斑點叉尾鮰源殺鮭氣單胞菌無色亞種分離鑒定及藥敏特性

楊移斌胥 寧董 靖楊秋紅劉永濤艾曉輝

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223; 2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430223)

斑點叉尾鮰源殺鮭氣單胞菌無色亞種分離鑒定及藥敏特性

楊移斌1,2胥 寧1,2董 靖1,2楊秋紅1,2劉永濤1,2艾曉輝1,2

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所, 武漢 430223; 2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430223)

研究從患潰瘍癥斑點叉尾鲙中分離到一株致病性菌株ry01, 生理生化鑒定和16S rDNA基因序列分析表明ry01株為鮭氣單胞菌無色亞種(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。人工感染該菌后發(fā)病魚表現(xiàn)為與自然發(fā)病類似癥狀, 且從組織中再分離的細菌特性與原感染菌相同。腹腔注射后該菌株對斑點叉尾鲙的半數(shù)致死量為4.17×106CFU/mL。菌株ry01對強力霉素及左氧氟沙星等高度敏感, 為斑點叉尾鲙該病防控提供了理論依據(jù)。

斑點叉尾鲙; 殺鮭氣單胞菌無色亞種; 分離鑒定; 藥敏特性

斑點叉尾鲙(Ictalunes punctatus)又名溝鯰, 隸屬于鯰形目(Siluriformes)、鲙科(Ictaluridae)[1]。1984年由湖北科研機構引進中國養(yǎng)殖, 目前其養(yǎng)殖區(qū)域已擴散到全國幾十個省市, 養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷攀升。然而隨著養(yǎng)殖戶對高產(chǎn)量的追求, 養(yǎng)殖密度及規(guī)模不斷提高, 養(yǎng)殖區(qū)域環(huán)境不斷惡化。而且隨著養(yǎng)殖過程中高強度投餌, 攝食不完全, 形成大量殘餌, 為病原繁殖提供了良好的物質(zhì)條件, 一旦水溫等環(huán)境條件適合微生物生長, 病原數(shù)量將急劇增加,故在斑點叉尾鲙養(yǎng)殖過程中時有各種病害的大規(guī)模暴發(fā), 給養(yǎng)殖戶帶來了較大經(jīng)濟損失, 使得病害成為了斑點叉尾鲙養(yǎng)殖成功的一大障礙。目前已報道導致斑點叉尾鲙大規(guī)模發(fā)病的病原有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[2]、鲙愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)[2]、志賀氏菌(Shigella)[3]、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)[4]、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)[5]、鮑曼不動桿菌(Acinetobacte baumannii)[6]、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)[7]、柱狀嗜纖維菌(Cytophaga columnaris)[8]等, 但殺鮭氣單胞菌引起斑點叉尾鲙發(fā)病尚未見報道。

2016年2月, 湖南省常德地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的斑點叉尾鲙出現(xiàn)持續(xù)性發(fā)病, 發(fā)病水溫為12—15℃, 死亡率在后期呈暴發(fā)性上升的趨勢, 因發(fā)病規(guī)格集中在1 kg及以上, 總死亡率達到50%左右, 給養(yǎng)殖戶帶來了很大的經(jīng)濟損失。為了有效防控該疾病, 掌握發(fā)病原因, 本研究從患病斑點叉尾鲙體內(nèi)分離到一株高致病菌株, 對該菌株進行理化特性及16S rDNA基因序列分析, 從而鑒定其種類, 并進行人工回歸感染, 藥敏特性研究, 以期為斑點叉尾鲙防控該病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用魚發(fā)病斑點叉尾鲙周身發(fā)黑, 胸鰭及腹鰭基部有充血跡象, 眼球呈凸起狀, 體表呈點狀分布大量潰瘍(圖 1); 解剖發(fā)現(xiàn)體內(nèi)重要組織器官不同程度充血, 有大量腹水積存, 腸道幾乎無食物。在常德某水庫網(wǎng)箱養(yǎng)殖場取具典型癥狀的斑點叉尾鲙10尾作為實驗材料; 健康斑點叉尾鲙(50—100 g)購置武漢白沙洲水產(chǎn)市場, 體格健壯,無傷病, 暫養(yǎng)7d無異常后進行實驗。

主要試劑普通營養(yǎng)瓊脂、普通營養(yǎng)肉湯、水解酪蛋白瓊脂(MH)、腦心浸出液(BHI)、革蘭氏染色液、藥敏紙片及細菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司; PCR所用試劑、特異性引物及細菌基因組DNA提取試劑盒購均購自上海生工。

