苯酚-硫酸法結(jié)合校正因子法測(cè)定含半乳糖醛酸的多糖中的糖含量Δ

白瑞斌，馬玉玲，張 培，王燕萍，李應(yīng)東，胡芳弟#（.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000；.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，蘭州 730000）

苯酚-硫酸法結(jié)合校正因子法測(cè)定含半乳糖醛酸的多糖中的糖含量Δ

白瑞斌1＊，馬玉玲1，張 培1，王燕萍1，李應(yīng)東2，胡芳弟1#（1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，蘭州 730000）

目的：建立一種基于苯酚-硫酸法結(jié)合校正因子法測(cè)定含半乳糖醛酸（GalA）的多糖中糖含量的方法。方法：優(yōu)化苯酚-硫酸法的測(cè)定條件，以不同質(zhì)量比的GalA-葡萄糖（Glc）混合對(duì)照品溶液繪制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定含GalA的黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量，在此基礎(chǔ)上，根據(jù)GalA-Glc質(zhì)量比為0-100%時(shí)的回歸方程，以黨參多糖CPP1b為參照多糖計(jì)算校正因子，對(duì)樣品中的糖含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正，并以與黨參多糖CPP1b組成相同的混合單糖對(duì)照品對(duì)此方法合理性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：經(jīng)計(jì)算，黨參多糖CPP1b對(duì)Glc的校正因子為3.33，驗(yàn)證試驗(yàn)中與黨參多糖CPP1b組成相同的混合單糖對(duì)照品的糖含量測(cè)定結(jié)果為103.47%。精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD＜1%；加樣回收率為93.52%～107.35%（RSD＝5.09%，n＝6）。結(jié)論：該研究建立的方法可準(zhǔn)確測(cè)定類似于黨參多糖CPP1b的含GalA的多糖中的糖含量。

多糖；半乳糖醛酸；黨參多糖CPP1b；苯酚-硫酸法；校正因子法；糖含量；測(cè)定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for the content determination of saccharide in polysaccharides containing galacturonic acid based on phenol-sulfuric acid method combined with correction factor method.METHODS：The determination condition of phenol-sulfuric acid was optimized.A series of standard curves were drawn with glacturonic aid-glucose mixed control with different mass ratio.The content of saccharide in Codonopsis pilosula polysaccharides CPP1b samples containing galacturonic acid was determined.According to regression equation of galacturonic acid-glucose ratio of 0-100%，the correction factor was calculated by using C.pilosula polysaccharides CPP1b as the reference polysaccharide，and the results of content determination of saccharide were corrected.The rationality of this method was verified by using mixed monosaccharide control with same composition as C.pilosula polysaccharides CPP1b.RESULTS：The correction factor of C.pilosula polysaccharide CPP1b to glucose was 3.33；in validation test，the content of saccharide in mixed monosaccharide control with same composition as C.pilosula polysaccharides CPP1b was 103.47%.RSDs of precision and stability tests was＜1%.The recoveries ranged 93.52%-107.35%（RSD＝5.09%，n＝6）.CONCLUSIONS：The established method can accurately determine the content of saccharide in C.pilosula polysaccharides CPP1b containing galacturonic acid.

KEYWORDSPolysaccharides；Galacturonic acid；Codonopsis pilosula polysaccharides CPP1b；Phenol-sulfuric acid method；Correction factor method；Saccharide content；Determination

