紅富士蘋果果實炭疽病病菌的分離與鑒定

陳汝+王金政+薛曉敏+王貴平

摘要：采集具有炭疽病癥狀的紅富士果實樣品進行組織分離、培養(yǎng)，獲得蘋果炭疽病菌株（編號為Acg1），采用形態(tài)學、分子生物學相結合的方法對其進行鑒定。根據(jù)分離菌株的菌落、分生孢子形態(tài)特征、rDNA-ITS序列分析將分離到的Acg1菌株鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

關鍵詞：蘋果；炭疽病菌；分離；鑒定；膠孢炭疽菌

中圖分類號： S436.611.1+2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0079-02[HS）][HT9.SS]

我國是世界蘋果生產(chǎn)第一大國[1]，紅富士是從普通富士的芽變中選育出的著色系的統(tǒng)稱，病害是制約蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因子。李保華等針對蘋果病害管理中存在的問題進行分析并對蘋果病害方面的研究進展進行綜述[2]。炭疽菌屬（Colletotrichum）是一類重要的植物病原真菌，可引起果實和葉子發(fā)生炭疽病害，并廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)[3]。近年來，炭疽菌屬分類研究一直是國內(nèi)外研究熱點，并且分子生物學技術廣泛應用于炭疽菌的分類研究[4-7]。研究表明，膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是蘋果生長期和貯藏期的主要侵染性病害，是造成產(chǎn)量和品質(zhì)損失的主要原因之一[8-10]。本研究從疑似炭疽病的紅富士發(fā)病果實上采用組織分離法獲得炭疽病源菌株，并采用rDNA-ITS序列分析和形態(tài)學相結合的方法對其進行鑒定，為蘋果炭疽病害的生物防控提供依據(jù)并奠定基礎。

1材料與方法

1.1樣品采集

具有炭疽病癥狀的紅富士果實樣品采自山東省果樹研究所天平湖基地紅富士蘋果園。

1.2病原菌的分離及形態(tài)特征觀察

采用組織分離法。先用70%乙醇表面消毒具有炭疽病癥狀的紅富士蘋果樣品，再用滅菌的解剖刀在病健交界處切下3 mm×5 mm的組織塊，用70%乙醇消毒1 min，再用01%氯化汞處理40 s，最后用無菌水沖洗干凈后置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)3 d，挑取單個菌落菌絲，轉(zhuǎn)移到新的PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)6 d，保存得到的純菌株，觀察并記錄菌落形態(tài)學特征，挑取分生孢子進行顯微形態(tài)觀測并記錄孢子的形狀大小。

1.3DNA提取和PCR擴增

真菌總DNA提取采用OMEGA公司試劑盒，提取的DNA溶解后于-20 ℃貯存?zhèn)溆?。以菌絲總DNA為模板，對ITS區(qū)進行擴增，以ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）[11]、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[12]為引物（由上海鉑尚生物技術有限公司合成）。

25 μL PCR反應體系：2.5 μL 10×PCR buffer（2.50 mmol/L，含Mg2+）、2.00 μL dNTPs（2.50 mmol/L）、050 μL ITS1（10.00 μmol/L）、0.50 μL ITS4（10.0 μmol/L）、0.75 μL DNA模板、0.25 μL（5.00 U/μL）Taq酶、18.50 μL滅菌水。

PCR擴增反應在BIO-RAD S1000TM PCR擴增儀上進行。PCR反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物由1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞（大腸桿菌DH5α），挑取陽性克隆送上海鉑尚生物技術有限公司進行測序。

1.4序列分析及構建系統(tǒng)進化樹

所得序列在國際核酸數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進行同源序列搜索。將分離菌株序列用Clustal X軟件[13]進行多個序列比對，并與GenBank中的相關序列進行同源性比較，然后用MEGA 4.1軟件中鄰位加入（neighbor-joining，簡稱NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結果與分析

2.1病原菌形態(tài)特征

經(jīng)組織分離，獲得病原物的純培養(yǎng)物（編號為Acg1），PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，菌落呈圓形生長，邊緣規(guī)則，氣生菌絲較發(fā)達，初期為白色，培養(yǎng)4～6 d后逐漸變?yōu)闇\灰色至灰黑色（圖1-A）。菌落在25 ℃時的生長速率是（11.90±0.61）mm/d。后期產(chǎn)生橘紅色分生孢子團，分生孢子長橢圓形，分生孢子表面光滑，無色，單胞，圓柱形或橢圓形，多數(shù)兩端鈍圓，大小為（17～22.6×4.0～6.0）μm（n=50）（圖1-B）。以上結果顯示，菌株形態(tài)特征與符丹丹等描述的蘋果炭疽菌的形態(tài)[14]基本一致。因此，紅富士蘋果的炭疽病原菌可以初步確定為炭疽菌屬。

