玉米SNAC基因的遺傳變異及耐旱性調(diào)控

李國君馬藝文徐丹陽吳永波宋 潔王 楠郝轉(zhuǎn)芳,*趙 娟

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801;2吉林省通化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,吉林梅河口 135007;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081

玉米SNAC基因的遺傳變異及耐旱性調(diào)控

李國君1,3,**馬藝文2,3,**徐丹陽3吳永波3宋 潔3王 楠3郝轉(zhuǎn)芳3,*趙 娟1,*

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷 030801;2吉林省通化市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,吉林梅河口 135007;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081

以我國玉米育種中常用的16份自交系為材料,通過對SNAC(Stress-responsive NAM,ATAF1/2,CUC2)基因編碼區(qū)及上游啟動子區(qū)800 bp核苷酸序列進(jìn)行測序,檢測SNAC基因在不同雜種優(yōu)勢類群材料中的遺傳變異。在12個SNAC基因中,其中有4個基因在上游800 bp區(qū)檢測到遺傳變異,有4個基因變異位點超過30個,多態(tài)性較高。雖然大多數(shù)SNAC基因變異以SNP(Single nucleotide polymorphism)為主,但在ZmNAC031467基因中檢測到較多的插入缺失變異(InDel),達(dá)到基因總遺傳變異的63.3%。通過PLACE軟件對上游啟動子有變異的4個基因進(jìn)行3種耐逆結(jié)合元件的預(yù)測,結(jié)果顯示4個基因均含有3種耐逆結(jié)合元件,但是基因突變對啟動子結(jié)合元件的影響較小。再對檢測到的遺傳變異進(jìn)行核苷酸多態(tài)性分析和中性檢驗,有7個SNAC基因核苷酸多態(tài)性較高,其中ZmNAC080308基因的多態(tài)性達(dá)到0.00962,推測這些基因在遺傳漂移過程中受自然選擇影響較大。利用t檢驗初步發(fā)現(xiàn)ZmNAC070395和ZmNAC080398基因的2個變異位點與耐旱相關(guān)性狀關(guān)聯(lián),為進(jìn)一步分析SNAC基因核苷酸變異與耐旱性狀的關(guān)系提供一定的借鑒。

玉米;SNAC基因;遺傳變異;耐旱性

玉米(Zea mays L.)是我國第一大作物,在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和國家糧食安全中占有舉足輕重的地位。干旱、高鹽、異常溫度等非生物脅迫是植物生長發(fā)育過程中面臨的主要非生物逆境脅迫因子,對作物造成傷害,據(jù)調(diào)查,全球作物產(chǎn)量減少約70%是由非生物脅迫直接影響的[1]。因此,提高抵抗非生物脅迫能力是目前玉米育種的主要目標(biāo)之一。在基因的非生物耐性應(yīng)激防御中,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在作物生長發(fā)育和環(huán)境互作中起到非常重要的作用,作物中一些與逆境相關(guān)應(yīng)答基因的表達(dá)以及作物抗逆性的提高與這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控是息息相關(guān)的[2]。NAC(NAM, ATAF1/2,CUC2)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族,研究顯示NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育中有重要的調(diào)控作用,同時也參與對非生物脅迫和病原菌侵染等生物脅迫的抗逆反應(yīng)[3]。本研究通過檢索轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫得到玉米NAC轉(zhuǎn)錄因子蛋白,并對聚類獲得的SNAC亞族基因進(jìn)行遺傳變異分析,旨在為挖掘耐旱相關(guān)基因及其遺傳變異提供參考依據(jù)。

