UPLC-MS/MS法同時測定復方血栓通膠囊中9種成分的含量Δ

孫 志，胡玉榮，左莉華，周 霖，姜曉芳，劉 新，呂曉景，包曉悅，康 建，張曉堅#（.鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部，鄭州 45005；.鄭州大學藥學院，鄭州 45000）

·藥物分析與檢定·

UPLC-MS/MS法同時測定復方血栓通膠囊中9種成分的含量Δ

孫 志1＊，胡玉榮2，左莉華1，周 霖1，姜曉芳1，劉 新1，呂曉景1，包曉悅1，康 建1，張曉堅1#（1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部，鄭州 450052；2.鄭州大學藥學院，鄭州 450001）

目的：建立同時測定復方血栓通膠囊中丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA和熊果酸含量的方法。方法：采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18，流動相為乙腈-0.1%甲酸（梯度洗脫），流速為0.2 mL/min，柱溫為40℃，進樣器溫度為10℃，分析時間為7 min，進樣量為5μL；離子化模式為電噴霧電離，離子源溫度為150℃，毛細管電壓為3.5 kV，錐孔氣流量為50 L/h，脫溶劑氣溫為350℃，脫溶劑氣流量為650 L/h，霧化氣壓力為7×105Pa，工作模式為正、負離子結(jié)合的多反應(yīng)監(jiān)測模式。結(jié)果：丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA和熊果酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為10.0～100.0 μg/mL（r＝0.999 8）、0.1～1.0 μg/mL（r＝0.999 8）、4.0～40.0 μg/mL（r＝0.999 9）、10.0～100.0 μg/mL（r＝0.999 9）、15.0～150.0 μg/mL（r＝0.999 7）、8.0～80.0 μg/mL（r＝0.999 8）、10.0～100.0 μg/mL（r＝0.999 7）、50.0～500.0 μg/mL（r＝0.999 7）、6.0～60.0 μg/mL（r＝0.999 8）；定量限分別為40.0、9.6、38.0、88.0、130.0、39.0、4.4、3.2、10.0 ng/mL，檢測限分別為12.0、3.0、11.0、26.0、39.0、12.0、1.3、1.0、3.0 ng/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜3%；加樣回收率分別為97.34%～103.20%（RSD＝2.19%，n＝6）、97.22%～102.39%（RSD＝2.03%，n＝6）、98.51%～101.70%（RSD＝1.32%，n＝6）、97.86%～102.49%（RSD＝2.09%，n＝6）、96.75%～103.12%（RSD＝2.36%，n＝6）、98.43%～101.65%（RSD＝1.25%，n＝6）、97.59%～101.50%（RSD＝1.50%，n＝6）、96.45%～102.88%（RSD＝2.58%，n＝6）、97.02%～103.11%（RSD＝2.38%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡單、結(jié)果準確，可用于復方血栓通膠囊中9種成分含量的同時測定。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；復方血栓通膠囊；含量測定；丹參素；咖啡酸；迷迭香酸；丹酚酸B；丹酚酸A；丹參酮Ⅰ；隱丹參酮；丹參酮ⅡA；熊果酸

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of tanshinol，caffeic acid，rosmarinic，salvianolic acid B，salvianolic acid A，tanshinoneⅠ，cryptotanshinone，tanshinoneⅡA and ursolic acid in Compound xueshuantong capsules.METHODS：UPLC-MS/MS method was adopted.The determination was performed on ACQUITY UPLC?BEH C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%formic acid（gradient elution）at the flow rate of 0.2 mL/min.The column temperature was 40℃，and the temperature of injector was 10℃.Analysis time was 7 min，and sample size was 5μL.The electrospray ionization source（ESI）was used；ion source temperature was 150℃；capillary voltage was 3.5 kV；cone flow was 50 L/h；desolvation temperature was 350℃；desolvation gas flow was 650 L/h；nebuliser pressure was 7×105Pa；ion monitoring and multiple reaction monitoring（MRM）was performed.RESULTS：The linear ranges of tanshinol，caffeic acid，rosmarinic，salvianolic acid B，salvianolic acid A，tanshinoneⅠ，cryptotanshinone，tanshinoneⅡA and ursolic acid were 10.0-100.0 μg/mL（r＝0.999 8），0.1-1.0 μg/mL（r＝0.999 8），4.0-40.0 μg/mL（r＝0.999 9），10.0-100.0 μg/mL（r＝0.999 9），15.0-150.0 μg/mL（r＝0.999 7），8.0-80.0 μg/mL（r＝0.999 8），10.0-100.0 μg/mL（r＝0.999 7），50.0-500.0 μg/mL（r＝0.999 7）and 6.0-60.0 μg/mL（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantitation were 40.0，9.6，38.0，88.0，130.0，39.0，4.4，3.2 and 10.0 ng/mL，separately.The limits of detection were 12.0，3.0，11.0，26.0，39.0，12.0，1.3，1.0 and 3.0 ng/mL，respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 3%.The recoveries were 97.34%-103.20%（RSD＝2.19%，n＝6），97.22%-102.39%（RSD＝2.03%，n＝6），98.51%-101.70%（RSD＝1.32%，n＝6），97.86%-102.49%（RSD＝2.09%，n＝6），96.75%-103.12%（RSD＝2.36%，n＝6），98.43%-101.65%（RSD＝1.25%，n＝6），97.59%-101.50%（RSD＝1.50%，n＝6），96.45%-102.88%（RSD＝2.58%，n＝6），97.02%-103.11%（RSD＝2.38%，n＝6），separately.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and can be used for simultaneous determination of 9 components in Compound xueshuantong capsules.

