人教版選修教材中“基因工程”教學(xué)難點(diǎn)的解決策略

胡 玉

(河南省基礎(chǔ)教育教學(xué)研究室 鄭州 450016)

自20世紀(jì)70年代誕生以來(lái)，基因工程已經(jīng)成為生命科學(xué)中最具活力的前沿領(lǐng)域之一。引導(dǎo)學(xué)生深入理解基因工程的基本原理和技術(shù)流程，了解基因工程在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、環(huán)境保護(hù)等方面的廣泛應(yīng)用及發(fā)展前景，可較好地拓展學(xué)生的科技視野、增強(qiáng)學(xué)生的科技意識(shí)，尤其是對(duì)那些有志于從事生物科學(xué)研究的學(xué)生，更顯得至關(guān)重要。但是，這部分內(nèi)容比較抽象，有一定難度。

現(xiàn)以人教版選修教材中基因工程的部分內(nèi)容為例，探討在實(shí)際教學(xué)過(guò)程中兩個(gè)常見難點(diǎn)的解決策略。

1 關(guān)于“利用PCR技術(shù)獲取目的基因”

如何利用PCR技術(shù)從大量DNA分子中獲取目的基因？對(duì)于我們需要的目的基因，必須知道該基因兩端的部分堿基序列，否則是不能利用這種方法獲取目的基因的。根據(jù)基因兩端的已知序列，合成相應(yīng)引物，利用該引物擴(kuò)增目的基因。只有特定的引物，才能擴(kuò)增出特定的DNA片段(目的基因)。由于學(xué)生對(duì)于PCR技術(shù)的原理及過(guò)程可能并不熟悉，對(duì)于引物的作用就不能理解。所以，有必要先講解PCR技術(shù)的原理及反應(yīng)過(guò)程。

1.1 介紹引物及其作用 DNA聚合酶(PCR中為Taq酶)只能從脫氧核苷酸鏈的一端添加單個(gè)脫氧核苷酸，而不能直接起始一條新鏈。要擴(kuò)增DNA分子中的一個(gè)基因，至少要知道該基因兩端的部分堿基序列，以便于根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物(能和基因兩端已知序列進(jìn)行堿基配對(duì)的短的脫氧核苷酸鏈)。由于DNA聚合酶只能從3′—OH端添加單個(gè)脫氧核苷酸，所以設(shè)計(jì)的引物對(duì)應(yīng)該分別和待擴(kuò)增基因兩條鏈已知序列的5′—OH端互補(bǔ)結(jié)合，以便于在DNA聚合酶的作用下，使單個(gè)脫氧核苷酸從引物的3′—OH端添加上去，使新合成的鏈沿5′—OH→3′—OH方向延伸。

反應(yīng)體系中要一次性加入足量的引物(足夠30～40次循環(huán))、足量的dNTP(即：dATP、dCTP、dGTP、dTTP，“d”代表“脫氧”；“T”代表“三個(gè)”；“P”代表“磷酸”“A、C、G、T”分別代表四種含氮堿基，它們是分別由四種普通的脫氧核苷酸在消耗ATP的基礎(chǔ)上活化而成的)，中間不需要再次加入。

1.2 介紹PCR過(guò)程 ①變性(90℃～95℃)：DNA模板在加熱作用下，堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，形成兩條單鏈；②復(fù)性(退火)(55℃～65℃)：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈；③延伸：(70℃～75℃)：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的子鏈。

圖1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體外擴(kuò)增 DNA技術(shù)的基本原理[1]

結(jié)合圖1介紹PCR過(guò)程之后，提出問題：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)?，F(xiàn)加入含有目的基因的DNA分子、引物對(duì)A、B(分別和目的基因兩條鏈的5′端結(jié)合)、dNTP及其他必需物質(zhì)進(jìn)行PCR，在第幾輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段(目的基因)？第四輪循環(huán)結(jié)束后，產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為多少？

