毛重樓藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

袁會瓊，劉 江，夏從龍（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

毛重樓藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

袁會瓊＊，劉 江，夏從龍#（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：建立毛重樓藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：從原植物形態(tài)、性狀特征、顯微特征（橫切面、粉末）對毛重樓藥材進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定藥材中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量：色譜柱為Agilent C18，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為0.9 mL/min，檢測波長為203 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為5 μL；采用紫外分光光度法測定藥材中重樓總皂苷的含量。結(jié)果：毛重樓根狀莖呈結(jié)節(jié)狀扁圓柱形，略彎曲。橫切面木質(zhì)部導(dǎo)管較大，韌皮部細(xì)胞小，粉末有大量淀粉粒，多為單粒。重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ和重樓總皂苷檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為0.64～12.8、0.46～9.2、0.26～5.2、0.23～4.6、20.5～143.5 μg（r分別為0.999 9、0.999 9、0.999 9、0.999 9、0.999 7）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜3.0%；加樣回收率分別為96.38%～105.24%（RSD＝3.01%，n＝6）、97.24%～102.57%（RSD＝2.50%，n＝6）、97.19%～101.74%（RSD＝1.52%，n＝6）、93.72%～104.00%（RSD＝3.53%，n＝6）、98.11%～104.50%（RSD＝2.57%，n＝6）。結(jié)論：該研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于毛重樓藥材的質(zhì)量控制。

毛重樓；藥材鑒定；含量分析；重樓皂苷；高效液相色譜法

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish the quality standard of Paris pubescens.METHODS：Qualitative identification of medicinal material was conducted from original plant morphology，properties and microscopic characteristics（cross section，powder）. The contents of parissaponinⅠ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶwere determined by HPLC.The determination was performed on Agilent C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of 0.9 mL/min.The detection wavelength was set at 203 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 5 μL.The content of total saponins in P.pubescens was determined by UV spectrophotometry.RESULTS：The rhizome of P.pubescens was nodular flat cylindrical in shape，slightly curved，tiny odor，bitter in taste.The large vessels were found in transverse xylem；phloem cells were small；powder had a large number of starch grains，mostly single grain.The linear ranges of parissaponinⅠ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶand total saponins were 0.64-12.8，0.46-9.2，0.26-5.2，0.23-4.6，20.5-143.5 μg（r were 0.999 9、0.999 9、0.999 9、0.999 9、0.999 7），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3.0%.The recoveries were 96.38%-105.24%（RSD＝3.01%，n＝6），97.24%-102.57%（RSD＝2.50%，n＝6），97.19%-101.74%（RSD＝1.52%，n＝6），93.72%-104.00%（RSD＝3.53%，n＝6），98.11%-104.50%（RSD＝2.57%，n＝6）.CONCLUSIONS：Established standard can be used for quality evaluation of P.pubescens.