2.2序列分析和構建系統(tǒng)進化樹

以純培養(yǎng)物總DNA為模板，ITS1、ITS4為引物，經(jīng)PCR擴增，獲得大小為584 bp的rDNA-ITS基因片段。Blast搜索結果顯示，該片段與炭疽菌的同源性高達99%以上。采用Clustal X軟件多序列比對后用MEGA 4.1軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示，從染病紅富士果實分離的炭疽病菌株與C. gloeosporioides（GenBank編號為EU552111）、C. gloeosporioides（GenBank編號為AJ301908）、C. gloeosporioides（GenBank編號為GU174543）、C. gloeosporioides（GenBank編號為KC122769）聚在同一分支上（圖2）。據(jù)此，將該炭疽病原菌3結論與討論

炭疽病是危害蘋果生產(chǎn)的重要病害，嚴重影響蘋果的產(chǎn)量及品質(zhì)。炭疽菌種類多、變異大，種間形態(tài)學特征近似，僅基于形態(tài)學的炭疽菌鑒定是不夠準確的。隨著分子生物學的發(fā)展，分子技術廣泛用于植物病原菌的分類與鑒定。近年來，rDNA核酸序列逐漸應用于真菌分類鑒定系統(tǒng)中，相對保守的18S、28S區(qū)域用于屬、種的分類鑒定，而變異性較大的ITS區(qū)域能反映出種間以及種內(nèi)不同個體間的差異。國內(nèi)學者依據(jù)病原菌形態(tài)特征及DNA序列分析的方法對蘋果[14]、藍莓[6]、茶樹[7]、甜柿[15]炭疽病菌進行鑒定，表明炭疽病菌在果樹上存在多樣性。

蘋果炭疽病菌主要包括膠孢刺盤孢[Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz.&Sacc.]和尖孢刺盤孢[Colletotrichum acutatum J. H. Simmonds]兩大復合類群中的物種[14]。本研究根據(jù)傳統(tǒng)的真菌形態(tài)學鑒定及病原菌rDNA-ITS序列的同源性與系統(tǒng)聚類分析結果，確定采集的具有炭疽病癥狀的紅富士果實樣品中分離得到的病原菌是膠孢刺盤孢。今后將對更多蘋果園中感病樣品進行分析，炭疽菌的準確鑒定能為炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]劉軍弟，霍學喜，韓明玉，等. 中國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢分析[J]. 北方園藝，2012（20）：164-168.

[2]李保華，王彩霞，董向麗. 我國蘋果主要病害研究進展與病害防治中的問題[J]. 植物保護，2013，39（5）：46-54.

[3]Ramdial H，Rampersad S N. Characterization of Colletotrichum spp. causing anthracnose of bell pepper（Capsicum annuum L.） in Trinidad[J]. Phytoparasitica，2015，43（1）：37-49.

[4]Weir B S，Johnston P R，Damm U. The Colletotrichum gloeosporioides species complex[J]. Studies in Mycology，2012，73：115-180.

[5]Cannon P F，Damm U，Johnston P R，et al. Colletotrichum-current status and future directions[J]. Studies in Mycology，2012，73：181-213

[6]徐成楠，王亞南，胡同樂，等. 藍莓炭疽病病原菌鑒定及致病性測定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2014，47（20）：3992-3998.

[7]劉威，葉乃興，陳玉森，等. 茶樹炭疽菌Colletotrichum fructicola的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 茶葉科學，2014，34（1）：95-104.

[8]Velho A C，Alaniz S，Casanova L，et al. New insights into the characterization of Colletotrichum species associated with apple diseases in southern Brazil and Uruguay[J]. Fungal Biology，2015，119（4）：229-244.

[9]周慧杰，郭玲. 蘋果炭疽病菌生物學特性研究[J]. 北方園藝，2012（22）：133-135.[ZK）]

[10]李娜，檀根甲，李增智. 蘋果炭疽菌低毒性菌株生物學特性的研究[J]. 激光生物學報，2008，17（1）：64-69.

[11]Gardes M，Bruns T D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and rusts[J]. Molecular Ecology，1993，2：113-118.

[12]White T J，Bruns T，Lee S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[M]. New York：Academic Press，1990：315-322.[ZK）][HT][HJ][HT][FL）]

[13]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al. The CLUSTAL-X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Res，1997，25：4876-4882.

[14]符丹丹，莊杰麗，張榮，等. 蘋果炭疽病病原菌ISSR-PCR反應體系的優(yōu)化及遺傳多樣性分析[J]. 植物保護學報，2013，40（3）：231-236.

[15]余賢美，侯長明，王潔，等. 次郞甜柿炭疽病菌的分離鑒定及其rDNA-ITS序列分析[J]. 經(jīng)濟林研究，2014，32（1）：45-50.