圖 1 發(fā)病斑點叉尾鲙Fig.1 Diseased Ictalunes punctatus

1.2 方法

病原菌分離取體表明顯有點狀潰瘍的斑點叉尾鲙10尾, 在無菌環(huán)境下取潰爛體表肌肉、肝腎脾重要器官、血水及腹水用于病原分離, 接種于NA及BHI平板上, 置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中 24h, 挑取形態(tài)大小類似, 優(yōu)勢度高的菌落進一步純化, 分離的菌株加入25%甘油保存于–80℃冰箱。

病原菌毒力分析及LD50測定人工感染: 分離菌株劃線于NA平板上, 28℃恒溫培養(yǎng)18h, 用無菌生理鹽水洗下菌苔, 參照麥氏比濁法調(diào)整菌懸液濃度為5.0×108CFU/mL。

將健康的斑點叉尾鲙分為實驗組和對照組, 每組10尾, 實驗組和對照組均設置3個重復。在整個感染實驗期間, 養(yǎng)殖水體溶氧保持為6.5—7.0 mg/L,水溫10—15℃, 實驗期間加強換水, 保證良好水質(zhì),不投喂食物。實驗組注射菌液0.2 mL/尾, 對照組實驗魚注射等量無菌生理鹽水。間隔12h檢查斑點叉尾鲙表現(xiàn), 記錄斑點叉尾鲙發(fā)病死亡情況, 并對瀕臨死亡魚進行解剖, 觀察發(fā)病主要癥狀, 進行病原菌再分離。

病原菌LD50測定: 將病原菌菌懸液稀釋成5.0× 104、5.0×105、5.0×106、5.0×107和5.0×108CFU/mL不同濃度, 從斑點叉尾鲙腹鰭基部注射, 進行攻毒試驗, 每尾注射劑量為0.2 mL。對照組斑點叉尾鲙注射等量無菌生理鹽水, 實驗組和對照組均設置2個重復, 每組實驗魚均為10尾, 水溫10℃—15℃。實驗周期為7d, 間隔12h觀察斑點叉尾鲙有無異常情況, 并記錄實驗魚發(fā)病死亡數(shù)量, 用概率單位圖解法[9]計算半數(shù)致死量(LD50)。

病原菌理化特性分析將病原菌接種于營養(yǎng)瓊脂平板上, 28℃培養(yǎng)24h, 進行革蘭氏染色, 光學顯微鏡觀察菌落形態(tài)特征, 采用細菌生化微量鑒定管參照文獻[10]測定生理生化指標。

病原菌16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建模板制備: 將病原菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基, 置于28℃搖蕩(200 r/min) 18h, 離心后收集菌體,提取DNA即作為PCR模板。

16S rDNA序列分析: 參照通用引物, 正向27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′, 反向1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。參照祝璟琳等[11]方法進行PCR反應擴增目的片段。擴增產(chǎn)物確定為目的片段后送上海生工純化及序列測定。

系統(tǒng)發(fā)育樹構建: 將分離菌株16S rDNA基因在NCBI中比對, 根據(jù)比對結果檢索出同源性較高的序列采用Clustal X軟件進行多序列匹配分析, 通過MEGA5.1軟件Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化樹, 1000次Bootstrap檢驗置信度。

藥敏特性研究通過紙片擴散法進行藥敏特性研究。將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基, 28℃震蕩(200 r/min) 18h后調(diào)整菌液濃度為2.0×107CFU/ mL, 取200 μL菌液均勻涂布于MH平板上, 貼上不同的藥敏紙片, 28℃培養(yǎng)24h后測量不同藥物的抑菌圈直徑(mm), 根據(jù)杭州微生物試劑有限公司藥敏紙片抑菌圈標準確定致病菌株對藥物的敏感程度。

2 結果

2.1 病原菌分離

從患病斑點叉尾鲙潰爛肌肉、腹水及血水中均分離純化到同一株優(yōu)勢菌, 暫命名ry01。通過回歸感染實驗, 分離菌株ry01對斑點叉尾鲙的毒力較強, 感染實驗用魚36h內(nèi)全部死亡。死亡斑點叉尾鲙體表嚴重充血, 有少量潰瘍癥狀, 解剖腹腔有大量腹水積存, 重要組織器官嚴重充血。病原菌再分離實驗得到與菌株ry01形態(tài)特征及理化特性一致的菌株。根據(jù)建立的實驗魚死亡率(%)與菌液濃度對數(shù)[lg(CFU/mL)] 的關系曲線: y=0.28x–1.356 (表1), 病原菌ry01對斑點叉尾鲙半數(shù)致死量LD50=4.17× 106CFU/mL, 根據(jù)Devesa[12]對魚類致病菌毒力劃分標準, 可判定病原菌ry01對斑點叉尾鲙具有很強的毒力。