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，黨參具有抗腫瘤[1]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[2]等作用，而黨參多糖為其主要活性成分之一[3]。CPP1b是本課題組從黨參中分離的一種酸性果膠多糖[4]，是由鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）和半乳糖醛酸（GalA）組成的雜多糖，其中含有大量的GalA。本課題組發(fā)現(xiàn)，對(duì)于黨參多糖CPP1b這樣一個(gè)高純度多糖，采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖（Glc）對(duì)照品溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，所測(cè)得的糖含量僅為30.96%。該測(cè)定結(jié)果與高效凝膠色譜法測(cè)定結(jié)果相差甚遠(yuǎn)，其中的原因值得深入探討。楊鴻玲等[5]認(rèn)為，以某一種中性單糖為對(duì)照品測(cè)定酸性雜多糖中的總糖含量時(shí)，由于糖醛酸與中性糖的吸光系數(shù)不同，且二者形成糠醛衍生物的難易程度不同[6]，使得測(cè)定結(jié)果往往不能真實(shí)反映樣品中的總糖含量。Bornik MA等[7]認(rèn)為，GalA不能完全轉(zhuǎn)化為糠醛衍生物，從而使得酸性多糖中糖含量的測(cè)定值低于其實(shí)際值。因此，本課題組擬建立一種能準(zhǔn)確測(cè)定類似于黨參多糖CPP1b的含GalA的多糖中糖含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

UV-1700型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；CPA225D型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

Glc對(duì)照品（批號(hào)：110833-201205）、GalA對(duì)照品（批號(hào)：111646-200301）、Rha對(duì)照品（批號(hào)：111683-200401）、Ara對(duì)照品（批號(hào)：111506-200001）、Gal對(duì)照品（批號(hào)：100226-201105）均購自中國食品藥品檢定研究院（純度均＞98%）；黨參多糖CPP1b（我校實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)：20150403，純度：98.67%，GalA含量：83.39%）；苯酚（分析純，上海滬宇生物科技有限公司）；硫酸（分析純，白銀良友化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水為自制蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

Glc對(duì)照品溶液：精密稱取2.55 mg經(jīng)105℃干燥的Glc對(duì)照品，用水定容于25 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.102 mg/mL的Glc對(duì)照品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

GalA對(duì)照品溶液：精密稱取2.52 mg的GalA對(duì)照品，用水定容于25 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.101 mg/mL的GalA對(duì)照品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

黨參多糖CPP1b供試品溶液：精密稱取1.00 mg黨參多糖CPP1b樣品，用水定容于10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.100 mg/mL的黨參多糖CPP1b供試品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 苯酚-硫酸法測(cè)定條件的優(yōu)化

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取“2.1”項(xiàng)下Glc對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，加入5%苯酚溶液（取5.07 g重蒸苯酚，用水定容于100 mL量瓶中）1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻后于100℃反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，于490 nm波長處測(cè)定吸光度。以糠醛衍生物吸光度（y）為縱坐標(biāo)、Glc質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝27.24x+0.009 8（r＝0.997 4）。結(jié)果表明，Glc檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0～0.136 mg/mL。

2.2.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 分別精密量取“2.1”項(xiàng)下黨參多糖CPP1b供試品溶液、Glc對(duì)照品溶液、GalA對(duì)照品溶液各0.5 mL于試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下苯酚-硫酸法操作，于反應(yīng)時(shí)間（15 min）不變的條件下，測(cè)定3種物質(zhì)在不同反應(yīng)溫度（25、40、60、80、100℃）條件下的糖含量，由此考察反應(yīng)溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響（詳見表1）。由表1可知，在相同反應(yīng)時(shí)間條件下，隨著反應(yīng)溫度的升高，所測(cè)得的Glc對(duì)照品的糖含量基本不變，而所測(cè)得的GalA對(duì)照品及黨參多糖CPP1b的糖含量均有一定程度提高，于100℃條件下達(dá)到最大值。因此，選擇100℃作為本試驗(yàn)的反應(yīng)溫度。

表1 不同反應(yīng)溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響（n＝3）Tab 1 Effects of different reaction temperatures on the results of the test（n＝3）

