomy,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;3Provincial Key Laboratory of Agrobiology,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Nanjing 210014,China;4National Agricultural Technical Extension and Service Center, Beijing 100125,China

In order to improve the detection efficiency with molecular marker,the multiple PCR detection system was constructed.

In this study,10 major materials were used to evaluate the single pair PCR with 238 pairs of InDel primers.According to the

software quality evaluation results,product range,and the principle of chromosome uniform distribution,30 pairs of primers were

selected from 192 primers with better performance to form two groups of core primer combinations with amplified products in the

range of 80-200 bp and 200-400 bp,There were 10 pairs of primers distributing in different chromosomes for each primer

combination.Based on core primer combination and comprehensive consideration on chromosome distribution,base fragment,

and primers fluorescent color,we established two groups of corn test 20 PCR system and a group of 40 fluorescent capillary

electrophoresis.

Maize;InDel;Multiplex PCR

(

):2016-12-11;Accepted(接受日期):2017-04-20;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2017-04-27.

10.3724/SP.J.1006.2017.01139

本研究由國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BAD02B02)和北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項(xiàng)(KJCX20161501)資助。

This study was supported by the National Science and Technology Project from the Ministry of Science and Technology of China (2015BAD02B02),and the Science and Technology Innovation Special Project of Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences (KJCX20161501).

*通訊作者(Corresponding author):王鳳格,E-mail:gege0106@163.com**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

聯(lián)系方式:馮博,E-mail:fengbo02220108@163.com;許理文,E-mail:xulw0408@126.com

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170427.0948.002.html