食品添加劑對螺旋藻C-藻藍蛋白光保護的研究

劉帥洲，關 劍，吳 凡，吳 昊，段大亮，沈頌東

（1.蘇州大學 基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123；2. 太倉薇藻生物技術(shù)有限公司，江蘇 太倉 215400）

食品添加劑對螺旋藻C-藻藍蛋白光保護的研究

劉帥洲1，關 劍1，吳 凡1，吳 昊2，段大亮2，沈頌東1

（1.蘇州大學 基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州 215123；2. 太倉薇藻生物技術(shù)有限公司，江蘇 太倉 215400）

本實驗研究了不同食品添加劑對螺旋藻C-藻藍蛋白的光保護作用，挑選出了對藻藍蛋白有光保護作用的食品添加劑，包括糖類、維生素、苯甲酸鈉和檸檬酸鈉. 糖類光保護試驗中能產(chǎn)生光保護作用的濃度有3%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖；維生素C光保護試驗中能產(chǎn)生光保護作用的濃度按其保護作用大小依次有2.00 mg/ml，1.00 mg/ml＞3.00 mg/ml，0.50 mg/ml＞0.25 mg/ml，0.10 mg/ml＞0.05 mg/ml；苯甲酸鈉光保護試驗中有光保護作用的濃度按其保護作用從大到小依次有1.50 mg/ml＞2.50 mg/ml＞1.00 mg/ml＞3.00 mg/ml＞0.50 mg/ml；檸檬酸鈉光保護試驗中具有光保護作用的濃度按其作用大小依次為4.00 mg/ml，2.50 mg/ml，1.00 mg/ml，3.50 mg/ml，3.00 mg/ml，2.00 mg/ml和1.50 mg/ml. 在藻藍蛋白光保護多因素試驗中得出最佳光保護組合為：維生素C 2.00 mg/ml、糖0.00 mg/ml、苯甲酸鈉1.00 mg/ml、檸檬酸鈉1.00 mg/ml，影響光保護作用的主次順序為：維生素C＞糖類＞苯甲酸鈉＞檸檬酸鈉.

螺旋藻；C-藻藍蛋白；食品添加劑；光保護；多因素分析

藻膽蛋白是存在于藍藻、紅藻和隱藻中的一類水溶性捕光色素蛋白，可分為藻紅蛋白（PE）、藻藍蛋白（PC）、藻紅藍蛋白（PEC）和別藻藍蛋白（APC）. 其中，藻藍蛋白根據(jù)其來源可分為C-藻藍蛋白（藍藻門來源）和R-藻藍蛋白（紅藻門來源）等［1］. 藻藍蛋白是由α和β亞基構(gòu)成的寡聚蛋白，兩種亞基先聚合為αβ單體，再由單體形成（αβ）n多聚體. 亞基中含有開鏈四氫吡咯結(jié)構(gòu)的生色基團——藻藍素. 藻藍素能夠吸收600 nm區(qū)段的紅光，使藻藍蛋白呈現(xiàn)出肉眼可見的亮藍色［2］，且在620 nm處有最大吸收峰. 因此，藻藍蛋白可作為一種天然藍色色素，應用于食品、飲料以及化妝品的生產(chǎn)中. 藻藍蛋白還能激發(fā)出強烈的橙紅色熒光，可作為熒光探針或熒光染料，用于各種檢測試驗中，如流式細胞術(shù)、免疫熒光染色試驗、細胞染色和DNA染色等［3］. 國內(nèi)外的研究也表明，藻藍蛋白具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥和增強免疫力的醫(yī)療保健功效［3-4］. 雖然藻藍蛋白有很廣泛的應用潛力，但其不穩(wěn)定性也限制了它在實際生產(chǎn)實踐中的應用，尤其是在食品飲料方面的應用. 光照會破壞藻藍蛋白結(jié)構(gòu)使其顏色減淡，而藻藍蛋白的亮藍色是其作為天然藍色色素加入到食品及飲料中的一個賣點，嚴格的避光會使藻藍蛋白產(chǎn)品失去視覺上的優(yōu)勢. 因此，在食品飲料中加入能在光照下保護藻藍蛋白的食品添加劑是必不可少的. 本試驗深入探究了多種食品添加劑對藻藍蛋白溶液的光保護作用，并篩選出了幾種對藻藍蛋白有光保護作用的食品添加劑（蔗糖、葡萄糖、維生素C、苯甲酸鈉和檸檬酸鈉），以期得到藻藍蛋白飲品中食品添加劑的最優(yōu)光保護組合.

