RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定抗菌消炎片中7種成分的含量Δ

許麗麗，王玉團(tuán)，徐麗華，林永強(qiáng)，牛 艷（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定抗菌消炎片中7種成分的含量Δ

許麗麗＊，王玉團(tuán)#，徐麗華，林永強(qiáng)，牛 艷（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101）

目的：建立同時(shí)測(cè)定抗菌消炎片中綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的方法。方法：采用反向高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Extend C18，流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為327 nm（綠原酸）、280 nm（黃芩苷）和450 nm（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚），柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.209 4～4.188 0 μg（r＝0.999 9）、0.372 0～7.440 0 μg（r＝0.999 9）、0.006 3～0.126 2 μg（r＝0.999 9）、0.011 6～0.232 2 μg（r＝0.999 9）、0.005 3～0.106 0 μg（r＝0.999 8）、0.012 8～0.256 4 μg（r＝0.999 9）、0.016 5～0.330 3 μg（r＝0.999 8）；定量限分別為2.01、1.93、0.76、1.25、1.24、0.53、1.53 ng，檢測(cè)限分別為0.98、0.65、0.25、0.42、0.41、0.18、0.52 ng；加樣回收率分別為98.41%～100.40%（RSD＝0.76%，n＝9）、96.17%～100.10%（RSD＝1.58%，n＝9）、96.11%～100.10%（RSD＝1.33%，n＝9）、96.29%～100.80%（RSD＝1.85%，n＝9）、96.88%～100.10%（RSD＝1.22%，n＝9）、97.81%～101.90%（RSD＝1.64%，n＝9）、96.46%～101.30%（RSD＝1.85%，n＝9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于抗菌消炎片中7種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

抗菌消炎片；反向高效液相色譜法；綠原酸；黃芩苷；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚；含量測(cè)定

ABSTRACTOBJECTIVE：To develop a method for simultaneous determination of chlorogenic acid，baicalin，aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcione in Kangjun xiaoyan tablets.METHODS：RP-HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent Extend C18with mobile phase consisted of acetonitrile-0.5%phosohoric acid solution（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were set at 327 nm（chlorogenic acid），280 nm（baicalin）and 450 nm（aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol，physcione）.The column temperature was 30℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of chlorogenic acid，baicalin，aloe emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcione were 0.209 4-4.188 0 μg（r＝0.999 9），0.372 0-7.440 0 μg（r＝0.999 9），0.006 3-0.126 2 μg（r＝0.999 9），0.011 6-0.232 2 μg（r＝0.999 9），0.005 3-0.106 0 μg（r＝0.999 8），0.012 8-0.256 4 μg（r＝0.999 9），0.016 5-0.330 3 μg（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantitation were 2.01，1.93，0.76，1.25，1.24，0.53 and 1.53 ng；the limits of detection were 0.98，0.65，0.25，0.42，0.41，0.18 and 0.52 ng，respectively.The recoveries were 98.41%-100.40%（RSD＝0.76%，n＝9），96.17%-100.10%（RSD＝1.58%，n＝9），96.11%-100.10%（RSD＝1.33%，n＝9），96.29%-100.80%（RSD＝1.85%，n＝9），96.88%-100.10%（RSD＝1.22%，n＝9），97.81%-101.90%（RSD＝1.64%，n＝9），96.46%-101.30%（RSD＝1.85%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is accurate，reliable and reproducible.It can be used for simultaneous determination of 7 components in Kangjun xiaoyan tablets.

KEYWORDSKangjun xiaoyan tablets；RP-HPLC；Chlorogenic acid；Baicalin；Aloe emodin；Rhein；Emodin；Chrysophanol；Physcione；Content detcrmination

抗菌消炎片系由金銀花、黃芩、大黃、百部、大青葉、知母和金錢草七味藥組成的復(fù)方制劑，有清熱、瀉火、解毒之功效，常用于治療風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、實(shí)火牙痛[1]等癥。方中金銀花具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的作用，其有效成分為綠原酸；黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血的作用，其有效成分為黃芩苷、黃芩素[2-3]；大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、活血祛瘀之功效，其有效成分為蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素、大黃酸、大黃素甲醚等[4-5]。該制劑的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有常規(guī)檢查項(xiàng)，無含量控制項(xiàng)，不能有效控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量。

鑒于此，筆者采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定抗菌消炎片中綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚[6-9]含量的方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2998二極管陣列檢測(cè)器和Empower工作站（美國(guó)Waters公司）；CP225D型萬分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；BK-600C型超聲波清洗儀（濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

抗菌消炎片（薄膜衣片，A廠，批號(hào)：20151101、20151102、20151103，規(guī)格：每片相當(dāng)于原藥材0.5 g；糖衣片，B廠，批號(hào)：150501、150603、150606，規(guī)格：每片相當(dāng)于原藥材0.5 g；糖衣片，C廠，批號(hào)：215001079、215004060、215005062，規(guī)格：每片相當(dāng)于原藥材0.5 g）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201314，純度：96.6%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201117，純度：91.7%）、蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-201308，純度：97.8%）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-200206，純度：97.8%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110：純度：98.5%）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201319，純度：99.6%）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-200610，純度98.6%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.5%磷酸溶液，梯度洗脫（0～5 min，5% A，5～20 min，5%→9%A，20～64 min，9%→21%A，64～80 min，21%→30%A，80～95 min，30%→80%A，95～100 min，80%→90%A，100～105 min，90%→100%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)分別：327 nm（綠原酸）、280 nm（黃芩苷）和450 nm（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取蘆薈大黃素對(duì)照品6.45 mg、大黃酸對(duì)照品11.61 mg、大黃素對(duì)照品5.30 mg、大黃酚對(duì)照品12.87 mg和大黃素甲醚對(duì)照品16.75 mg，置于同一200 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得大黃5種蒽醌類成分的混合對(duì)照品貯備液。精密稱取綠原酸對(duì)照品10.84 mg、黃芩苷對(duì)照品20.28 mg，再精密量取上述混合對(duì)照品貯備液10 mL，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別為104.7、186.0、3.154 1、5.805 0、2.650 0、6.409 3、8.257 8 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品（糖衣片除去包衣，薄膜衣片除去薄膜）研細(xì)，取約0.50 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，加70%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例，制備缺大黃、黃芩和金銀花的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以綠原酸峰計(jì)為208 75，保留時(shí)間為21.485 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、40 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD，結(jié)果見表2。