這個(gè)問題需要學(xué)生結(jié)合圖1進(jìn)行思考，在這個(gè)過(guò)程中，他們能較好地理解PCR過(guò)程中復(fù)性時(shí)引物與模板鏈5′端的結(jié)合情況，以及目的基因到底是如何被克隆出來(lái)的。PCR擴(kuò)增DNA片段的特異性是由一對(duì)引物所決定的。反應(yīng)初期，原來(lái)的DNA擔(dān)負(fù)起模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5′—OH端之間的DNA片段(即目的基因)。

經(jīng)過(guò)這個(gè)過(guò)程的學(xué)習(xí)，學(xué)生能夠非常清晰地認(rèn)識(shí)到如何通過(guò)PCR技術(shù)，從DNA分子上擴(kuò)增出目的基因的過(guò)程。

2 關(guān)于“目的基因的運(yùn)載體”

關(guān)于“目的基因的運(yùn)載體”，教材只是重點(diǎn)介紹了質(zhì)粒這種載體，充當(dāng)載體的質(zhì)粒需要滿足的條件和理由沒有進(jìn)一步解釋；對(duì)其他載體與質(zhì)粒的差別沒有進(jìn)行描述；對(duì)于天然質(zhì)粒的改造問題，教材沒有描述，后面構(gòu)建表達(dá)載體也沒提及，學(xué)生不知其中的緣由。

對(duì)于這部分內(nèi)容，學(xué)生最多的疑問如下：λ噬菌體的衍生物是什么？人工改造質(zhì)粒是如何進(jìn)行的？改造的目的是什么？因此，在教學(xué)過(guò)程中，這幾個(gè)問題有必要講解清楚，建議補(bǔ)充以下內(nèi)容。

λ噬菌體基因組有60多個(gè)以上基因，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的活動(dòng)，這些基因所在區(qū)段是噬菌體生長(zhǎng)繁殖所必需的，在表達(dá)載體構(gòu)建中為不可替代區(qū)；而另一部分基因?qū)τ谑删w生長(zhǎng)周期不是必需的，這些基因所在區(qū)域就稱為可替代區(qū)，如果用外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能，正是這一特點(diǎn)構(gòu)成了λ噬菌體作為外源基因表達(dá)載體的基礎(chǔ)。野生型λ噬菌體DNA必須經(jīng)過(guò)改造才能成為理想的載體，其構(gòu)建過(guò)程主要有：①刪除基因組中非必需區(qū)，建立外源DNA片段的替換點(diǎn)，增加承載外源DNA片段的容量；②在非必需區(qū)內(nèi)插入或替換選擇的標(biāo)記基因和目的基因；③建立重組λDNA分子的體外包裝系統(tǒng)，使之有效地感染受體細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，將目的基因插入或替換進(jìn)入病毒基因組的可替代區(qū)，再利用病毒的侵染性,將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這就是病毒作為“分子運(yùn)輸車”的基本機(jī)理。

由于野生型λ噬菌體DNA對(duì)大多數(shù)目前在分子克隆中常用的限制酶有多個(gè)切點(diǎn)，而且有些位點(diǎn)恰巧定位于與噬菌體生長(zhǎng)繁殖關(guān)系密切的必需基因之中，這些位點(diǎn)的剪切重組必然嚴(yán)重影響噬菌體的繁殖。因此，野生型λDNA不能直接用作載體而需經(jīng)過(guò)改造才能成為有價(jià)值的克隆載體。天然λ噬菌體載體改造的關(guān)鍵是去除或改變其基因組必需區(qū)段內(nèi)多余的限制酶切位點(diǎn)。改造方法包括點(diǎn)突變、基因組的置換和缺失。由天然λ噬菌體改造獲得的就是λ噬菌體的衍生物。

天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。

現(xiàn)在常用的質(zhì)粒，都是早期利用天然質(zhì)粒經(jīng)歷多次改造而成的：如添加抗生素抗性基因(作為標(biāo)記基因，便于篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌)、添加 MCS (多克隆位點(diǎn))區(qū)域等。所謂添加MCS，是質(zhì)粒中的一段堿基序列，由數(shù)個(gè)酶切位點(diǎn)組成，這些位點(diǎn)在載體上都是單一位點(diǎn)[1]。