目前研究發(fā)現(xiàn),NAC家族和植物頂端分生組織的形成、器官邊界的建立有關(guān)[4]。轉(zhuǎn)錄因子NAC最初發(fā)現(xiàn)于矮牽牛的NAM,以含有一致蛋白質(zhì)保守序列的NAM、ATAF1/2和CUC2首字母命名[5]。NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員N末端都具有大約150個氨基酸殘基組成的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,可以形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的三維結(jié)構(gòu),并能特異結(jié)合目標(biāo)DNA和蛋白。它能識別并結(jié)合核心序列CATGTG和CACG[6]。其C端為不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄激活域,具有高度多態(tài)性,含有較高頻率的簡單氨基酸,而且富含絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酸等重要氨基酸,這些可能與NAC的功能多樣化有關(guān)[7]。目前,在多個物種中都報道存在大量的NAC轉(zhuǎn)錄因子,Fang等[8]根據(jù)NAM保守的氨基酸序列把水稻基因組中140個NAC轉(zhuǎn)錄因子經(jīng)聚類分析分成五5個亞族。Shen等[9]將11個物種1232個NAC轉(zhuǎn)錄因子聚類為8個亞族,每個亞族又分成不同亞群。Nuruzzaman等[10]把在水稻和擬南芥中搜索到的151個和117個NAC轉(zhuǎn)錄因子共聚類為16個亞族。Nakashima等[11]將水稻、擬南芥等4個物種的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族分成6個亞族。雖然不同學(xué)者對物種NAC轉(zhuǎn)錄因子的聚類分析結(jié)果不盡相同,但研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)耐逆相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子都被分在同一個亞族。因此,把這一類NAC轉(zhuǎn)錄因子亞族統(tǒng)稱為SNAC(Stress-responsive NAC)轉(zhuǎn)錄因子。

與擬南芥和水稻相比,對玉米SNAC家族的研究相對薄弱[12]。玉米對非生物逆境非常敏感。水分不足或高溫傷害可以造成玉米植株矮小、果穗小、授粉不良、籽粒敗育、有效穗數(shù)少、穗粒重低、產(chǎn)量降低。2009年有專利表明ZmSNAC1~ZmSNAC5是與非生物逆境脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(WO 2009/ 052476 A2)。此外,Lu等[13]在擬南芥中驗證了玉米ZmSNAC1基因的抗脫水功能。Mao等[14]在玉米第10染色體上的SNAC基因ZmNAC111(GRMZM2G 127379)上游572 bp處啟動子區(qū)82 bp發(fā)掘一個微型回文轉(zhuǎn)座因子(MITE)插入位點,該位點普遍存在于溫帶玉米種質(zhì)中,而熱帶玉米種質(zhì)中缺失,證明與玉米苗期耐旱性有關(guān)。因此,考慮到SNAC家族在玉米抵抗非生物逆境上的功能,本研究以我國常用的16份不同雜種優(yōu)勢類群的玉米自交系為材料,以SNAC基因為研究對象,通過測序?qū)蜻z傳變異進(jìn)行研究,初步研究玉米中SNAC基因的核苷酸多態(tài)性和基因進(jìn)化過程中受到的選擇壓力,并對SNAC亞族基因啟動子區(qū)有變異的進(jìn)行耐旱相關(guān)結(jié)合元件的分析以及初步的耐旱性關(guān)聯(lián)分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為了分析玉米SNAC基因中的遺傳變異,選用玉米育種及生產(chǎn)中常用的16個自交系(表1),其中含雜種優(yōu)勢亞群PB、LAN(Lancaster)、SPT(唐四平頭)、LRC(旅大紅骨)血緣自交系各3份,Reid血緣自交系4份。研究材料涵蓋了我國玉米種質(zhì)的五大雜種優(yōu)勢類群,大多數(shù)選自我國廣泛種植的雜交種的親本,多樣性豐富。

1.2 樣品的制備

分別挑選各玉米自交系大小一致且飽滿的玉米種子20粒,均勻地擺放于裝有栽培土的塑料花盆中,將土澆灌至濕潤但不漏水的狀態(tài),2~3 d澆灌一次,待幼苗長至三葉期時將幼苗剪到自封袋中放入超低溫冰箱保存以備提取DNA使用。采用CTAB小量法[18]提取16份玉米自交系總DNA。

表1 研究用玉米自交系的基本情況Table 1 Basic information of tested maize inbred lines

1.3 測序分析

根據(jù)聚類獲得的16個玉米SNAC基因編碼區(qū)及啟動子區(qū)800 bp核苷酸序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計引物,采用巢式引物擴(kuò)增序列較長的基因。16個SNAC基因中擴(kuò)增出12個基因的全長,引物信息詳見表2,由美吉生物公司完成12個SNAC基因的PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收與純化及樣品測序。

離心泵在運行過程中因發(fā)生汽蝕直接影響到泵的性能，使泵的效率下降，揚程降低，嚴(yán)重時還會產(chǎn)生噪聲和振動，腐蝕破壞葉輪等過流部件[1]。因此，對離心泵的汽蝕性能進(jìn)行深入的研究，是很有必要且具有重要意義。