1 材料與方法

1.1 材料

螺旋藻藻藍蛋白由太倉薇藻生物技術(shù)有限公司提供；蔗糖、葡萄糖、維生素C、苯甲酸鈉和檸檬酸鈉均為分析純試劑.

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計、酶標儀、光照培養(yǎng)箱由蘇州大學基礎醫(yī)學與生命科學學院提供.

1.3 方法

1.3.1 藻藍蛋白單因素光保護試驗

選定不同食品添加劑的種類和濃度. 在每一食品添加劑對藻藍蛋白光保護的試驗中，配制不同瓶具有相應濃度食品添加劑和0.4 mg/ml藻藍蛋白的試驗溶液，并用不添加任何食品添加劑的0.4 mg/ml藻藍蛋白水溶液作為空白對照. 各組溶液都放置于25 ℃，3000 lx的光照培養(yǎng)箱中接受光照，每天測定各組在620 nm處的吸光值，測定7 d.

1.3.2 藻藍蛋白多因素光保護試驗

選取在水溶液中能對藻藍蛋白產(chǎn)生顯著光保護作用的食品添加劑濃度組，進行正交試驗. 分為光照組與黑暗組同時進行試驗，光照組試驗條件與單因素光保護試驗條件相同，黑暗組嚴格避光，其余試驗條件與光照組相同. 每隔12 h測定一次OD620值，測2次，計算24 h保存率. 24 h保存率=（24 h OD620值/無食品添加劑組的初始OD620值）×100%.

圖1 糖類對藻藍蛋白的光保護

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍蛋白單因素光保護試驗

2.1.1 糖類對藻藍蛋白光保護試驗

在糖類對藻藍蛋白光保護的試驗中，如圖1所示，糖類各組在7 d中OD620的值基本大于空白對照組OD620值，表明糖的存在增加了溶液中藻藍蛋白光穩(wěn)定性，對溶液中藻藍蛋白有光保護作用，其中3%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖的藻藍蛋白溶液組在620 nm處的吸光度全程均未小于空白組吸光度. LSD法多重比較顯示，空白對照組全程平均OD620值小于3%葡萄糖、5%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖的全程平均OD620值，其中與3%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖這4組差異顯著，與5%葡萄糖未達到顯著水平. 空白對照組全程平均OD620值大于7%葡萄糖的全程平均OD620值，且差異顯著. 因此，3%葡萄糖、3%蔗糖、5%蔗糖和7%蔗糖對溶液中的藻藍蛋白有顯著的光保護作用.

2.1.2 維生素C對藻藍蛋白光保護試驗

圖2 維生素C對藻藍蛋白光穩(wěn)定性的影響

如圖2所示，維生素C各濃度組中除0.02 mg/ml濃度組之外，其余濃度組在全程中OD620的值幾乎都大于空白對照組OD620值，即其余各濃度的維生素C對藻藍蛋白有光保護作用. LSD法多重比較顯示，空白對照組全程平均OD620值與0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/ml的全程平均OD620值差異顯著；與2 mg/ml組間的差異未達到顯著水平. 可知，除0.02 mg/ml濃度組之外，其他濃度組對溶液中藻藍蛋白均具有顯著的光保護作用，光保護作用大小為2.00 mg/ml，1.00 mg/ml＞3.00 mg/ml，0.50 mg/ml＞0.25 mg/ml，0.10 mg/ml＞0.05 mg/ml.

圖3 苯甲酸鈉對藻藍蛋白光穩(wěn)定性的影響

2.1.3 苯甲酸鈉對藻藍蛋白光保護試驗

如圖3可見，在苯甲酸鈉對藻藍蛋白光穩(wěn)定性的試驗中，空白對照組OD620值全程呈下降趨勢，且7 d內(nèi)下降值最大，其他苯甲酸鈉濃度組曲線較對照組平緩. 可知，苯甲酸鈉對溶液中的藻藍蛋白存在光保護作用. 重復測量方差分析后進行LSD法多重比較顯示，該試驗中各組之間的全程平均OD620值均存在顯著差異，其中2.0 mg/ml苯甲酸鈉濃度組的全程平均OD620值小于對照組平均值，其他苯甲酸鈉濃度組均大于對照組平均值. 因此，試驗中7組間藻藍蛋白的光穩(wěn)定性存在顯著差異，不同濃度苯甲酸鈉組對溶液中藻藍蛋白的光保護作用也有顯著差異，有光保護作用的濃度組按光保護大小從大到小排列為1.50 mg/ml＞2.50 mg/ml＞1.00 mg/ml＞3.00 mg/ml＞0.50 mg/ml.