KEYWORDSUPLC-MS/MS；Compound xueshuantong capsules；Content determination；Tanshinol；Caffeic acid；Rosmarinic；Salvianolic acid B；Salvianolic acid A；TanshinoneⅠ；Cryptotanshinone；TanshinoneⅡA；Ursolic acid

復方血栓通膠囊是由三七、丹參、玄參和黃芪組成的純中藥復方制劑[1]，具有活血化瘀、益氣養(yǎng)陰之功效，主要用于血瘀兼氣陰兩虛導致的穩(wěn)定型心絞痛[2-4]和視網(wǎng)膜靜脈阻塞[5-8]等的治療。該制劑收載于2015年版《中國藥典》（一部）[9]，采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定。該方法測定的成分較少，色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合，對HPLC儀有損害。因此，本課題組采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）建立了同時測定復方血栓通膠囊中丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、熊果酸含量的方法[10-12]，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLCⅠ-Class型UPLC儀，包括流通針式進樣器、masslynx 4.1色譜工作站（美國Waters公司）；Xevo TQ-D型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；AL104型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BX7200HP型臺式超聲波清洗器（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，功率：400 W，頻率：40 kHz）；Master-E型超純水機（上海和泰儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復方血栓通膠囊（廣東某公司，批號：150410、150411、151012、151129、151203、160203、160208、160302、160414、160417，規(guī)格：0.5 g/粒）；丹參素對照品（批號：15082714，純度：99.99%）、咖啡酸對照品（批號：15090803）、迷迭香酸對照品（批號：15082904）、丹酚酸B對照品（批號：15081916）、丹酚酸A對照品（批號：16012810）、丹參酮Ⅰ對照品（批號：16030210）、隱丹參酮對照品（批號：16022403）、丹參酮ⅡA對照品（批號：15092512）、熊果酸對照品（批號：15082905）均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均為99.99%；甲醇、甲酸、乙腈為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～2 min，5%→28%A；2～4 min，28%→70%A；4～7 min，70%→90%A）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40℃；進樣器溫度：10℃；分析時間：7 min；進樣量：5μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子化模式：電噴霧電離；離子源溫度：150℃；毛細管電壓：3.5 kV；錐孔氣流量：50 L/h；脫溶劑氣溫：350℃；脫溶劑氣流量：650 L/h；霧化氣壓力：7×105Pa；母離子掃描范圍：m/z 80～1 200。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 主要質(zhì)譜參數(shù)Tab 1 Main mass parameters

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、熊果酸對照品各適量，精密稱定，加甲醇-水（1∶1，V/V）制備質(zhì)量濃度分別為2、0.2、2、2、2、2、2、5、2 mg/mL的單一對照品貯備液；分別精密量取上述單一對照品貯備液各500、50、200、500、750、400、500、1 000、300 μL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇-水（1∶1，V/V）定容，搖勻，制備成上述待測成分的質(zhì)量濃度分別為100.0、1.0、40.0、100.0、150.0、80.0、100.0、500.0、60.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品內(nèi)容物約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇-水（1∶1，V/V）20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇-水（1∶1，V/V）補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白對照溶液 取空白輔料適量，按“2.2.2”項下方法制備空白對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各適量，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄提取離子流色譜（EIC），詳見圖1。由圖1可知，在該試驗條件下，待測成分在混合對照品及供試品的EIC圖中保留時間一致，理論板數(shù)均＞5 000；空白對照EIC圖在相同保留時間內(nèi)無干擾峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，輔料對測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液1 000、800、600、400、200、100 μL，分別置于1 mL量瓶中，加甲醇-水（1∶1，V/V）定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子響應(yīng)強度。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標，離子響應(yīng)強度（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