1.4 統(tǒng)計分析方法和軟件

通過ClustalW軟件比對玉米SNAC基因序列,應(yīng)用PLACE軟件分析啟動子區(qū)域抗逆結(jié)合元件,從MaizeGDB中查找相應(yīng)基因的啟動子區(qū)序列導(dǎo)入PLACE中根據(jù)需要的元件進(jìn)行篩選,又將測序后啟動子區(qū)有變異的進(jìn)行結(jié)合元件分析。采用DNAsp 5.0軟件分析基因序列,應(yīng)用π評估SNAC基因編碼區(qū)及800 bp啟動子區(qū)段的核苷酸多態(tài)性;利用Tajima’s D進(jìn)行中性檢驗;應(yīng)用SAS軟件對耐旱選擇指數(shù)和變異位點進(jìn)行t檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子的分子聚類分析

前期研究中的聚類分析表明,其中的26個 NAC蛋白分布于SNAC亞族中,被稱為玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子,編碼它們的16個基因被稱為玉米SNAC基因[19]。進(jìn)一步根據(jù)序列特征對這26個未知的玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行族內(nèi)聚類分析(圖1),研究發(fā)現(xiàn)可以將它們分成3組,第1組含有4個已知NAC轉(zhuǎn)錄因子ZmSNAC1、SNAC1、OsNAC4、OsNAC3及13個玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子;第2組含有ANAC055、ANAC019、ANAC072、AtNAC2、ANAC025及8個玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子;第3組包括5個已知的NAC轉(zhuǎn)錄因子ATAF2、OsNAC5、ATAF1、OsNAC6、SNAC2及5個玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子。其中擬南芥和水稻中的SNAC1、OsNAC4、ANAC055、ANAC019、ANAC072等基因均已報道與耐逆性相關(guān),可以提高植物的耐旱性[19]。根據(jù)比對結(jié)果,對序列相近的組內(nèi)玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子的研究可以借鑒擬南芥和水稻中已知的NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究內(nèi)容。

2.2 SNAC基因啟動子逆境相關(guān)順式作用元件的鑒定

植物啟動子中包含著許多響應(yīng)非生物脅迫的保守元件,調(diào)控下游功能基因的時空表達(dá)。為了闡明SNAC亞族基因啟動子區(qū)的保守元件可能的調(diào)控

機(jī)制,對啟動子區(qū)有變異的4個基因800 bp啟動子區(qū)進(jìn)行分析,鑒定了與逆境相關(guān)的順式作用元件。應(yīng)用PLACE軟件,鑒定啟動子區(qū)3種耐逆響應(yīng)元件,即干旱/脫水響應(yīng)元件(DRE)、低溫響應(yīng)元件(LTRE)和脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)[20],基于B73序列4個基因啟動子的研究結(jié)果,4個SNAC亞族基因中均檢測到3種元件。ZmNAC030295基因中含有4個DRE元件、2個LTRE元件和5個ABRE元件,DRE元件主要在300~700 bp間,LTRE元件在400~500 bp間, ABRE元件在400~700 bp間;ZmNAC040359基因含有2個DRE元件、2個LTRE元件和4個ABRE元件,DRE元件主要在600~700 bp間,LTRE元件在50~700 bp間,ABRE元件在 500~700 bp間; ZmNAC050302基因含有5個DRE元件、3個LTRE元件和7個ABRE元件,DRE元件主要在200~800 bp間,LTRE元件在200~600 bp間,ABRE元件在400~ 800 bp間;ZmNAC080308基因中含有2個DRE元件、2個LTRE元件和3個ABRE元件,ABRE元件分布在 100~200 bp和 700~800 bp之間,DRE元件在300~400 bp間,LTRE元件在600~700 bp之間(圖2)。

表2 擴(kuò)增12個SNAC基因序列所用引物信息Table 2 Basic information of primers for 12 SNAC genes

圖1 玉米SNAC家族和已知的擬南芥、水稻SNAC蛋白的聚類分析Fig.1 Phylogenetic tree among the SNAC proteins of maize and NAC proteins of Arabidopsis and rice圖中SNAC轉(zhuǎn)錄因子及擬南芥和水稻SNAC蛋白序列見Li等,2015[19]。Protein sequences of SNAC TF from maize,Arabidopsis and rice were described by Li et al.in 2015[19].

