高效液相色譜法測定劍麻葉片中的可溶性糖含量

鹿志偉，楊子平，張燕梅，李俊峰，侯曉婉，趙艷龍，陸軍迎，周文釗*

（1.中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江524091；2.湛江市熱帶作物遺傳改良重點實驗室，廣東湛江524091）

高效液相色譜法測定劍麻葉片中的可溶性糖含量

鹿志偉1，2，楊子平1，2，張燕梅1，2，李俊峰1，2，侯曉婉1，趙艷龍1，陸軍迎1，2，周文釗1，2*

（1.中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江524091；2.湛江市熱帶作物遺傳改良重點實驗室，廣東湛江524091）

采用不同體積百分比濃度下的乙醇提取液對劍麻葉片中葡萄糖、果糖和蔗糖的提取效率進行研究，并建立能夠同時測定劍麻葉片中三種糖分的高效液相色譜方法。結果表明：60%的乙醇為最佳提取液，該方法的相對標準偏差為1.0%～4.6%，相關系數在0.999以上，加標回收率為98.5%～99.4%；劍麻葉片（干重）中3種糖的總含量達167 mg／g，其中葡萄糖含量最高為74 mg／g（干重）。

高效液相色譜；劍麻；可溶性糖；葉片

劍麻（Agave sisalana Perrine）屬于龍舌蘭科龍舌蘭屬多年生草本植物，是一種重要的熱帶經濟作物［1］。其作為硬質纖維的主要來源之一，具有重要的商業(yè)應用潛力，在世界范圍內廣泛種植［2－3］。目前，我國劍麻主要在廣東、廣西、海南等熱帶亞熱帶地區(qū)大面積種植［4－5］，對其利用主要為提取劍麻葉片中纖維，用于纜繩、麻布、地毯等，而纖維加工后剩下的麻渣則得不到有效的利用，被大量丟棄［6－7］。據前人［8－10］報道，劍麻麻渣中主要含有大量的多糖、黃酮、皂素、果膠、可溶性糖、纖維素等，而目前對其成分測定的研究主要為黃酮、皂素等成分，對劍麻葉片可溶性糖含量的研究尚未發(fā)現［11－13］?？扇苄蕴侵饕ü?、葡萄糖、蔗糖，其為植物成分測定的重要指標之一，為植物生理生化特征研究及副產品綜合利用提供了重要數據支撐［14－16］。高效液相色譜法為可溶性糖含量測定較為準確的方法之一，該方法具有靈敏、高效、快捷等優(yōu)點［14，18］。

因此，本試驗以劍麻葉片作為研究對象，采用高效液相色譜法對其可溶性糖含量進行測定，以期建立一種能夠同時測定果糖、葡萄糖、蔗糖三種可溶性糖含量的快速、高效、準確的方法，為劍麻相關生理生化指標分析以及副產品綜合開發(fā)利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄糖、果糖和蔗糖均為進口色譜純，水為超純水，無水乙醇（分析純），色譜純乙腈。“金邊毛里求斯”劍麻品種取自中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所劍麻種植圃。

1.2 主要儀器設備

高效液相色譜儀（LC－20A，日本島津公司），Inertsil胺基柱，恒溫水浴鍋，離心機（Eppendorf）。

1.3 樣品處理及提取方法

選取三株劍麻植株，每個植株選取一張葉片（葉片與莖干夾角為45°）。將每個葉片平均分成若干小份，均等挑取一半葉片作為試驗材料。稱取葉片鮮重后置于烘箱內70℃過夜烘干。待劍麻葉片重量不再發(fā)生變化時，記錄最終葉片干重。將每個品種的劍麻葉片混合打碎，置于保鮮盒內干燥保存，備用。