表 1 分離株對健康斑點叉尾鲖LC50試驗結果Tab.1 The LC50of isolated strain in Ictalunes punctatus

2.2 病原菌鑒定

病原菌ry01是革蘭氏陰性菌, 具體生理生化特性見表 2, 菌株ry01的生理生化特性與殺鮭氣單胞菌無色亞種Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes基本一致。經(jīng)過16S rDNA基因序列與NCBI基因庫中已有序列比對, 結果顯示病原菌ry01與氣單胞菌屬種類同源性最高, 通過系統(tǒng)發(fā)育樹的構建(圖 2), 結果顯示菌株ry01與殺鮭氣單胞菌無色亞種Aeromonas salmonicida subsp.masoucida, Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes聚為一支, 同源性為99%。因此綜合常規(guī)生理生化判定病原菌ry01是殺鮭氣單胞菌無色亞種Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes。

表 2 病原菌生理生化特征Tab.2 Physiologic and biochemical characteristics of the pathogenic bacteria strains

圖 2 ry01株根據(jù)16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of ry01 strain

2.3 藥敏特性結果

藥敏特性研究結果顯示: 菌株ry01對環(huán)丙沙星、氯霉素、氟苯尼考及諾氟沙星等11種藥物高度敏感; 對慶大霉素中度敏感; 對苯唑西林、阿莫西林、磺胺異噁唑、克林霉素及利福平等7種藥物不敏感(表 3)。

3 討論

殺鮭氣單胞菌隸屬于氣單胞菌屬, 是革蘭氏陰性菌, 包括無色亞種(A.salmonicida subsp.achromogenes)、殺鮭亞種(A.salmonicida subsp.salmonicida)、殺日本鮭亞種(A.salmonicida subsp.masoucida)、史氏亞種(A.salmonicida subsp.smithia)和溶果膠亞種(A.salmonicida subsp.pectinolytica) 5 個亞種[13—15]。殺鮭氣單胞菌是鮭鱒魚類重要病原菌, 但隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展, 作為一種高致病力的條件致病菌, 其感染魚類種群進一步擴大,在世界范圍內(nèi)都有其致病導致魚類死亡的報道。目前國外報道的因殺鮭氣單胞菌感染死亡主要有鮭(Salmon)、逇(Serranus)、鯉(Carp)和裸蓋魚(Anoplopoma)等科屬魚類[16], 但國內(nèi)報道因殺鮭氣單胞菌致病相對較少, 目前從患病虹鱒(Salmo gairdneri)[17]、北極紅點鮭(Salvelinus leucomaenis)[18]、美洲紅點鮭(Salvelinus fontinalis)[19]、大西洋鮭(Salmo salar)[20]、刺參(Stichopus japonicus)[21]及鯉(Carp)[22]中分離到殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種, 而無色亞種僅從大西洋鮭(Salmo salar)[23]及大菱鲆(Scophthalmus maximus)[24]體內(nèi)分離到, 本研究從斑點叉尾鲙病例中分離到殺鮭氣單胞菌在國內(nèi)尚屬首次。殺鮭氣單胞菌感染魚類典型癥狀為有的為體表形成膿腫潰爛或者潰瘍, 也有的主要是皮膚潰瘍或潰爛, 并且不同種類魚潰爛的部位不盡相同[16]。本研究對象斑點叉尾鲙則體表出現(xiàn)點狀潰瘍, 繼而在發(fā)病一段時間后引起大規(guī)模死亡, 與殺鮭氣單胞菌致病癥狀類似。因殺鮭氣單胞菌傳播機制尚未明確, 主要傳播源可能來自患病魚、飼料、養(yǎng)殖環(huán)境及受傷等, 因此保持良好的養(yǎng)殖條件可能是防控該病較為高效的方式。