對突變后的4個SNAC基因啟動子區(qū)逆境結(jié)合元件分析表明,4個基因啟動子區(qū)共48個多態(tài)性位點(29個單體型)分別檢測到逆境結(jié)合元件,發(fā)現(xiàn)3個基因ZmNAC030295、ZmNAC040359和ZmNAC 080308啟動子區(qū)結(jié)合元件在數(shù)量上沒有任何變化(與B73序列比較),只有ZmNAC050302基因突變后ABRE元件數(shù)量減少2個,說明SNAC亞族的這些基因啟動子變異后對結(jié)合元件影響較小。

圖2 玉米NAC基因啟動子區(qū)域抗逆相關(guān)順式作用元件的分布

2.3 SNAC基因中遺傳變異分析

16個SNAC基因中除了4個基因(ZmNAC050302、ZmNAC060339、ZmNAC070359、ZmNAC070300)由于測序數(shù)據(jù)質(zhì)量差被淘汰外,共分析了12個SNAC基因的遺傳變異。在啟動子區(qū)和編碼區(qū)總共檢測到393個變異位點,其中檢測到SNP 237個,插入缺失156個,各個基因在玉米的10條染色體上位置,變異位點分布在基因上的位置見圖3。

在這12個基因中,在啟動子區(qū)檢測到變異的有4個,分別是 ZmNAC030295、ZmNAC040359、ZmNAC050302和ZmNAC080308;多態(tài)性位點超過30個的基因有 4個,分別是 ZmNAC031467、ZmNAC080398、ZmNAC080308和ZmNAC100475;檢測到遺傳變異以SNP位點為主的基因主要有ZmNAC010312、ZmNAC010373、ZmNAC050302和ZmNAC070395,僅檢測到3個插入缺失;以插入缺失為主的基因有1個,是ZmNAC031467,達(dá)到基因總遺傳變異的63.3%。

2.4 SNAC基因核苷酸多態(tài)性和中性檢驗

核苷酸多態(tài)性指標(biāo)π反映了不同材料之間堿基的差異情況,用于衡量群體中的多態(tài)性程度,是衡量遺傳多樣性的重要指標(biāo),群體的變異程度越高,其遺傳多態(tài)性越豐富[21]。在本研究中,檢測到ZmNAC080308的核苷酸多態(tài)性最高(π=0.00962)。另外,ZmNAC010312、ZmNAC030295、ZmNAC050302、ZmNAC080398、ZmNAC090241和ZmNAC100475基因π值較高,說明這7個基因群體的變異程度較高,遺傳多態(tài)性更豐富;ZmNAC010373、ZmNAC020303 (最低π=0.00051)、ZmNAC031467、ZmNAC040359和ZmNAC070395基因π值較低,說明這個基因群體的變異程度較低(表3)。

Tajima’s D檢驗是鑒定目標(biāo)DNA序列在進(jìn)化過程中是否遵循中性進(jìn)化模型。如果是負(fù)的顯著結(jié)果,那么這個結(jié)果可能是負(fù)選擇造成的,反之則受到平衡選擇[22]。本研究利用有限的群體針對自然選擇是否影響SNAC亞族基因初步分析,通過使用Tajima’s D值來檢測群體是否符合中性進(jìn)化模型(表3),其中大多數(shù)SNAC基因差異不顯著,說明這9個基因在群體中未偏離中性進(jìn)化,基因突變受自然選擇影響較小;ZmNAC020303、ZmNAC031467基因的Tajima’s D值分別為-2.21101、-2.29433,達(dá)到極顯著水平,說明這2個基因受負(fù)向選擇壓力較大,突變受自然選擇影響較大;同時ZmNAC050302基因Tajima’s D為2.14811,達(dá)極顯著水平,說明這個基因受正向選擇壓力較大,基因突變受自然選擇影響較大。