2.2.3 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 分別精密量取“2.1”項(xiàng)下黨參多糖CPP1b供試品溶液、Glc對(duì)照品溶液、GalA對(duì)照品溶液各0.5 mL于試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下苯酚-硫酸法操作，于最佳反應(yīng)溫度（100℃）條件下，測(cè)定3種物質(zhì)在不同反應(yīng)時(shí)間（15、20、30 min）條件下的糖含量，由此考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響（詳見表2）。由表2可知，在最佳反應(yīng)溫度條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，所測(cè)得的Glc對(duì)照品的糖含量先升高后下降，而所測(cè)得的GalA對(duì)照品及黨參多糖CPP1b的糖含量均有一定程度提高，于30 min條件下達(dá)到最大值。因此，選擇30 min作為本試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間。

表2 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響（n＝3）Tab 2 Effects of different reaction times on the results of the test（n＝3）

2.3 以不同質(zhì)量比的GalA-Glc混合對(duì)照品溶液繪制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定樣品中的糖含量

根據(jù)黨參多糖CPP1b單糖組成及比例分析可知，其中GalA含量最高，為83.39%，因此本試驗(yàn)嘗試以不同質(zhì)量比的GalA-Glc混合對(duì)照品溶液繪制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，在經(jīng)優(yōu)化的苯酚-硫酸法測(cè)定條件下，測(cè)定黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量。

2.3.1 不同質(zhì)量比的GalA-Glc混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密量取“2.1”項(xiàng)下GalA對(duì)照品溶液和Glc對(duì)照品溶液各適量，將二者按不同質(zhì)量比混合，分別配制成GalA-Glc質(zhì)量比為100%-0、90%-10%、80%-20%、70%-30%、60%-40%、50%-50%、40%-60%、30%-70%、20%-80%、0-100%的系列溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 系列標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品中糖含量的測(cè)定 在經(jīng)優(yōu)化的苯酚-硫酸法測(cè)定條件下（反應(yīng)溫度為100℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min），以“2.3.1”項(xiàng)下不同質(zhì)量比的GalAGlc系列混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下苯酚-硫酸法操作，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（詳見表3），并在相同試驗(yàn)條件下，分別于490 nm波長處對(duì)黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量進(jìn)行測(cè)定（詳見表4）。

表3 不同質(zhì)量比的GalA-Glc混合對(duì)照品溶液的回歸方程和線性范圍Tab 3 Regression equations and linear ranges of GalA-Glc mixed control with different mass ratios

表4 根據(jù)不同質(zhì)量比的GalA-Glc混合對(duì)照品溶液的回歸方程測(cè)得的樣品中的糖含量（n＝3，%）Tab 4 Results of content determination of saccharide in samples according to regression equation of GalA-Glc mixed control with different mass ratios（n＝3，%）

由表3及表4可知，GalA-Glc混合對(duì)照品溶液的質(zhì)量比不同時(shí)，所得回歸方程的斜率有所不同，黨參多糖CPP1b樣品中糖含量的測(cè)定結(jié)果也不同。隨著GalAGlc混合對(duì)照品溶液中GalA質(zhì)量的增加，回歸方程的斜率減小，所測(cè)黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量呈增加趨勢(shì)。其中，當(dāng)以質(zhì)量比為0-100%的GalA-Glc混合對(duì)照品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，所測(cè)黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量最低，為30.24%；當(dāng)以質(zhì)量比為100%-0的GalAGlc混合對(duì)照品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，所測(cè)黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量最高，為87.85%。由此可以推斷，以GalA-Glc混合對(duì)照品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量，其結(jié)果與實(shí)際值存在一定的偏差。

2.4 校正因子計(jì)算及樣品中糖含量測(cè)定結(jié)果的校正

由表4可知，以不同質(zhì)量比的GlaA-Glc混合對(duì)照品制備系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，其測(cè)定值與實(shí)際值均存在一定的誤差，無法準(zhǔn)確計(jì)算黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量，因此本試驗(yàn)引入校正因子計(jì)算樣品的糖含量。以中性單糖（本試驗(yàn)為Glc）為對(duì)照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以黨參多糖CPP1b為參照多糖計(jì)算校正因子，對(duì)樣品中的糖含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。

