對(duì)茶樹(shù)炭疽病病菌具拮抗作用根際促生細(xì)菌的分離、篩選及鑒定

王國(guó)君 陳利軍 熊建偉 智亞楠

摘要：為了篩選出對(duì)茶樹(shù)炭疽病病菌具有拮抗作用的根際促生細(xì)菌，從河南省信陽(yáng)市茶園采集85份土樣，分離得到23株具有拮抗作用的細(xì)菌，利用平板對(duì)峙法篩選出對(duì)膠孢炭疽菌具有較強(qiáng)拮抗作用的7株細(xì)菌菌株，且其代謝產(chǎn)物對(duì)茶樹(shù)炭疽病病菌的平均抑制率達(dá)到53.20%。依據(jù)生理生化特征經(jīng)初步鑒定，7株拮抗菌株均隸屬于芽孢桿菌屬。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步構(gòu)建多功能植物根際促生菌廣適菌群提供菌株資源。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；炭疽病病菌；拮抗作用；根際促生細(xì)菌；篩選

中圖分類號(hào)： S435.711文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）11-0076-03[HS）][HT9.SS]

茶樹(shù)炭疽病是一種由真菌侵染引起的病害，是常見(jiàn)的茶樹(shù)葉部病害之一，在我國(guó)各產(chǎn)茶區(qū)均有發(fā)生，山區(qū)茶園尤為普遍[1]，該病發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致茶樹(shù)大量落葉，并造成茶樹(shù)樹(shù)勢(shì)衰落和茶葉產(chǎn)量與品質(zhì)降低，還影響翌年春季茶葉的產(chǎn)量。

目前，茶園主要利用化學(xué)藥劑防治茶樹(shù)炭疽病，但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)，并可造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等一系列問(wèn)題。在化肥農(nóng)藥零增長(zhǎng)的大背景下，如何開(kāi)發(fā)生物制劑來(lái)防治茶樹(shù)炭疽病尤為重要。植物根際促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，簡(jiǎn)稱PGPR）指生存于植物根際、根表，并能直接或間接地促進(jìn)或調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的微生物[2]，它能夠通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，目前人們普遍認(rèn)同的生物學(xué)功能主要有拮抗病原菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、改善根際微生態(tài)環(huán)境等[3]。國(guó)外研究人員已從水稻、小麥、玉米、甘蔗和棉花等作物根際分離篩選出許多高效、優(yōu)良的促生菌株，并且部分菌株已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化[4-6]。陳波等分離篩選出對(duì)櫻桃生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用的假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）[7]；史國(guó)英等分離得到1株對(duì)甘蔗具有促生作用的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為克雷伯氏菌屬（Klebsiella sp.）細(xì)菌[8]；周晨昊等研究發(fā)現(xiàn)，將篩選到的1株植物根際促生細(xì)菌JD37與蚯蚓糞混合對(duì)小白菜與蕹菜具有顯著的促生作用，其鮮質(zhì)量和產(chǎn)量均有明顯提高，還具有降低2種蔬菜中亞硝酸鹽含量的作用[9]。

本研究從茶樹(shù)根際土壤中分離PGPR，初步研究其對(duì)茶樹(shù)炭疽病病菌的拮抗作用，通過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化特性對(duì)其鑒定，為構(gòu)建高效廣適促生菌群提供菌株材料。

1材料與方法

1.1供試樣品

從河南省信陽(yáng)市浉河港鎮(zhèn)、董家河、震雷山、信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院等地的茶園中，共采集85份根際土壤樣品，放入自封袋，分別標(biāo)記為SHG、DJH、ZLS、XYNL，并加以編號(hào)，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2供試培養(yǎng)基[10]

PDA培養(yǎng)基：200 g去皮馬鈴薯、20 g葡萄糖、18 g瓊脂；NA培養(yǎng)基：5 g牛肉浸膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl、18 g瓊脂、pH值為7.2；NB培養(yǎng)液：3 g牛肉浸出膏、5 g蛋白胨、5 g NaCl、1 000 mL水、pH值為7.0～7.2。

1.3供試病原真菌

盤長(zhǎng)孢菌（Gloeosporium theae-sinesis Miyake）由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離和保存。

1.4細(xì)菌的分離和純化

稱取10 g土樣，加入裝有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，于120 r/min搖床上振蕩30 min，即為10-1稀釋液，取 1 mL 10-1 稀釋液加入盛有9 mL無(wú)菌水的試管中，即為10-2稀釋液，依此類推，用無(wú)菌水稀釋成10-3～10-7稀釋液，分別取5 μL涂布于3種固態(tài)培養(yǎng)基平板上，每個(gè)濃度重復(fù)3次，置于26～27 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～5 d后，挑取單菌落作為參試菌株。

1.5對(duì)茶樹(shù)炭疽病病原菌拮抗作用的測(cè)定

1.5.1[JP2]細(xì)菌菌株對(duì)茶樹(shù)炭疽病病原菌拮抗性測(cè)定

采用對(duì)峙生長(zhǎng)法測(cè)定茶樹(shù)根際細(xì)菌對(duì)膠孢炭疽菌的拮抗性。即在直徑為9 cm的PDA平板正中央接入直徑為5 mm的膠孢炭疽菌菌塊，同時(shí)在距平板中心2.5 cm處的4個(gè)點(diǎn)上分別接入1環(huán)目標(biāo)細(xì)菌菌落，對(duì)照不接篩選菌株，只接入培養(yǎng)基，于 27 ℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h，測(cè)量從茶樹(shù)根際土壤中篩選的細(xì)菌的菌落邊緣和茶樹(shù)炭疽病病原菌菌落邊緣之間的抑菌帶寬度，篩選出對(duì)茶樹(shù)炭疽病病原菌具有拮抗作用的菌株。同時(shí)觀察篩選菌的菌落大小和生長(zhǎng)速度，選出拮抗作用明顯的細(xì)菌。[JP]