2.1.4 檸檬酸鈉對藻藍蛋白光保護試驗

如圖4所示，在檸檬酸鈉對藻藍蛋白光穩(wěn)定性影響的試驗中，對照組、0.25 mg/ml檸檬酸鈉濃度組和0.50 mg/ml檸檬酸鈉濃度組的OD620值在7 d中表現(xiàn)出明顯下降趨勢，其他檸檬酸鈉濃度組OD620值下降緩慢或呈上升趨勢. 可知，一定濃度的檸檬酸鈉對溶液中的藻藍蛋白存在光保護作用. LSD法多重比較得，對照組的全程平均OD620值與0.50 mg/ml檸檬酸鈉濃度組全程平均OD620值差異不顯著，顯著大于0.25 mg/ml檸檬酸鈉濃度組全程平均OD620值，顯著小于其他檸檬酸鈉濃度組全程平均OD620值. 因此，除0.25 mg/ml和0.50 mg/ml的檸檬酸鈉濃度組外，其他濃度組在溶液中對藻藍蛋白有顯著光保護作用，光保護作用從大到小依次為4.00 mg/ml，2.50 mg/ml，1.00 mg/ml，3.50 mg/ml ，3.00 mg/ml，2.00 mg/ml和1.50 mg/ml.

圖4 檸檬酸鈉對藻藍蛋白光穩(wěn)定性的影響

2.2 藻藍蛋白多因素光保護試驗

分別從糖類、維生素C、苯甲酸鈉及檸檬酸鈉對藻藍蛋白光保護試驗中選出光保護作用最為顯著的4組濃度，進行正交試驗(見表1). 比較表1中極差大小可知，4種因素對溶液中藻藍蛋白光穩(wěn)定性影響的主次順序為：維生素C＞糖類＞苯甲酸鈉＞檸檬酸鈉. 最佳的藻藍蛋白光保護組合為：維生素2.00 mg/ml、糖0.00 mg/ml、檸檬酸鈉1.00 mg/ml、苯甲酸鈉1.00 mg/ml.

如圖5所示，光照組6，7，10，11，12，15，16，17，19，20，21，24和25號的24 h保存率都與黑暗組1號24 h保存率無顯著差別，說明光照組這些試驗號中的食品添加劑組合能提供給溶液中藻藍蛋白與在黑暗中無顯著差別的保護，即有光保護作用，最佳光保護組合為有效光保護組合.

圖5 光照組與黑暗組無添加劑24 h保存率對比

表1 藻藍蛋白光保護正交試驗表

3 討論

在藻藍蛋白光保護的單因素試驗中，糖類、維生素C、苯甲酸鈉和檸檬酸鈉對溶液中藻藍蛋白表現(xiàn)出了光保護作用. 其產(chǎn)生光保護作用的原因可能有如下幾點：第一對糖類而言，在糖水溶液中，糖的粘結(jié)力能增大水的表面張力，而影響蛋白質(zhì)分子在糖水溶液中的相互作用，起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用［5］. Chaiklahan等發(fā)現(xiàn)，在水溶液中，糖類會包裹在藻藍蛋白表面，從而維持和保護藻藍蛋白結(jié)構(gòu)［6］. 因此糖類能對溶液中藻藍蛋白起到光保護作用. 第二，藻藍蛋白是一種酸性蛋白質(zhì)，在水溶液中當pH值為4.0~8.5之間時較為穩(wěn)定［7］. 維生素C是一種酸性物質(zhì)，一定濃度的維生素C能提供維持藻藍蛋白穩(wěn)定所需的pH值，從而對藻藍蛋白起到光保護作用. 第三，苯甲酸鈉是一種常用的食品防腐劑，能抑制多種微生物在藻藍蛋白溶液中的繁殖. 第四，檸檬酸鈉是需求量較大的食品添加劑，在生產(chǎn)中可用作調(diào)味劑、緩沖劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑等，在多個方面也對藻藍蛋白起著光保護作用.

