委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Snea253殺線蟲活性化合物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

譚卓 　朱峰 　朱曉峰 　楊傳旭 　王媛媛 　段玉璽 　劉曉宇　+陳立杰

摘要：為研究委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）Snea253發(fā)酵液中具有殺線蟲活性的脂溶性化學(xué)成分，利用薄層層析、柱層析、高效液相色譜等技術(shù)對(duì)其活性成分進(jìn)行分離與純化，以南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲為靶標(biāo)進(jìn)行活性跟蹤，通過HRMS、1H-NMR、13C-NMR等現(xiàn)代波譜技術(shù)，鑒定其結(jié)構(gòu)為鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，簡(jiǎn)稱DBP）。進(jìn)一步檢測(cè)DBP對(duì)9種植物病原真菌和3種細(xì)菌的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，該化合物對(duì)粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）也具有抑制作用。

關(guān)鍵詞：委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Snea253；鄰苯二甲酸二丁酯；結(jié)構(gòu)解析；南方根結(jié)線蟲；粉紅聚端孢菌；巨大芽孢桿菌

中圖分類號(hào)： S432.4+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0081-04[HS）][HT9.SS]

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）是我國(guó)乃至世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上影響最大的一類線蟲病害，嚴(yán)重影響蔬菜、水果和其他各種農(nóng)林作物的生產(chǎn)[1]。目前針對(duì)線蟲病害的高效化學(xué)農(nóng)藥如涕滅威、溴甲烷等因環(huán)境安全問題陸續(xù)被禁用或被限制使用，因此尋找替代高效低毒、低殘留的有效殺線蟲劑成為當(dāng)今世界的研究熱點(diǎn)。放線菌中以鏈霉菌屬產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)最多，如阿維菌素是灰色鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[2]，已被證明具有高效廣譜殺線蟲活性。尼可霉素是從唐德鏈霉菌（St.tendae）的發(fā)酵液中分離的一種核苷肽基抗生素[3]，含有20多個(gè)組分，很多組分有活性，可以有效防治線蟲，且對(duì)動(dòng)物、蜜蜂和植物安全。梅嶺霉素是由南昌鏈霉菌（St.nanchangensis）產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，與阿維菌素母核一致[4]，具有廣譜殺蟲活性，尤其對(duì)小桿線蟲具有非常好的活性，只需要5 mg/L即可達(dá)100%的致死率[5]。

委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）Snea253菌株（ZL200810010465.X）是本研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)的高效殺線蟲菌株，其代謝物對(duì)大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines）、南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、北方根結(jié)線蟲（M. hapla）的二齡幼蟲均具有較高的生物活性[6-7]。李玲玉等通過萃取操作將Snea253的發(fā)酵液分為水溶性和脂溶性2部分，并從水溶性部分中分離純化得到具有殺線蟲活性的氨基糖類化合物[8]。本研究采用薄層層析、柱層析、高效液相色譜等技術(shù)從Snea253發(fā)酵液中分離純化具有殺線蟲活性的脂溶性化合物，通過HRMS、1H NMR、13C NMR等現(xiàn)代波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，并進(jìn)一步檢測(cè)該化合物對(duì)農(nóng)業(yè)常見致病菌的抑制活性，為該菌株的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定理論研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試菌株

委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（S.venezuelae）Snea253菌株，已經(jīng)獲得國(guó)家發(fā)明專利授權(quán)（ZL200810010465.X）[6]。由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲研究所提供。

1.1.2供試病原菌

真菌：粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄腐鐮孢（Fusarium solani）、白頭翁葉斑病菌（Ascochyta anemones）、人參黑斑病菌（Alternaria panax）、番茄早疫病菌（Alternaia solani）、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、向日葵菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）， 均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)[LM]植物保護(hù)學(xué)院真菌課題組提供。

細(xì)菌：惡臭假單孢桿菌（Pseudomonas putida）、叢毛單胞菌（Comamonas terrigena）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），均由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲研究所提供。

1.1.3培養(yǎng)基

高氏一號(hào)培養(yǎng)基（可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO3 1.0 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂15.0 g、純凈水1 000 mL，pH值7.1～7.3）；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂15.0 g、純凈水1 000 mL） ；NA培養(yǎng)基（牛肉膏3 g、蛋白胨5 g、酵母浸膏1 g、瓊脂20 g、蔗糖10 g、蒸餾水1 000 mL，pH值=7.0）

1.1.4主要儀器與試劑

發(fā)酵罐GUGS-50（鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限公司）；分析型高效液相色譜系統(tǒng)：Waters 600 Controller高效液相色譜儀，以溶劑峰為內(nèi)標(biāo)；Waters 2487紫外檢測(cè)器；Bruker Avance 600 MHz核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）。