圖1 提取離子流圖Fig1 Extracted ion chromatogram

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear range

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結(jié)果，丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、熊果酸的LOQ分別為40.0、9.6、38.0、88.0、130.0、39.0、4.4、3.2、10.0 ng/mL；LOD分別為12.0、3.0、11.0、26.0、39.0、12.0、1.3、1.0、3.0 ng/mL。

2.6 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下試驗條件連續(xù)進樣測定6次，記錄離子響應(yīng)強度。結(jié)果，丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、熊果酸離子響應(yīng)強度的RSD分別為1.46%、1.94%、1.43%、1.89%、1.21%、2.21%、0.75%、1.46%、1.01%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密量取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：150410）適量，分別于室溫下放置0、2、6、10、12、24 h時，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子響應(yīng)強度。結(jié)果，丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、熊果酸離子響應(yīng)強度的RSD分別為1.06%、1.32%、1.23%、2.61%、1.35%、2.38%、1.12%、0.88%、1.57%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

精密量取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：150410）適量，共6份，按“2.1”項下試驗條件進樣測定，計算含量并記錄離子響應(yīng)強度。結(jié)果，丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、熊果酸的含量平均值分別為1.170、0.013、0.403、1.076、0.832、0.581、0.418、2.450、0.569 mg/g，RSD分別為1.68%、1.30%、2.81%、2.77%、1.55%、2.29%、2.94%、1.24%、1.97%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：150410）內(nèi)容物約0.5 g，共6份，精密稱定，各置于10 mL量瓶中，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子響應(yīng)強度并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.10 樣品含量測定

取10批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下試驗條件進樣測定，記錄離子響應(yīng)強度并計算樣品含量，結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery tests（n＝6）

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 提取溶劑和超聲時間的選擇

本試驗分別考察了不同提取溶劑[甲醇、甲醇-水（4∶1，1∶1，3∶7，V/V）]和超聲時間（20、30、45、60 min）對待測成分溶解性和提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇甲醇-水（1∶1，V/V）為提取溶劑，超聲處理時間為30 min時，待測成分的響應(yīng)好，提取較為完全，無重復析出現(xiàn)象，且溶劑效應(yīng)不明顯，因此選擇上述條件進行試驗。

3.2 流動相的選擇

本試驗考察了不同比例的甲醇-水、甲醇-甲酸和乙腈-甲酸作為流動相系統(tǒng)，通過比較待測成分在不同流動相中的分離效果，選擇合適的流動相。結(jié)果，乙腈-0.1%甲酸作為流動相進行梯度洗脫時，待測成分的分離效果最佳，色譜峰峰形較好，相鄰峰之間均能達到基線分離，因此選擇乙腈-0.1%甲酸作為本試驗的流動相。

3.3 工作模式的選擇

本試驗在優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA在正離子模式下響應(yīng)較好，其他成分在負離子模式下響應(yīng)較好；另外，由于熊果酸的碰撞能過高，且不易得到特征離子，故通過比對熊果酸對照品的保留時間和檢測離子，采用離子監(jiān)測模式，從而實現(xiàn)對樣品中熊果酸成分的定性和定量分析，其他成分采用多反應(yīng)監(jiān)測模式可滿足檢測要求。因此，本試驗采用了正、負離子結(jié)合的多模式檢測方式進行采集。

綜上所述，本方法操作簡單、結(jié)果準確，可用于復方血栓通膠囊中9種成分含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 9 Components in Compound Xueshuantong Capsules by UPLC-MS/MS

SUN Zhi1，HU Yurong2，ZUO Lihua1，ZHOU Lin1，JIANG Xiaofang1，LIU Xin1，LYU Xiaojing1，BAO Xiaoyue1，KANG Jian1，ZHANG Xiaojian1（1.Dept.of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2.College of Pharmacy，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China）

R917

A

1001-0408（2017）21-2959-05

2016-12-30

2017-04-22）

（編輯：劉 柳）

國家自然科學基金資助項目（No.81272563）；鄭州大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)青年創(chuàng)新基金項目

＊主管藥師，博士。研究方向：質(zhì)譜分析和中藥質(zhì)量控制。電話：0371-66862570。E-mail：sunzhi2013@163.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學。電話：0371-66862570。E-mail：zhangxiaojian_yxb@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.21.22