KEYWORDSParis pubescens；Drug identification；Content analysis；Parissaponin；HPLC

毛重樓為百合科重樓屬植物毛重樓Paris mairei Levl的干燥根莖，又名慢勃勃（四川彝族語）、重樓、百草藥（云南）、猴胳臂蓮（四川），分布于云南西北部至東北部；生于海拔1 800～3 500 m的常綠闊葉林、針闊葉林、云南松林、黃櫟林下等[1]。重樓屬植物具有極高的藥用價值，其根莖大都含多種甾體皂苷，具有止血、鎮(zhèn)痛、收縮子宮和抗腫瘤等活性，臨床上常用于治療子宮出血、泌尿系統(tǒng)感染、外科炎癥、腫瘤等疾病[2-7]。毛重樓藥材根莖味苦、辛，性寒；能清熱解毒、平喘止咳、消腫散瘀，常用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、咳嗽、蛇蟲咬傷、跌撲傷痛等病癥[8-10]。2015年版《中國藥典》（一部）收載重樓為 云 南 重 樓 P.polyphylla Smith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.和七葉一枝花P.polyphylla Smith var.chinensis（Franch.）的干燥根莖[11]。由于重樓傳統(tǒng)藥用部位根莖的自然生長速度十分緩慢（從種子生長為藥用藥材，一般需10～15年），重樓藥材長期依賴野生資源，加之主產(chǎn)區(qū)亂采濫挖，忽視對資源的保護(hù)和繁育，導(dǎo)致重樓資源匱乏，供需矛盾日益突出[12]。為緩解重樓資源緊缺狀況，尋求合適的重樓替代基源植物，擴(kuò)大重樓屬藥用植物資源，因此有必要對同屬植物毛重樓進(jìn)行研究。根據(jù)文獻(xiàn)，現(xiàn)階段國內(nèi)對毛重樓的研究主要集中于化學(xué)成分分離及其抗腫瘤活性研究等方面[9-10，13]?；谝陨显颍驹囼灢捎脗鹘y(tǒng)的鑒別方法與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段相結(jié)合，對毛重樓原植物形態(tài)、性狀和顯微特征進(jìn)行了描述，建立其藥材鑒定和有效成分含量測定的方法，以期為合理利用重樓屬藥用植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TH-12H型生物組織自動脫水機(jī)（上海龍拓儀器設(shè)備有限公司）；BM-Ⅵ型生物組織冷凍包埋機(jī)（北京佳源興業(yè)科技有限公司）；QP-Ⅲ型生物組織切片機(jī)（孝感泰維科技有限公司）；E-400型顯微鏡（日本Nikon公司）；SB25-12D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司，功率：500 W，頻率：60 kHz）；1290型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）；T6型紫外可見分光光度計（北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑

重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ對照品（貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，批號分別為GZDD-0605、GZDD-0606、GZDD-0608、GZDD-0609，純度均≥98%）；薯蕷皂苷元對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111539-200001，純度：＞98%）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

毛重樓藥材采自大理白族自治州各縣市（大理云龍、大理喜洲、大理漾濞，編號分別為MY140801、MX140803、MY140805），經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥學(xué)教研室夏從龍教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 原植物形態(tài)

毛重樓原植物形態(tài)為莖高11～65 cm的多年生草本，紫色或綠色，光滑，粗糙或密被短毛。葉5～12枚，腹面綠色，背面淡綠色，呈倒披針形，倒卵形至倒卵狀披針形，有糠秕狀短毛呈密或稍疏狀分布?；üｉL2.5～18.5 cm，花基數(shù)4～5，萼片綠色、無毛，或與葉片一樣被毛，呈披針形、卵狀披針形；花冠比萼片長，呈黃綠色絲狀；雄蕊2輪，銳尖，花絲比花藥短；子房1室，綠色或變紫色，具紫色的棱，側(cè)膜胎座4～5；花柱基紫色，角盤狀，花柱紫色，柱頭與胎座同數(shù)，花時直立，果時外卷。果實呈紫色，近球形，果實有棱，上端開裂，種子近球形，有紅色多汁的外種皮[14-15]，詳見圖1。

2.2 性狀鑒別

毛重樓藥材根狀莖呈結(jié)節(jié)狀扁圓柱形，略彎曲，長5～10 cm，直徑1～1.5 cm。表面為棕色或棕褐色，密具明顯的粗環(huán)紋，環(huán)紋呈層狀突起；結(jié)節(jié)明顯，錯落且無規(guī)律，結(jié)節(jié)上有凹陷的須根及莖痕。頂端具鱗葉和莖的殘基。質(zhì)地堅實，斷面較平坦，為白色或淺棕色，粉質(zhì)，氣微，味微苦，詳見圖2。