圖3 玉米SNAC基因的多態(tài)性位點

表3 核苷酸多樣性與中性檢測Table 3 Nucleotide diversity and neutrality test

2.5 SNAC基因的等位變異與耐旱選擇指數(shù)的t檢驗結(jié)果

t檢驗適用于總體標(biāo)準(zhǔn)差未知且樣本容量小于30的小群體范圍。本實驗利用t檢驗,對12個SNAC基因的393個多態(tài)性位點與耐旱選擇指數(shù)(表4)進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果在P-value<0.01水平上檢測到2個突變位點差異顯著,分別是位于第7染色體上的ZmNAC070395基因的553 bp位點和第8染色體上的ZmNAC080398基因的226 bp位點。初步推測這2個基因變異位點可能對耐旱性有著一定的影響,需要進(jìn)一步的驗證(表4)。

表4 SNAC基因多態(tài)性位點與選擇指數(shù)差異顯著性分析Table 4 Significant polymorphic variations in SNAC gene associated with drought-tolerance selection index

3 討論

3.1 玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子的分子聚類及與耐逆性的關(guān)系

在植物整個生育期中,NAC家族成員的功能具有多樣性,例如調(diào)控植物生長進(jìn)程,促進(jìn)頂端分生組織的發(fā)育,側(cè)根形成,次生細(xì)胞壁的合成等[23]。本研究通過對SNAC家族基因的進(jìn)一步聚類分析得知,由于不同物種蛋白質(zhì)序列相似性較高,相似的基因可能含有相同的功能性基序,所以推測它們能與已知基因聚到一起和已知基因具有相似或相同的功能。

玉米中響應(yīng)逆境的NAC基因有許多已經(jīng)被證實,ZmNAC55在擬南芥中過表達(dá)同樣增強(qiáng)了植株的耐逆性;ZmNAC111在擬南芥和玉米中的過表達(dá)都證明該基因使植株抗旱性增強(qiáng);ZmSNAC1在擬南芥中過表達(dá)能夠響應(yīng)干旱[13]。水稻中相關(guān)的NAC基因SNAC1[24]同樣能夠響應(yīng)干旱、高鹽、冷和 ABA; OsNAC4和ZmNAC080308基因的遺傳進(jìn)化距離較近, OsNAC4基因的功能是調(diào)控過敏性細(xì)胞死亡[25-26],因此ZmNAC080308基因極有可能參與植物響應(yīng)逆境脅迫和調(diào)控植物生長發(fā)育中的過敏性細(xì)胞死亡;通過RNA干擾和基因過表達(dá)2種手段對OsNAC5響應(yīng)非生物脅迫研究發(fā)現(xiàn),RNA干擾的植株對干旱、冷和鹽脅迫比野生型的抗性降低,然而OsNAC5在擬南芥和水稻中過表達(dá)能夠增強(qiáng)對這些非生物脅迫的抗性[27];此外,OsNAC6基因能夠被干旱、ABA、冷和鹽所誘導(dǎo)[28];SNAC2在水稻中受干旱、鹽、冷和ABA誘導(dǎo),且在轉(zhuǎn)基因植株過表達(dá)能夠提高植物耐性,特別是對干旱和ABA脅迫的耐性[29];另外,在冷脅迫時,野生型全部死亡,而轉(zhuǎn)基因植株仍然有50%的存活率。ANAC055、ANAC019、ANAC072 (RD26)3個擬南芥NAC基因都能被干旱、高鹽或低溫所誘導(dǎo)[30];ATAF1是擬南芥中第一個被發(fā)掘的NAC基因,它被干旱和ABA強(qiáng)烈誘導(dǎo),對擬南芥幼苗進(jìn)行控水試驗發(fā)現(xiàn),正常澆水條件下ATAF1表達(dá)量在很低的水平,干旱脅迫下ATAF1上調(diào)表達(dá),說明隸屬于ATAF1一類的SNAC轉(zhuǎn)錄因子具有響應(yīng)逆境脅迫的功能[31]。