表 3 ry01藥敏試驗結果Tab.3 Antibiotic sensitivity of strain ry01

回歸感染實驗結果顯示, 從患病斑點叉尾鲙中分離到病原菌ry01能夠?qū)е掳唿c叉尾鲙發(fā)病, 并出現(xiàn)與自然發(fā)病類似體表潰爛癥狀, 而且根據(jù)半致死濃度可判定其對斑點叉尾鲙具有較強毒性, 進一步在感染發(fā)病斑點叉尾鲙體內(nèi)再分離到了與ry01理化特性一致的菌株。實驗結果證實菌株ry01為本次斑點叉尾鲙疾病的病原菌。

經(jīng)測定分離菌株ry01的理化特性, 發(fā)現(xiàn)其與殺鮭氣單胞菌無色亞種理化特性基本一致, 但根據(jù)文獻[10]可知, 殺鮭氣單胞菌無色亞種與殺日本鮭亞種理化特性僅V-P反應等指標不同, 故McCarthy等[25]認為殺鮭氣單胞菌無色亞種和殺日本鮭亞種可都歸為無色亞種。為了進一步鑒定分離菌株ry01, 選擇在細菌進化中高度保守的16S rRNA基因進行測序和細菌系統(tǒng)發(fā)育分析。本研究分離菌株ry01的16S rRNA序列與NCBI中已有的殺鮭氣單胞菌無色亞種同源性達99%以上, 基于ry01 16S rRNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹, 結果菌株ry01與無色亞種和殺日本鮭亞種聚成一支。綜合理化特性實驗結果, 判定菌株ry01為殺鮭氣單胞菌無色亞種Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes。

在國內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗生素仍然是防控細菌性疾病的主流藥物, 但是隨著時間的推移, 抗生素濫用, 耐藥菌株不斷出現(xiàn), 常導致病害防控失敗。本研究測定了分離菌株ry01對19種藥物敏感性, 實驗結果表明: 分離菌株ry01對氯霉素、氟苯尼考及諾氟沙星等11種藥物高度敏感; 對慶大霉素中度敏感; 對苯唑西林、阿莫西林及利福平等7種藥物不敏感。李紹戊等[23]研究表明大西洋鮭源殺鮭氣單胞菌無色亞種對慶大霉素及鏈霉素等多種藥物耐藥, 對卡那霉素中度敏感, 對沙星類及多西環(huán)素等高度敏感, 與本文研究結果有差異。另大菱鲆源殺鮭氣單胞菌無色亞種僅對4種藥物高度敏感[24],其原因可能在于抗生素濫用。此外據(jù)報道的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種基本都對氟喹諾酮類藥物高度敏感, 但對其他藥物都有差異[23]。為此提示我們在防控魚類殺鮭氣單胞菌病時應該科學篩選敏感藥物, 有針對性的精準用藥, 避免因盲目、濫用導致耐藥菌株的產(chǎn)生, 同時應加強魚類免疫增強劑的開發(fā),特別是中藥免疫增強劑, 提高魚類自身免疫力, 從而達到預防此類疾病及減少抗生素使用的目的。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF AEROMONAS SALMONICIDA SUBSP.ACHROMOGENES FROM ICTALUNES PUNCTATUS AND ITS ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY

YANG Yi-Bin1,2, XU Ning1,2, DONG Jing1,2, YANG Qiu-Hong1,2, LIU Yong-Tao1,2and AI Xiao-Hui1,2
(1.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China; 2.Hubei Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center, Wuhan 430223, China)

The isolated bacterial strain ry01 from Ictalunes punctatus with ulcer disease was identified as Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes by analyzing biochemical reactions and 16S rDNA gene sequence.The ry01-injected fish showed similar morphological and biochemical characteristics to those from naturally infected fish, supporting that Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes was the pathogen to Ictalunes punctatus.The LD50was 4.17×106CFU/ mL according to the Reed-Muench method.The isolated bacterial strain ry01 was highly sensitive to doxycycline and levofloxacin.This study provides theoretical basis for the prevention and control the disease of Ictalunes punctatus.

Ictalunes punctatus; Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes; Isolation and identification; Antimicrobial susceptibility

S941.4

A

1000-3207(2017)04-0787-06

10.7541/2017.98

2016-06-22;

2016-11-05

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203085)資助 [Supported by Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest of China (201203085)]

楊移斌(1988—), 男, 江西撫州人; 助理研究員; 主要從事水生動物病害臨床診斷及其防控技術研究。E-mail: yangyb1988@ 126.com

艾曉輝, E-mail: aixh@yfi.ac.cn