2.3 顯微特征

圖1 原植物形態(tài)Fig 1 Original plant morphology

圖2 性狀特征Fig 2 Property characteristics

2.3.1 橫切面 橫切面可見表皮細(xì)胞1列，細(xì)胞類方形或類長方形，排列緊密、整齊，外壁多平直。皮層寬廣，皮層細(xì)胞多數(shù)呈類圓形，少數(shù)呈規(guī)則形，細(xì)胞內(nèi)分布大量淀粉粒；皮層薄壁細(xì)胞可見草酸鈣針晶束；內(nèi)皮層細(xì)胞較小，排列緊密，斷續(xù)呈環(huán)狀排列。中柱內(nèi)有約10～14個周木型維管束，為不規(guī)則型或橢圓形，呈環(huán)狀分布，排列相對緊密。木質(zhì)部導(dǎo)管較大，呈斷續(xù)或連續(xù)環(huán)列于韌皮部的四周，韌皮部細(xì)胞小，排列緊密，詳見圖3。

圖3 橫切面顯微特征Fig 3 Microscopic characteristics of cross section

2.3.2 粉末 粉末為淺灰白色，有大量的淀粉粒，多為單粒，呈類圓形、橢圓形或不規(guī)則形，臍點(diǎn)形狀多樣，可見一字形、點(diǎn)狀、星狀或人字形等，直徑約為3.645～21.87 μm；復(fù)粒相對較少，且復(fù)粒常有2～3個分粒組成。薄壁細(xì)胞中含草酸鈣針晶，大多數(shù)呈束狀分布，長為70.56～176.4 μm，直徑為19.6～30.38 μm；可見梯紋、螺紋導(dǎo)管，梯紋導(dǎo)管直徑為19.8～43.6 μm，螺紋直徑為14.6～39.4 μm，詳見圖4。

2.4 重樓皂苷含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～14 min，30%→40%A；14～40 min，40%A；40～70 min，40%→60%A）；流速：0.9 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μL。

圖4 粉末顯微特征Fig 4 Microscopic characteristics of powder

2.4.2 混合對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取各待測成分對照品，加甲醇溶解制成重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ質(zhì)量濃度分別為0.64、0.46、0.26、0.23 mg/mL的單一對照品溶液；取上述單一對照品溶液各適量，按1∶1∶1∶1（V/V/V/ V）混合，濾過，得混合對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱定藥材樣品粉末（過40目篩）0.5 g，置于量瓶中，精密加甲醇5 mL，稱定質(zhì)量，浸泡過夜，超聲（溫度：40℃）處理20 min，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，即得。

2.4.4 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.4.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖5。結(jié)果表明，理論板數(shù)以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰計均＞10 000，分離度均＞1.5，各成分基線分離度好。

圖5 高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms

2.4.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.4.2”項下混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.4.6 精密度試驗 取“2.4.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為2.37%、2.05%、2.16%、2.09%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.3”項下供試品（編號：MY140801）溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為0.53%、2.14%、1.90%、2.77%（n＝7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（編號：MY140801）適量，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ峰面積的RSD分別為0.53%、2.14%、1.90%、2.77%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.9 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（編號：MY140801）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量待測成分對照品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.4.10 樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量測定 取3批樣品各適量，分別按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，%）

2.5 重樓總皂苷（薯蕷皂苷元）的含量測定

2.5.1 顯色條件 精密吸取薯蕷皂苷元對照品溶液0.4 mL，置于具塞試管內(nèi)，水浴揮干溶劑，精密加高氯酸5 mL，密閉，60℃恒溫水浴中加熱15 min，取出冰浴冷卻至室溫，按紫外分光光度法在400～600 nm波長處掃描吸收光譜。結(jié)果顯示，對照品溶液在408 nm波長處有明顯的吸收峰，且峰形良好，干擾小，因此選擇408 nm為最大吸收波長。

2.5.2 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確量取對照品適量，加甲醇溶解制成薯蕷皂苷元質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。

2.5.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.5.1”項下對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，按“2.5.1”項下顯色條件進(jìn)樣測定，記錄吸光度。以重樓總皂苷進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性關(guān)系見表1。