1.5.2拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物對(duì)供試病原菌的抑制作用

將初篩的拮抗細(xì)菌于NB培養(yǎng)液中28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d，將發(fā)酵液以8 000 r/min離心15 min，取上清液，最后用孔徑為0.22 μm的濾膜過(guò)濾，每個(gè)處理重復(fù)3次。將2 mL無(wú)菌濾液和20 mL NA培養(yǎng)基混合均勻倒入培養(yǎng)皿，冷卻凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中央接入直徑為5 mm的供試病原菌菌塊，27 ℃下培養(yǎng)24 h。以直接培養(yǎng)的炭疽菌作為對(duì)照，用垂直十字法分別測(cè)量含測(cè)試菌發(fā)酵液條件下和不含發(fā)酵液條件下的病原菌菌塊直徑，用如下公式計(jì)算抑制率：

[JZ]抑制率=[SX（]對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑[SX）]×100%。

1.6拮抗菌株的初步鑒定

對(duì)拮抗菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應(yīng)、伏-普（V-P）反應(yīng)、檸檬酸鹽利用反應(yīng)、淀粉水解、厭氧性試驗(yàn)、接觸酶反應(yīng)，以及葡萄糖、蔗糖、甘露醇產(chǎn)酸等形態(tài)學(xué)及生理生化分析，對(duì)拮抗菌株進(jìn)行初步鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1不同樣品中分離的細(xì)菌菌株及拮抗菌株

從85份根際土壤樣品中分離細(xì)菌，對(duì)分離出的根際細(xì)菌根據(jù)其菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，按常規(guī)方法純化后保存，共獲得254株細(xì)菌菌株，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)具有拮抗作用的菌株23株，其中7株菌株對(duì)茶樹(shù)炭疽病病原菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。如表1所示，7株目標(biāo)拮抗菌株主要來(lái)自震雷山茶場(chǎng)、浉河港鎮(zhèn)何家寨茶場(chǎng)、董家河尖山茶場(chǎng)。菌株來(lái)源相對(duì)分散，相比較而言，化學(xué)防治較少的震雷山茶場(chǎng)分離得到的菌株較多，從側(cè)面反映化學(xué)殺菌劑的使用可能導(dǎo)致茶樹(shù)根際微生物種群中有益微生物的數(shù)量減少。另外，7株菌株均出自相對(duì)肥沃的土壤，這與孫海新等的研究結(jié)論[11]一致。從茶樹(shù)品種來(lái)看，4株菌株來(lái)源于福鼎大白茶、2株來(lái)源于龍井43、1株來(lái)源于白毫早，而福鼎大白茶在茶區(qū)種植面積較大，因此，不同茶樹(shù)品種對(duì)拮抗菌株是否存在一定的影響需要進(jìn)一步研究證明。

2.4拮抗細(xì)菌的鑒定

由表4可知，7株拮抗細(xì)菌革蘭氏染色反應(yīng)、芽孢染色反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P測(cè)定、檸檬酸鹽利用反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)性、淀粉水解反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、葡萄糖產(chǎn)酸、蔗糖產(chǎn)酸、甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)等均呈陽(yáng)性，厭氧性試驗(yàn)均呈陰性。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征觀察和生理生化反應(yīng)結(jié)果，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]和《芽孢桿菌屬》[13]，初步確定這7株菌株均屬于芽孢桿菌屬。

3結(jié)論與討論

目前，植物根際促生細(xì)菌的篩選利用及其促生機(jī)制的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)[14-15]。從本試驗(yàn)篩選的初步結(jié)果看，7株菌株代謝產(chǎn)物平均拮抗抑制率為53.20%，經(jīng)生理生化鑒定，7株菌株均為芽孢桿菌屬。雖然拮抗抑制率與申光輝等所篩選的拮抗菌株的拮抗抑制率[16]有差距，但是并不能簡(jiǎn)單認(rèn)為其生防效果不理想。因?yàn)檗卓棺饔弥皇谴偕?xì)菌作用中的一個(gè)方面，需要從多個(gè)方面綜合篩選方可成功開(kāi)發(fā)出生產(chǎn)中具有意義的微生物農(nóng)藥。另外，拮抗菌株在室內(nèi)和田間表現(xiàn)的穩(wěn)定性往往存在差異，有研究表明物理、化學(xué)、微生物種群等環(huán)境條件會(huì)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)造成影響，從而制約其促生效果[17]。因此，在室內(nèi)試驗(yàn)中拮抗效果不突出的菌株，并不意味著不具有開(kāi)發(fā)價(jià)值。要將所篩菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上用于防治植物病害，尤其是防治茶樹(shù)炭疽病還需進(jìn)一步通過(guò)田間試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，如果田間防治效果較好，那么對(duì)于其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)有效成分的分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定等都值得進(jìn)一步研究。另外，促生機(jī)制具有多樣性，能否將7株菌株構(gòu)建適應(yīng)不同環(huán)境要求的多功能菌群以共同發(fā)揮作用也需要進(jìn)一步研究。

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