精密量取“2.1”項(xiàng)下黨參多糖CPP1b供試品溶液（質(zhì)量濃度0.100 mg/mL）0.5 mL于試管中，加水至2.0 mL，平行制備3份，在經(jīng)優(yōu)化的苯酚-硫酸法測(cè)定條件下，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，自“加入5%苯酚溶液”起進(jìn)行余下操作，測(cè)定吸光度，根據(jù)表3中GalA-Glc質(zhì)量比為0-100%時(shí)的回歸方程計(jì)算黨參多糖CPP1b的質(zhì)量濃度（c），并按下式計(jì)算校正因子（f）：

f＝W/c·D………………………………………（1）

其中，W為稱取的黨參多糖CPP1b質(zhì)量（mg）；c為測(cè)得的黨參多糖CPP1b的質(zhì)量濃度（mg/mL）；D為黨參多糖CPP1b的稀釋倍數(shù)。經(jīng)計(jì)算，黨參多糖CPP1b對(duì)Glc的校正因子為3.33（n＝3）。進(jìn)而按下式校正和計(jì)算樣品中的糖含量：

糖含量（%）＝（c·D·f）/W×100%……………（2）

經(jīng)校正和計(jì)算，黨參多糖CPP1b樣品中的糖含量為99.31%（RSD＝0.55%，n＝3）。

2.5 對(duì)苯酚-硫酸法結(jié)合校正因子法合理性的驗(yàn)證

本試驗(yàn)以與黨參多糖CPP1b組成相同的混合單糖對(duì)照品對(duì)苯酚-硫酸法結(jié)合校正因子法的合理性進(jìn)行驗(yàn)證。

與黨參多糖CPP1b組成相同的混合單糖對(duì)照品的制備：根據(jù)黨參多糖CPP1b的單糖組成及比例，分別精密稱取Rha、Ara、Gal、GalA 0.83、0.40、0.43、8.34 mg，用水定容于同一100 mL量瓶中，即得總質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的混合單糖對(duì)照品溶液。

精密量取上述混合單糖對(duì)照品溶液0.5 mL于試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，平行制備3份，在經(jīng)優(yōu)化的苯酚-硫酸法測(cè)定條件下，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，自“加入5%苯酚溶液”起進(jìn)行余下操作，測(cè)定吸光度，根據(jù)表3中GalAGlc質(zhì)量比為0-100%時(shí)的回歸方程計(jì)算黨參多糖CPP1b的質(zhì)量濃度（c），并按“2.4”項(xiàng)下公式（2）計(jì)算其糖含量，結(jié)果為103.47%（RSD＝0.50%，n＝3）。表明上述苯酚-硫酸法結(jié)合校正因子法具有合理性。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1”項(xiàng)下黨參多糖CPP1b供試品溶液（質(zhì)量濃度0.100 mg/mL）0.5 mL于試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，平行制備6份，在經(jīng)優(yōu)化的苯酚-硫酸法測(cè)定條件下，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，自“加入5%苯酚溶液”起進(jìn)行余下操作，測(cè)定吸光度。結(jié)果，其吸光度的RSD＝0.21%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取黨參多糖CPP1b供試品溶液（0.100 mg/mL）0.5 mL于試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，在經(jīng)優(yōu)化的苯酚-硫酸法測(cè)定條件下，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，自“加入5%苯酚溶液”起進(jìn)行余下操作，分別于室溫放置0、0.5、1、2、3、4 h時(shí)測(cè)定吸光度。結(jié)果，其吸光度的RSD＝0.52%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取黨參多糖CPP1b供試品溶液（0.100 mg/mL）0.5 mL于試管中，加入“2.1”項(xiàng)下GalA對(duì)照品溶液（0.101 mg/mL）0.5 mL，加水補(bǔ)至2.0 mL，在經(jīng)優(yōu)化的苯酚-硫酸法測(cè)定條件下，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，自“加入5%苯酚溶液”起進(jìn)行余下操作，測(cè)定吸光度，根據(jù)表3中GalA-Glc質(zhì)量比為0-100%時(shí)的回歸方程，按照公式（2）加校正因子計(jì)算糖含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 5 Results of recovery tests（n＝6）