表2 LOQ與LOD測(cè)定結(jié)果（ng）Tab 2 Determination results of LOQ and LOD（ng）

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.50%、1.62%、0.78%、0.28%、1.09%、0.92%、1.12%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20151102）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.75%、0.30%、0.28%、0.39%、1.07%、0.11%、1.78%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20151102）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.24%、0.96%、1.84%、1.67%、1.45%、0.79%、1.18%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：20151102）0.25 g，精密稱定，各置于具塞錐形瓶中，分別精密加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

續(xù)表3Cotinued tab 3

2.10 樣品含量測(cè)定

取9批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/片）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/tablet）

3 討論

3.1 提取方式、提取時(shí)間和提取溶劑的考察

筆者考察了超聲和加熱回流兩種提取法，結(jié)果超聲提取法簡(jiǎn)便易行，且提取效果優(yōu)于加熱回流法；又比較了超聲處理15、30、45 min的提取效率，結(jié)果超聲處理30 min即可達(dá)到最佳提取效果；此外，還考察了水、50%甲醇溶液、70%甲醇溶液和甲醇作為提取溶劑的提取效果，結(jié)果70%甲醇溶液對(duì)7種待測(cè)成分的提取效果最高，因此本試驗(yàn)最終確定以70%甲醇溶液超聲提取30 min的方式進(jìn)行提取。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)7種待測(cè)成分的全波長(zhǎng)掃描圖譜發(fā)現(xiàn)，綠原酸在327 nm波長(zhǎng)下吸收最好，黃芩苷在280 nm波長(zhǎng)下吸收最好；5種大黃蒽醌類成分在220～230 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)靈敏度最高，但是有干擾色譜峰出現(xiàn)，干擾了大黃酸色譜峰，經(jīng)比較分析，在450 nm波長(zhǎng)處沒有干擾色譜峰出現(xiàn)，故選擇450 nm波長(zhǎng)測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚5種蒽醌類成分[10-11]，在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定黃芩苷，在327 nm波長(zhǎng)處測(cè)定綠原酸。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果分析

對(duì)9批樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明均能檢測(cè)出綠原酸、黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚7種成分，但各批樣品中上述7種成分的含量存在一定差異，這可能與金銀花、黃芩、大黃的來源、品種、生產(chǎn)制備工藝等有關(guān)。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于抗菌消炎片中7種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

[1] 衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑：第七冊(cè)[S].1993.

[2] 費(fèi)揚(yáng)，趙亮，張海，等.高效液相色譜法測(cè)定抗菌消炎片中綠原酸、黃芩苷、黃芩素和大黃酚的含量[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（10）：1191-1194.

[3] 林永強(qiáng)，徐麗華，王淑華.一測(cè)多評(píng)法同步測(cè)定銀黃片中6種咖啡?？鼘幩醄J].中草藥，2012，43（4）：706-710.

[4] 魏艷婷，張靜宜，張華潭，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定三黃滴丸中5種蒽醌類成分的含量[J].中國(guó)藥房，2015，26（27）：3867-3869.

[5] 何盛江，聶陽(yáng)，陳剛，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地羊蹄藥材中大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量[J].中國(guó)藥房，2016，27（33）：4719-4721.

[6] 王鈺瑩，馮偉紅，楊菲，等.“一測(cè)多評(píng)”法測(cè)定三黃片中的大黃蒽醌類成分[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37（2）：212-217.

[7]程小麗，魏勝利，劉春生，等.RP-HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定大黃中9種有效成分的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（18）：99-102.

[8] 趙吉平，劉愛萍.抗菌消炎膠囊中土大黃苷的薄層鑒別及HPLC鑒別方法研究[J].中國(guó)藥事，2012，26（6）：620-622.

[9] 史學(xué)紅，崔紹梅，田云美，等.HPLC法測(cè)定抗菌消炎片黃芩苷的含量[J].齊魯藥事，2010，29（8）：466-468.

[10] 李巧如，李小川，羅春香.抗菌消炎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中成藥，2007，29（12）：8-10.

[11] 張梅，任愛農(nóng)，楊玉蘭，等.HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定清清顆粒中9個(gè)成分的含量[J].藥物分析雜志，2015，35（1）：29-33.

Simultaneous Determination of 7 Components in Kangjun Xiaoyan Tablets by RP-HPLC

XU Lili，WANG Yutuan，XU Lihua，LIN Yongqiang，NIU Yan（Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）21-2981-04

2016-11-07

2017-04-11）

（編輯：劉 柳）

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.ZR2013HM074）

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥品質(zhì)量控制。電話：0531-81216527。E-mail：hshpipi@163.com

#通信作者：副主任藥師，碩士。研究方向：藥品質(zhì)量控制。電話：0531-81216522。E-mail：wytuan@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.28