2.5.4 精密度試驗 取“2.5.2”項下對照品溶液適量，按“2.5.1”項下顯色條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄吸光度。結(jié)果，薯蕷皂苷元吸光度的RSD＝0.11%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.3”項下供試品溶液（編號：MY140801）適量，分別于室溫下放置0、4、8、16、24 h時按“2.5.1”項下顯色條件進(jìn)樣測定，記錄吸光度。結(jié)果，重樓總皂苷吸光度的RSD＝1.51%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.6 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（編號：MY140801）適量，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.5.1”項下顯色條件進(jìn)樣測定，記錄吸光度。結(jié)果，重樓總皂苷吸光度的RSD＝0.75%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（編號：MY140801）適量，共6份，分別加入一定質(zhì)量的薯蕷皂苷元對照品，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下顯色條件進(jìn)樣測定，記錄吸光度并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.5.8 樣品中重樓總皂苷的含量測定 取3批樣品各適量，分別按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.1”項下顯色條件進(jìn)樣測定，記錄吸光度并計算樣品中重樓總皂苷含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本試驗對毛重樓的植物形態(tài)、性狀和顯微特征進(jìn)行了描述和鑒別，并采用HPLC法測定毛重樓中4種重樓皂苷含量，采用紫外分光光度法測定重樓總皂苷含量，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于毛重樓藥材的質(zhì)量控制。結(jié)果表明，重樓皂苷Ⅰ、Ⅵ、Ⅶ總含量平均值為0.27%，低于2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的0.6%，重樓總皂苷含量平均值為1.03%，且未檢出重樓皂苷Ⅱ，這可能與毛重樓的產(chǎn)地、生長年限或本身該成分含量較低有關(guān)，提示毛重樓與2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的基源品種質(zhì)量上存在較大差異，是否能將毛重樓替代滇重樓或七葉一枝花入藥，將有待進(jìn)一步的科學(xué)驗證。

[1] 李恒.重樓屬植物[M].北京：科學(xué)出版社，1998：42、182.

[2] 張燁，呂霜霜，周濃，等.不同生長年限滇重樓中4種重樓皂苷的含量比較[J].中國藥房，2011，22（43）：4081-4083.

[3] 何含杰，章懷云，陳麗莉，等.重樓皂苷的藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中藥材，2014，37（3）：527-530.

[4] 王羽，張彥軍，高文遠(yuǎn)，等.滇重樓的抗腫瘤活性成分研究[J].中國中藥雜志，2007，32（14）：1425-1428.

[5] 陳清，閻姝.重樓的藥理作用及其毒性反應(yīng)的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，31（7）：886-888.

[6] 張亞茹，彭獻(xiàn)娜，王彩虹，等.重樓活性化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2015，11（2）：39-40.

[7] 劉湘丹，王朝暉，徐玉琴，等.中藥材重樓研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報，2015，21（15）：90-93.

[8] 夏從龍.大理蒼山常見藥用植物圖鑒[M].昆明：云南科技出版社，2016：445.

[9] 劉瀟瀟，王磊，王強(qiáng)，等.毛重樓的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2014，39（16）：3107-3111.

[10] 黃賢校，高文遠(yuǎn)，谷克仁，等.毛重樓的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2009，40（9）：1366-1369.

[11] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：260.

[12] 成莉，甄艷，陳敏，等.擴(kuò)大重樓藥用資源研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2015，40（16）：3121-3124.

[13] 黃賢校，高文遠(yuǎn).毛重樓、北重樓和五指蓮的化學(xué)成分及其抗腫瘤活性研究[D].天津：天津大學(xué)，2010.

[14] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第15卷[M].北京：科學(xué)出版社，1978：86.

[15] 中國科學(xué)院昆明植物研究所.云南植物志：第8卷：下[M].昆明：云南科學(xué)技術(shù)出版社，2006：662.

Study on Quality Standard of Paris pubescens

YUAN Huiqiong，LIU Jiang，XIA Conglong（College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Yunnan Dali 671000，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-2985-04

2016-08-05

2016-10-12）

（編輯：張 靜）

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目（No.2013FB059）

＊碩士研究生。研究方向：藥用植物的種植資源與品質(zhì)評價。E-mail：1403561641@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：天然藥物資源調(diào)查與品質(zhì)評價。E-mail：Long7484@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.29