這些脅迫相關(guān)的SNAC轉(zhuǎn)錄因子有一個共同點,那就是在起始密碼子前1500 bp區(qū)域內(nèi)(通常認(rèn)為的啟動子區(qū)域)都包含有許多脅迫相關(guān)的順式作用元件。本研究中對啟動子區(qū)有變異的4個基因ZmNAC030295、ZmNAC040359、ZmNAC050302、 ZmNAC080308的啟動子區(qū)800 bp所含逆境相關(guān)順式作用元件進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)了3種元件:干旱/脫水響應(yīng)元件(DRE)、低溫響應(yīng)元件(LTRE)和脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)。并結(jié)合擬南芥及水稻的SNAC基因的聚類分析,能夠進(jìn)一步推斷SNAC轉(zhuǎn)錄因子的功能與其啟動子區(qū)域所包含的這些逆境相關(guān)順式作用元件有著緊密聯(lián)系。順式作用元件是由大約5~20 bp的核苷酸編碼組成的保守基序,決定了NAC轉(zhuǎn)錄本的啟動能力[32]。研究發(fā)現(xiàn),寒冷與脫水響應(yīng)元件(C repeat/DRE/CRT)是一種不依賴于ABA的調(diào)控元件,在冷害、高鹽脅迫下都能起一定的調(diào)控作用。當(dāng)DRE/CRT結(jié)合蛋白DREB1/CBF在擬南芥過表達(dá)時,改變了40多個脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá),從而對嚴(yán)寒、高鹽、干旱的耐受性發(fā)生改變[33-35]。植物激素ABA在植物生長發(fā)育各個階段及響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[36]。例如,亮氨酸拉鏈蛋白與ABA響應(yīng)元件結(jié)合后,在依賴ABA的調(diào)控系統(tǒng)中成為一種轉(zhuǎn)錄激活因子[37-38]。目前關(guān)于SNAC轉(zhuǎn)錄因子啟動子順式作用元件的研究已有許多證實。水稻SNAC基因OsNAC5、OsNAC6啟動子區(qū)都含有ABA響應(yīng)元件ABRE[39];SNAC1和OsNAC3的啟動子包含干旱響應(yīng)元件(DRE)[40]。SNAC1啟動子還包含LTRE、HSE、ABRE等低溫、高熱和ABA響應(yīng)元件[41]。擬南芥SNAC基因ATAF1啟動子同樣含有非生物脅迫的順式作用元件ABRE、DRE/CRT[31]。對擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子ANAC072啟動子1000 bp序列研究中發(fā)現(xiàn)了 DRE元件[42]。另外,Mao等[14]在玉米ZmNAC55的啟動子區(qū)段檢測到一些脅迫相關(guān)順式作用元件ABRE、CRT、LTRE、DRE等。而ZmNAC55又與SNAC1和ZmSNAC1具有很近的同源關(guān)系。

3.2 玉米SNAC基因的遺傳變異分析

單核苷酸多態(tài)性是目前發(fā)現(xiàn)的最豐富和多樣的遺傳變異,玉米中單核苷酸變異非常豐富,研究發(fā)現(xiàn)單核苷酸變異與玉米的基因功能息息相關(guān)。因此,發(fā)掘并解析玉米SNAC基因中的單核苷酸多態(tài)性對遺傳研究非常重要,玉米基因組中許多SNP或In/Del與基因調(diào)控和功能息息相關(guān),尤其是在逆境適應(yīng)性方面起著決定性作用[43]。植物基因組序列變異是導(dǎo)致性狀發(fā)生的關(guān)鍵,如果發(fā)生在編碼區(qū),一個堿基的變化有可能改變一個蛋白質(zhì)的功能,如果在植物的調(diào)節(jié)基因上發(fā)生等位變異,則有可能影響整個基因的表達(dá)水平,并可以導(dǎo)致定量突變。生物體中大多數(shù)自然發(fā)生的遺傳變異是以單個堿基變化或小的插入/缺失表現(xiàn)的,這種變異即是SNP或In/Del(單核苷酸多態(tài)性及插入缺失)。研究發(fā)現(xiàn),許多SNP或In/Del無論在結(jié)構(gòu)基因還是在調(diào)節(jié)基因中都是表型變異的驅(qū)動者,并決定了種質(zhì)差異。