劍麻葉片可溶性糖提取方法參考劉勝輝、張秀梅等［17－18］，稍作修改，具體如下：劍麻葉片粉末采用體積百分濃度分別為雙蒸水、20%、40%、60%、80%乙醇及無水乙醇6種提取液提取，探索最佳提取液。精確稱取經粉碎機混勻的劍麻葉片1.00 g，同時添加0.1 g葡萄糖、0.1 g蔗糖和0.1 g果糖的混合樣作為陽性對照以及空白提取液對照，每個樣品重復4次。用4 mL提取液充分研磨，10000 r／min，室溫離心10 min，殘渣加入2 mL提取液繼續(xù)提取，收集所有上清液，96℃水浴蒸干，隨后定容至5 mL，漩渦混合，再使用一次性注射器抽取樣液，經0.45μm濾膜過濾后上機分析。

1.4 繪制標準曲線

精確稱取葡萄糖、蔗糖、果糖各20 g，置于500 mL燒杯中溶解，將溶解液置于1 L容量瓶中，用ddH2O定容至刻度，獲得各自濃度均為20 mg／mL的混標溶液，然后將混標溶液依次稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625 mg／mL。最后使用一次性注射器抽取標樣，經0.45μm濾膜過濾后上機分析。每個樣品平行4次。根據每個標樣的峰面積大小進行標準曲線繪制。

1.5 色譜分析條件

Inertsil胺基柱150 mm×4.6 mm，5μm；柱溫：35℃；流動相：乙腈：水＝75：25（V／V）；真空泵脫氣；流速：1 mL／min；進樣量：10.0μL。

1.6 加標回收率

運用加標樣回收法，每個測試樣品取2份，1份加入蔗糖、果糖、葡萄糖的標準溶液，1份不加，重復測定4次，最后計算平均回收率。

1.7 統計分析

使用SPSS19.0軟件對所得數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

取蔗糖、果糖、葡萄糖各級標準溶液（20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg／mL），進樣量為10μL，進行上樣分析，所得色譜圖見圖1，圖2同。以標樣質量濃度作為縱坐標，標樣峰面積作為橫坐標，制作標準曲線，得出回歸方程，結果見表1，蔗糖、果糖、葡萄糖的質量濃度與峰面積相關性均在0.999以上，其線性范圍為0.625～20 mg／mL。

圖1 標樣色譜圖Fig.1 Chromatophy of standards

表1 回歸方程、相關系數和線性范圍Tab.1 Regression equationswith correlation coefficients and linearity ranges

2.2 提取條件優(yōu)化

經上述提取方法及色譜條件對劍麻葉片提取液進行上機分析，各試驗組色譜疊加圖以及分析結果見圖2和表2、3。由圖2可知，各試驗組色譜疊加圖出峰時間及峰形完全保持一致。由表3可知，60%乙醇提取出來的果糖含量為73.28 mg／g，顯著高于其它試驗組結果；60%和80%的乙醇提取液提取葡萄糖的效果差異不顯著，但明顯大于其它試驗組結果；而在蔗糖的提取中，20%、40%、60%乙醇的提取效果差異不顯著，但蔗糖含量明顯大于其它試驗組結果；在總糖含量的提取效果中，60%乙醇提取效果最佳，明顯高于其它試驗組，達166.99 mg／g的干重含量。結果表明，60%乙醇提取液對果糖、葡萄糖以及蔗糖的單糖和總糖提取效果均最佳，且各重復組結果在統計學上差異較小，結果比較穩(wěn)定可靠。

圖2 各試驗組色譜疊加圖Fig.2 Overlapping chromatophic of each experiment

表2 不同提取液所提取糖濃度Tab.2 The extraction sugar concentration by different solutions

表3 不同提取液所提取糖濃度鄧肯分析Tab.3 The Duncanmultiple comparison analysis for extraction sugar concentration by different solutions

2.3 精密度及回收率試驗

準備待測的劍麻葉片提取液，每個樣品平行進樣4次，計算峰面積，分析相應的相對標準偏差（RSD）對測定結果的精密度進行檢測，結果顯示，3種可溶性糖的RSD分別為：葡萄糖4.18%、果糖2.71%、蔗糖0.71%。結果見表4。