柱層析硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司）、甲醇為色譜級(jí)（沈陽市新光化工廠）、石油醚和乙酸乙酯等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1Snea253發(fā)酵液的制備

種子液制備：將Snea253菌株接種于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫箱培養(yǎng)5 d，而后接種于高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng) 48 h，制備種子液。

發(fā)酵液的制備：20 mL種子液接種于裝液量35 L高氏一號(hào)液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，于28 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng) 7 d。

1.2.2殺線蟲活性物質(zhì)的分離

發(fā)酵液預(yù)處理：35 L Snea253發(fā)酵液，經(jīng)10 000 r/min離心，去除菌絲體，上清液在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/5，向其中加入5倍體積的無水乙醇，充分?jǐn)嚢韬笾糜?4 ℃冰箱內(nèi)靜止48 h，濾除沉淀取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。所得濃縮液經(jīng)乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)層，加入無水硫酸鈉，干燥過夜，抽濾除去無水硫酸鈉，并用乙酸乙酯充分洗滌，將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑獲得脂溶性粗提物。

活性組分分離：將粗提物用少量乙酸乙酯溶解經(jīng)硅膠柱層析分離（石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)），薄層色譜（thin layer chromatography，簡(jiǎn)稱TLC）檢測(cè)并合并，所得流分經(jīng)減壓濃縮后測(cè)定活性。經(jīng)柱層析獲得具有殺線蟲活性的流分，經(jīng)TLC檢測(cè)，斑點(diǎn)少且各斑點(diǎn)遷移率相差較大，故采用制備型薄層層析進(jìn)一步分離純化，展開劑為石油醚 ∶[KG-*3]乙酸乙酯=10 ∶[KG-*3]1。將分離所得組分置于-20 ℃保存?zhèn)溆?，進(jìn)行活性檢測(cè)。

1.2.3化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

采用高分辨質(zhì)譜（high-resolution mass spectrometer，簡(jiǎn)稱HRMS）和核磁共振波譜技術(shù)，對(duì)Snea 253殺線蟲活性組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

HRMS工作條件：掃描模式是正離子模式，m/z掃描范圍為50～3 000，毛細(xì)管電壓為4 500 V，霧化器壓力為 30 000 Pa，干燥器溫度為180 ℃，流速為4.0 L/min。

核磁共振工作條件：樣品用三氯甲烷溶解，在Bruker Avance 600 MHz儀器上進(jìn)行掃描，測(cè)定氫譜和碳譜，測(cè)試溫度為25 ℃，以溶劑峰為內(nèi)標(biāo)，1H-NMR譜測(cè)試譜寬為 12 335.526 Hz，13C-NMR譜測(cè)試譜寬為39 062.500 Hz。

1.2.4活性組分對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的活性檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取50 mg活性組分（Snea253-Ⅰ-1），加入0.8 mL甲醇，充分溶解后加入0.2 mL吐溫80獲得濃度為50 mg/mL母液，用無菌水將母液分別稀釋為濃度1～5 mg/mL等5個(gè)梯度的藥液，測(cè)定其對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的致死率和致死中量LC50。取潔凈滅菌的貝氏小皿，加入20條南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲，再向其中滴加300 μL不同濃度的藥液混勻。以 1 mL 甲醇與吐溫80（4 ∶[KG-*3]1）作為空白母液，依據(jù)對(duì)應(yīng)的測(cè)試液用無菌水稀釋作為對(duì)照（CK），每個(gè)處理重復(fù)3次。24 h鏡檢并統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算線蟲死亡率及校正死亡率。

[JZ]線蟲死亡率=[SX（]線蟲死亡數(shù)供試線蟲數(shù)[SX）]×100%。

校正死亡率=[SX（]處理線蟲死亡率-對(duì)照線蟲死亡率1-對(duì)照線蟲死亡率[SX）]×100%。

1.2.5Snea253活性組分的抑菌活性測(cè)定

抑制病原真菌的活性測(cè)定：采用菌絲生長(zhǎng)速率法和牛津杯法。準(zhǔn)確稱取 50 mg 活性組分，用0.8 mL甲醇充分溶解，再加入0.2 mL吐溫80配成母液，用無菌水稀釋成不同濃度的藥液，以甲醇加吐溫80的溶劑和蒸餾水為2個(gè)空白對(duì)照，分別加100 μL于牛津杯內(nèi)，重復(fù)3次，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72～96 h，觀測(cè)計(jì)量抑菌活性。