Mao等[14]對玉米第 10染色體上 SNAC基因ZmNAC111(ZmNAC100475)ATG前572 bp處發(fā)現(xiàn)了一個82 bp的微型回文結(jié)構(gòu)MITE的插入,這導(dǎo)致了甲基化的發(fā)生,并抑制ZmNAC111的表達(dá)。它們普遍存在于溫帶玉米種質(zhì)中,而熱帶玉米種質(zhì)中缺失,證明與玉米苗期耐旱性有關(guān)。Yang等[44]對大豆成熟果莢的散粒程度的研究中發(fā)現(xiàn)了一個NAC基因SHAT1-5能夠調(diào)控果莢次生細(xì)胞壁的木質(zhì)化纖維覆蓋細(xì)胞,這個機(jī)制就是由SHAT1-5引起了在第16染色體的一段約116 kb的選擇性清除的結(jié)果。目前,從遺傳變異角度探索SNAC基因功能的研究較少,而這幾項研究可以作為玉米自然遺傳變異的前車之鑒。在我們的研究當(dāng)中一共檢測了12個SNAC基因的遺傳變異,在啟動子區(qū)域(ATG前800 bp)檢測到變異的有4個,通過測序分析對比發(fā)現(xiàn),在ZmNAC080308啟動子內(nèi)產(chǎn)生大量的核苷酸多態(tài)性,其中包括SNP和InDel,雖然結(jié)合耐旱選擇指數(shù)沒有發(fā)掘出更多的耐旱功能型變異,但不可否認(rèn)這些變異極可能會使作物具有響應(yīng)非生物脅迫的能力,我們可以進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)及對基因功能的影響,這為玉米SNAC轉(zhuǎn)錄因子的遺傳變異研究指引了新方向。

4 結(jié)論

12個玉米SNAC基因與擬南芥及水稻中已知的SNAC基因具有相似的功能基序,推測參與類似的耐逆功能代謝途徑。4個玉米SNAC基因在上游800 bp檢測到遺傳變異,序列含有3種逆境相關(guān)的順式作用元件。其中有7個SNAC基因核苷酸多態(tài)性較高,ZmNAC080308基因的多態(tài)性達(dá)到0.00962,說明這些基因在遺傳漂移過程中受自然選擇影響較大。ZmNAC070395的553 bp位點和ZmNAC080398的226 bp位點與耐旱選擇指數(shù)極顯著相關(guān),推測這兩個核苷酸多態(tài)性位點對玉米耐旱性有著一定影響,可以被考慮作為耐旱標(biāo)記輔助選擇。

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Genetic Variations and Drought Tolerance of SNAC Genes in Common Maize Inbred Lines of China

LI Guo-Jun1,3,**,MA Yi-Wen2,3,**,XU Dan-Yang3,WU Yong-Bo3,SONG Jie3,WANG Nan3,HAO Zhuan-Fang3,*,and ZHAO Juan1,*

1College of Agronomy,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China;2Tonghua Academy of Agricultural Sciences,Tonghua 135007,China;3Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China

The coding regions and their upstream 800 bp promoter regions of SNAC genes(Sress-responsive NAM,ATAF1/2,

CUC2)were sequenced in 16 maize inbred lines commonly used in China.Among 12 SNAC genes,genetic variations in promoter region were only identified in four SNAC genes,and more than 30 variations were identified in four SNAC genes,showing higher polymorphism in the four genes than other in SNAC genes.Although most of the SNAC genes were mainly SNP(Single nucleotide polymorphism)mutations,more insertion/deletion mutations were detected in ZmNAC031467 gene,reaching 63.3%of the total genetic variations.The PLACE software was used to predict three kinds of stress-tolerant binding elements in SNAC gene,but little effect was found to be related with the variations.Additionally,high nucleotide polymorphisms were identified in seven SNAC genes,especially with the highest π value of 0.00962 in ZmNAC030308,which suggested that they were greatly influenced by natural selection in the genetic drift.With the t-test,two mutations of ZmNAC070395 and ZmNAC080398 genes were associated with drought-tolerant traits,which provides references for further analysing the relationship between nucleotidevariation in SNAC and drought tolerance traits.

Zea mays L.;SNAC genes;Genetic variations;Drought tolerance

(

):2016-11-29;Accepted(接受日期):2017-04-20;Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2017-05-11.

10.3724/SP.J.1006.2017.01128

本研究由國家自然科學(xué)基金重大國際合作項目(31661143010)和面上項目(31271735)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(31661143010,31271735).

*通訊作者(Corresponding authors):郝轉(zhuǎn)芳,E-mail:haozhuanfang@163.com,Tel:010-82108596;趙娟,E-mail:sxndzhaojuan@163.com, Tel:13834836658

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

聯(lián)系方式:李國君,E-mail:liguojun911@163.com,馬藝文,E-mail:mayiwen3070@163.com

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170511.1152.012.html