3 討論

苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量的原理是：多糖或寡糖被濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫迅速水解，產(chǎn)生單糖并迅速脫水形成糠醛衍生物，該衍生物在強(qiáng)酸條件下與苯酚起顯色反應(yīng)，生成橙黃色物質(zhì)，且該衍生物在490 nm波長處的吸光度值與其質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，從而可用光電比色法測(cè)定其含量[8]。其中，在形成糠醛衍生物的反應(yīng)中，五碳糖和甲基五碳糖較六碳糖容易發(fā)生反應(yīng)；而糖醛酸則需先脫羧，再形成糠醛衍生物[7]，且糖醛酸不能完全轉(zhuǎn)化成糠醛衍生物[8]。其原理如圖1所示。

圖1 苯酚-硫酸法測(cè)定糖含量的原理Fig 1 Principle of phenol-sulfuric acid method

黨參多糖CPP1b純度為98.67%，糖含量為30.96%，分子量為1.45×105Da，單糖組成及質(zhì)量比為：Rha∶Ara∶ Gal∶GalA＝0.25∶0.12∶0.13∶2.51，其基本的糖鏈接單元如圖2所示。

圖2 黨參多糖CPP1b基本的糖鏈接單元Fig 2 Sugar link unit of C.pilosula polysaccharides CPP1b

而采用苯酚-硫酸法，單純以某一種中性單糖（Glc）為對(duì)照品測(cè)定類似于黨參多糖CPP1b的含GalA的酸性雜多糖中的總糖含量時(shí)，因GalA與中性單糖在測(cè)定過程中的吸光系數(shù)不同，其測(cè)定值與實(shí)際值必然會(huì)存在一定的偏差。考慮到GalA在形成糠醛衍生物前需要先脫羧且不能完全轉(zhuǎn)化成糠醛衍生物，故采用苯酚-硫酸法以Glc為對(duì)照品測(cè)定黨參多糖CPP1b中的糖含量時(shí)測(cè)定值會(huì)較實(shí)際值偏低?；诖?，本試驗(yàn)結(jié)合采用了校正因子法[9-11]，通過計(jì)算黨參多糖CPP1b對(duì)Glc的校正因子，對(duì)樣品中的糖含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正，避免了以Glc作為對(duì)照品所引起的系統(tǒng)誤差，且繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線簡便，結(jié)果較準(zhǔn)確、可靠。

綜上所述，本試驗(yàn)建立了一種基于苯酚-硫酸法結(jié)合校正因子法的可快速、準(zhǔn)確測(cè)定含GalA的多糖中糖含量的方法。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明方法合理，糖含量測(cè)定值與實(shí)際值很接近；方法學(xué)考察結(jié)果表明本方法精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均較好。這種求算校正因子的思路適用于大多數(shù)含不同比例糖醛酸的樣品，但不同的樣品校正因子需要視具體情況進(jìn)行調(diào)整。

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Content Determination of Saccharide in Polysaccharides Containing Galacturonic Acid by Phenol-sulfuric Acid Method Combined with Calibration Factor Method

BAI Ruibin1，MA Yuling1，ZHANG Pei1，WANG Yanping1，LI Yingdong2，HU Fangdi1（1.School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.The Affiliated Hospital of Gansu University of TCM，Lanzhou 730000，China）

R927.2

A

1001-0408（2017）21-2974-05

2016-07-31

2017-06-15）

（編輯：周 箐）

甘肅中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目（No.GZK-2014-13、GZK-2015-19）；甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（No.1504KFCA010）；蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014-2-30）

＊碩士研究生。研究方向：多糖結(jié)構(gòu)分析及活性研究。E-mail：bairb12@lzu.edu.cn

#通信作者：教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥成分分離分析及中藥新藥研究。E-mail：hufd@lzu.edu.cn

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.26