準備兩份劍麻葉片提取樣品，其中一份加入果糖、葡萄糖、蔗糖標樣，另外一份加入空白提取液對照，重復測定4次，統計回收率，測定結果見表4。蔗糖、葡萄糖、果糖的加標樣回收率分別為98.43%、99.41%、99.80%，說明本試驗測定方法具有較高的精確性。

表4 方法的精密度和回收率試驗Tab.4 Precision and recovery of themethod

3 結果與討論

可溶性糖含量測定時樣品處理常用方法有水提法和醇提法兩種［18－19］，兩種方法各有優(yōu)劣。本文采用了6個體積百分比濃度的乙醇提取液對劍麻葉片中可溶性糖進行提取，充分對比水提法和醇提法兩種方法的優(yōu)勢。結果表明，水提法即0%的乙醇處理時，樣品溶解速率明顯大于其它試驗組，但是后期樣品蒸干處理時，蒸干速率較慢。而樣品處理采用醇提法時，樣品溶解速率隨著乙醇體積百分比濃度的增加而逐漸降低，但是后期樣品蒸干處理時，蒸干速率則明顯大于水提法試驗組，且隨著乙醇濃度的增加蒸干速率逐漸增加。另外，從表3可以看出，隨著乙醇濃度的增加，提取得到的可溶性總糖含量也隨之增加，在60%乙醇時達到最大，繼續(xù)增加時，總糖含量則出現下降的趨勢，且用無水乙醇提取時總糖含量出現明顯的下降，這可能是由于隨著乙醇體積百分比濃度的增加，可溶性糖的溶解度逐漸降低的原因。這與李映志［14］的研究結果相似。經綜合對比分析后，60%的乙醇溶液為最佳的可溶性糖提取液。

本研究對可溶性糖含量測定時樣品處理方法進行研究，發(fā)現最佳的樣品處理方法為使用60%乙醇作為提取液，采用Inertsil胺基柱作為分析柱，乙腈：水＝75∶25（V／V）作為流動相，柱溫35℃，分析劍麻葉片中果糖、葡萄糖、蔗糖，保留時間的重現性比較好，三者的色譜峰面積與含量之間呈現較好的線性關系，相對標準偏差為0.71%～4.18%，加標回收率為98.43%～99.80%，結果證明高效液相色譜法可作為一種高效、便捷、準確的劍麻葉片可溶性糖含量檢測方法。

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Determ ination of Soluble Sugar in Sisal Leaf by HPLC

LU Zhiwei1，2，YANG Ziping1，2，ZHANG Yanmei1，2，LIJunfeng1，2，HOU Xiaowan1，ZHAO Yanlong1，LU Junying1，2，ZHOUWenzhao1，2*
（1.South Subtropical Crops institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Zhanjiang，Guangdong 524091，China；2.Tropical Crop Genetic Improvement Key Laboratory of Zhanjiang，Zhanjiang，Guangdong 524091，China）

Different concentration ethanol extracting solutionswere selected to study the extraction efficiency for glucose，fructose and sucrose.The high efficiency HPLC way ofmeasuring the three soluble sugars simultaneously was expected to be constructed.The results showed that60%ethanolwas the optimal extraction solution，with relative standard deviations of1.0%～4.6%，association coefficients above 0.999 and the adding standard recoveries of 98.5%～99.4%.The total soluble sugar contentswere up to 167 mg／g，in which the glucose contentswere the highestwith the dry weight of 74 mg／g.

HPLC；sisal；soluble sugar；leaf

S563.8

A

1671－3532（2017）04－0189－06

2017－03－30

現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS－19）；湛江市熱帶作物遺傳改良重點實驗室建設項目（2015A06005）；中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所基本科研業(yè)務費專項（1630062016019）；國家自然科學基金（31401427）

鹿志偉（1990－），男，碩士，主要從事作物育種研究。E－mail：luzhiweihn＠126.com

*通訊作者：周文釗（1965－），男，研究員，主要從事劍麻育種研究。E－mail：zwenzhao＠163.com