抑制細(xì)菌的活性測(cè)定采用劃線法和牛津杯法，操作方法同上。

2結(jié)果與分析

2.1Snea253發(fā)酵液活性物質(zhì)的分離純化

25 L Snea253發(fā)酵液經(jīng)離心、濃縮、醇沉、濃縮和萃取操作共獲得1.5 g褐色漿狀物，為脂溶性粗提物。粗提物經(jīng)硅膠柱層析獲得3個(gè)流分：Snea253-Ⅰ（300 mg）、Snea253-Ⅱ（450 mg）、Snea253-Ⅲ（400 mg），其中僅Snea253-Ⅰ具有殺線蟲活性。利用薄層層析技術(shù)分析Snea253-Ⅰ，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)高含量組分，遷移率分別為0.24、0.49，間距相差較大，適宜用制備薄層層析繼續(xù)分離純化?；钚越M分Sne253-Ⅰ通過制備薄層層析進(jìn)一步分離，得到2個(gè)組分Snea253-Ⅰ-1（150 mg）、Snea253-Ⅰ-2（45 mg）。結(jié)果表明，Snea253-Ⅰ-1有明顯的殺線蟲活性。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，簡(jiǎn)稱HPLC）檢測(cè)Snea253-Ⅰ-1純度可達(dá)95%以上（圖1），可以用于高分辨質(zhì)譜和核磁共振儀器的測(cè)定。

2.2Snea253殺線蟲活性組分Snea253-Ⅰ-1的結(jié)構(gòu)解析

2.2.1Snea253-Ⅰ-1的高分辨質(zhì)譜檢測(cè)

正離子模式下，Snea253-Ⅰ-1的高分辨質(zhì)譜中[M+Na]+離子峰的質(zhì)核比為301.141 1（理論值：301.141 6）。由此可初步確定，活性物質(zhì)Snea253-Ⅰ-1的分子式為C16H22O4，相對(duì)分子量為278 u（圖2）。

依據(jù)上述HRMS、1H-NMR、13C-NMR譜圖解析結(jié)果，經(jīng)分析確定Snea253-Ⅰ-1化合物的結(jié)構(gòu)為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP），結(jié)構(gòu)式如圖5所示。

2.3Snea253-Ⅰ-1活性檢測(cè)結(jié)果

2.3.1Snea253-Ⅰ-1殺線蟲活性的檢測(cè)結(jié)果

以南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲為靶標(biāo)進(jìn)行活性檢測(cè)，結(jié)果（圖6）表明，Snea253-Ⅰ-1（DBP）在各個(gè)濃度梯度下殺線蟲活性均高于粗提物和Snea253-Ⅰ。

2.3.2Snea253-Ⅰ-1的抑菌活性

活性組分的抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，在供試的9種病原真菌中，Snea253-Ⅰ-1只對(duì)粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）具有明顯的抑制作用，而對(duì)玉米大斑病菌等其他8種病菌均不具有明顯的抑制作用。在供試的3種細(xì)菌中，僅對(duì)巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）具有一定的抑制作用，而對(duì)其他2種細(xì)菌無效果。

3討論

生物農(nóng)藥的開發(fā)和應(yīng)用是未來農(nóng)業(yè)病害防治的趨勢(shì)。利用生物活體或其代謝物殺滅或抑制農(nóng)業(yè)有害生物，可以保護(hù)生態(tài)環(huán)境，減少人畜傷害，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[9-10]。近幾年，研究人員在微生物農(nóng)藥的研究與開發(fā)過程中，通過高通量篩選獲得了大量具有各種生物活性的微生物，它們的代謝物所表現(xiàn)的高活性通常是多種化合物的協(xié)同作用[11]，因此分離純化代謝物中的重要活性成分并明確化學(xué)結(jié)構(gòu)是生物農(nóng)藥開發(fā)和利用過程中的重點(diǎn)研究方向。它不僅可以指導(dǎo)代謝調(diào)控的方向，更重要的是可以從中發(fā)現(xiàn)新型農(nóng)藥合成的先導(dǎo)化合物，為綠色農(nóng)藥的開發(fā)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Snea253是一株高效殺線蟲菌株，我們期望通過基因組調(diào)控使其產(chǎn)生大量高活性物質(zhì)，提高活性和穩(wěn)定性，進(jìn)而將其開發(fā)為可商品化的生物農(nóng)藥。因此在前期的研究中，李玲玉等從Snea253發(fā)酵液的水溶性組分中分離純化得到具有殺線蟲活性的氨基糖類化合物，明確了水溶性組分中的有效成分[8]。而本研究側(cè)重于對(duì)脂溶性組分中有效成分的探索，首次從Snea253發(fā)酵液的脂溶性組分中分離并得到兼具殺線蟲活性和抑菌活性的化合物，該化合物的結(jié)構(gòu)通過高分辨質(zhì)譜儀（high resolution mass spectrum，簡(jiǎn)稱HRMS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，簡(jiǎn)稱NMR）[12]進(jìn)行鑒定，確定其結(jié)構(gòu)為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）。