在多因素光保護試驗得出最佳的藻藍蛋白光保護組合為：維生素C 2.00 mg/ml、糖0.00 mg/ml、檸檬酸鈉1.00 mg/ml、苯甲酸鈉1.00 mg/ml，產(chǎn)生光保護作用的主次順序為：維生素C＞糖類＞苯甲酸鈉＞檸檬酸鈉. 在最佳光保護組合中，糖濃度為0.00 mg/ml，不似單因素試驗中糖的存在能提供藻藍蛋白更好的保護，猜測在多因素試驗中各因素間有交互作用.

蛋白質(zhì)在水溶液中不如在粉末狀態(tài)下穩(wěn)定，在無光照條件下，溶液中的蛋白質(zhì)也比粉末狀態(tài)蛋白質(zhì)破壞要迅速. 有研究發(fā)現(xiàn)，將藻藍蛋白包埋在硅膠基質(zhì)中，能在光照下有效保護藻藍蛋白的結(jié)構(gòu)并提升其光穩(wěn)定性［8］，因此開發(fā)粉末狀或果凍類的藻藍蛋白產(chǎn)品也許會比飲料類產(chǎn)品更利于保存. 在藻藍蛋白光保護多因素試驗中也發(fā)現(xiàn)，光照組與黑暗組的各食品添加劑組合24 h保存率變化趨勢大體上一致，但光照組24 h保存率在各食品添加劑組合下都不大于黑暗組. 這表明避光的環(huán)境更有利于藻藍蛋白的保存，在實際生產(chǎn)應用中應更注重產(chǎn)品包裝的設計與研發(fā).

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Abstract:This study investigates the Photo-protection of preservatives on C-phycocyanin, and we have selected some kinds of preservatives which have prominent protection for C-phycocyanin against light, including saccharide, vitamin C, sodium benzoate and sodium citrate. 3% glucose, 3% saccharose, 5% saccharose and 7% saccharose can protect C-phycocyanin in the solution. Vitamin C shows gradient decreased photo-protection on C-phycocyanin when it is under the concentration of 2.00 mg/ml, 1.00 mg/ml, 3.00 mg/ml, 0.50 mg/ml, 0.25 mg/ ml, 0.10 mg/ml and 0.05 mg/ml. Sodium benzoate shows gradient decreased photo-protection on C-phycocyanin when it is under the concentration of 1.50 mg/ml, 2.50 mg/ml, 1.00 mg/ml, 3.00 mg/ml and 0.50 mg/ml. Sodium citrate shows gradient decreased photo-protection on C-phycocyanin when it is under the concentration of 4.00 mg/ml, 2.50 mg/ml, 1.00 mg/ml, 3.50 mg/ml , 3.00 mg/ml, 2.00 mg/ml and 1.50 mg/ml. The optimal combination of these four kinds of preservatives on the photo-protection on C-phycocyanin is 2.00 mg/ml vitamin C, no saccharide, 1.00 mg/ml sodium benzoate and 1.00 mg/ml sodium citrate. According to the priority of the photoprotection, the order of the four factors is vitamin C, saccharide, sodium benzoate and sodium citrate.

Key words:spirulina; C-phycocyanin; preservative; photo-protection; multiple-factor analysis

The Photo-protection of Preservatives on C-phycocyanin

LIU Shuaizhou1, GUAN Jian1, WU Fan1, WU Hao2, DUAN Daliang2, SHEN Songdong1
(1. School of Biology and Basic Medical Science, Soochow University, Suzhou 215123; 2.Taicang Microalgal Biotechnology Co., Ltd, Taicang 215400, China)

S985.4

A

1008-2794（2017）04-0086-05

2017-05-20

太倉市科技局項目“藻藍蛋白工業(yè)化提取與保存的應用技術(shù)和工藝優(yōu)化”（TC2015CX15）

沈頌東，教授，博士，研究方向：藻類細胞培養(yǎng)，藻類開發(fā)與利用，藻類環(huán)境保護， E-mail：shensongdong@suda.edu.cn.