目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了有關(guān)微生物產(chǎn)鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）的研究，Roy等研究表明，鏈霉菌（Streptomyces albidoflavus）321.2產(chǎn)生的DBP對(duì)G+細(xì)菌、G-細(xì)菌及Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus niger、Curvularia pallescens等真菌均具有較強(qiáng)的抑制作用[13]。馬桂珍等從海洋放線菌BM-2菌株分離的DBP對(duì)禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑制作用[14]。劉偉等從海洋小鏈霉菌DY2741的代謝產(chǎn)物中分離獲得的DBP對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）具有抑制作用[15]。研究結(jié)果表明，DBP本身有較好的抑菌活性。

本研究從Snea253中分離獲得的DBP不僅具有一定的抑菌活性同時(shí)還具有一定的殺線蟲活性，最重要的是其化學(xué)結(jié)構(gòu)具有衍生化和改變結(jié)構(gòu)的發(fā)展?jié)摿Γ瑸榛钚曰鶊F(tuán)的修飾提供很好的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行殺線蟲農(nóng)藥的合成。本研究結(jié)果為Snea253發(fā)酵液作為殺線蟲生物農(nóng)藥的研發(fā)奠定了化學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，相關(guān)的研究工作仍在進(jìn)行中。

參考文獻(xiàn)：

[1]段玉璽. 植物線蟲學(xué)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2011：1-3.

[2]Mrozik H，Eskola P，Linn B O，et al. Discovery of novel avermectins with unprecedented insecticidal activity[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，1989，45（3）：315-316.

[3]陳蔚，譚華榮. 尼可霉素（Nikkomycins）多組分結(jié)構(gòu)及其生物合成相關(guān)基因的研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2000，16（5）：548-550.

[4]孫宇輝，周秀芬，涂國(guó)全，等. 南昌鏈霉菌代謝產(chǎn)物與代謝工程研究現(xiàn)狀的回顧與展望[J]. 生命科學(xué)，2005，17（3）：207-210.

[5]左一鳴，王開運(yùn)，姜興印. 4種抗生素類殺蟲劑對(duì)小菜蛾不同齡期幼蟲的毒力和殺卵作用[J]. 農(nóng)藥，2004，43（1）：25-27.

[6]陳立杰，陳井生，段玉璽. 具毒殺植物線蟲活力的鏈霉菌的制備方法及其應(yīng)用：CN101225370[P]. 2008-07-23.

[7]陳井生，陳立杰，段玉璽，等. 放線菌Snea253代謝產(chǎn)物殺線蟲譜研究[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，26（3）：80-82.

[8]李玲玉，趙迪，劉曉宇，等. 放線菌Snea253代謝產(chǎn)物及寡糖對(duì)南方根結(jié)線蟲活性的影響[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2014，26（1）：117-122.

[9]何樹文，達(dá)世彩. 生物農(nóng)藥的國(guó)內(nèi)外發(fā)展動(dòng)態(tài)[J]. 湖北植保，2013（5）：60-62.[ZK）]

[10]張愛華，任志成，王壯，等. 不同生物源農(nóng)藥對(duì)西洋參主要病害的室內(nèi)抑菌活性及田間防效[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11）：197-200.

[11]劉長(zhǎng)令，李正名. 以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物開發(fā)的農(nóng)藥品種（Ⅰ）——?dú)⒕鷦J]. 農(nóng)藥，2003，42（11）：1-4.

[12]田靖，王玲. 核磁共振技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：12-15.

[13]Roy R N，Laskar S，Sen S K. Dibutyl phthalate the bioactive compound produced by Streptomyces albidoflavus 321.2[J]. Microbiological Research，2006，161（2）：121-126.

[14]馬桂珍，吳少杰，付泓潤(rùn)，等. 海洋放線菌BM-2菌株抗真菌活性物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)，2014，30（3）：393-401.

[15]劉偉，徐濤，蔡敬民，等. 海洋小鏈霉菌DY2741抗菌物質(zhì)的溶解性質(zhì)及分離純化[J]. 食品科學(xué)，2010，31（15）：177-180.