陜西省水稻Wx基因種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

張羽 李小剛 王保軍 王業(yè)文 王俊義

摘要：稻米品質(zhì)與稻米中直鏈淀粉含量（AC）有關(guān)，而直鏈淀粉含量與蠟質(zhì)基因（Wx）的基因型有關(guān)，研究表明Wx基因第一內(nèi)含子的剪接效率決定直鏈淀粉含量。明確陜西省主要水稻種質(zhì)資源中Wx基因的基因型，可為水稻品質(zhì)育種提供依據(jù)。應(yīng)用CAPS法對112份陜西省水稻主要種質(zhì)資源Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位堿基G/T進行檢測，根據(jù)G/T堿基將112份供試材料的Wx基因分為GG、GT、TT等3種基因型。同時，按國標檢測3種不同G/T型37份稻米的直鏈淀粉含量及其他相關(guān)性狀。結(jié)果顯示，112份供試材料中有1份材料為GG型，約占1%；25份為GT型，占22%；86份材料為TT型，約占77%。說明Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位堿基G/T的多態(tài)性與AC含量有良好的對應(yīng)關(guān)系，與堊白粒率和堊白度有一定的對應(yīng)關(guān)系。

關(guān)鍵詞：陜西?。凰?；蠟質(zhì)基因（Wx）；基因型；剪接效率；支鏈淀粉含量；稻米品質(zhì)；育種

中圖分類號： S511.033文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0059-04[HS）][HT9.SS]

稻米品質(zhì)主要是指稻米的外觀品質(zhì)和蒸煮食用品質(zhì)，其中直鏈淀粉含量、糊化溫度、膠稠度、堊白度等是衡量稻米蒸煮食用品質(zhì)的主要指標，而直鏈淀粉含量則是稻米品質(zhì)優(yōu)劣的決定因素[1]。直鏈淀粉含量高的稻米較直鏈淀粉含量低的稻米硬，飯粒松散，脹性好。隨著人們生活水平的提高以及用途和地域的不同，人們對直鏈淀粉含量的要求也不盡相同，直鏈淀粉含量已經(jīng)成為水稻品質(zhì)育種的一個重要方面[2-8]。研究發(fā)現(xiàn)，蠟質(zhì)基因（Wx）編碼的結(jié)合在淀粉粒上的淀粉合成酶，是水稻中控制直鏈淀粉合成的主要基因，非糯性基因（Wx）對糯性基因（wx）表現(xiàn)為不完全顯性，存在較為明顯的劑量效應(yīng)，Wx基因序列由于SNP變異產(chǎn)生了一些復(fù)等位基因，如Wxa、Wxb、Wxop 和Wx-mq，其直鏈淀粉含量也因為SNP變異導(dǎo)致各不相同，Wxa的直鏈淀粉含量較高，Wxb、Wxop和Wx-mq的直鏈淀粉含量較低。在Wx的分子標記研究中，Bligh等報道利用和Wx基因緊密連鎖的微衛(wèi)星（CT）n標記進行Wx基因多態(tài)性檢測[9]。隨著對水稻蠟質(zhì)基因表達調(diào)控規(guī)律的深入研究，表明稻米中直鏈淀粉含量是由該品種蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子的剪接效率決定的，若蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子供體+1位是正常的堿基G，蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子能被正常剪接，水稻胚乳中就能產(chǎn)生較多的蠟質(zhì)基因成熟mRNA，淀粉合成酶的量就較多，胚乳中直鏈淀粉含量就高；反之，蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子供體+1位突變成T后，蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子利用別的剪接位點進行剪接，剪接效率低，胚乳中產(chǎn)生的蠟質(zhì)基因成熟mRNA的量較少，淀粉合成酶的量也較少，相應(yīng)的胚乳中直鏈淀粉含量也較低。Ayres等最早根據(jù)Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位的這種G/T多態(tài)性，設(shè)計了PCR-ACCI酶切法，即蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子供體+1位是G時，它能與旁鄰的堿基構(gòu)成ACCI的酶切識別序列AGGTATA，使含AGGTATA序列的擴增片段能被ACCI酶切，而含AGTTATA序列的不能被ACCI酶切[10]。隨后，很多研究人員對此結(jié)論進行了驗證和深入研究，充分證明Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位G/T多態(tài)性影響稻米直鏈淀粉含量[11-17]。本試驗通過CAPS方法對112份水稻樣品Wx的G/T多態(tài)性進行研究，同時利用國標法[18]對37份不同Wx基因型的米樣測定其直鏈淀粉含量及相關(guān)性狀，為陜西省稻米品質(zhì)育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為陜西省水稻研究所提供。

1.2方法

1.2.1基因組提取及PCR

水稻基因組DNA采用SDS法提取，并采用1%瓊脂糖凝膠檢測基因組DNA的質(zhì)量。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmol/L正反引物各 1 μL，DNA模板1 μL，反應(yīng)總體積30 μL，用ddH2O補足。反應(yīng)程序為：94.0 ℃預(yù)變性5 min；94.0 ℃變性50 s，55 ℃退火50 s，72.0 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72.0 ℃延伸10 min，4 ℃保存；8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，銀染法顯色拍照。

1.2.2引物設(shè)計

Wx基因G/T多態(tài)性利用Ayres等設(shè)計的酶切擴增多態(tài)性序列標記Wx484/W2R-ACCI酶切分析，上游引物為Wx484，序列為5′-CTTTGTCTATCTCAAGACAC-3′；下游引物為W2R，序列為5′-TTTCCAGCCCAACACCTTAC-3′。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，ACCI酶購自Thrmo Scientific。

1.2.3直鏈淀粉含量（AC）及其他性狀的測定

從供試的113份材料中隨機選取有3種基因型的材料37份，按照NY/T 593—2013《食用稻米品質(zhì)》標準進行糙米率、精米率、長寬比等性狀的計算。然后用旋風式粉碎磨（JFS-13A型）磨粉，再經(jīng)100目篩后放置烘箱內(nèi)經(jīng)60 ℃干燥過夜。準確稱取025 g淀粉小心放入50 mL 容量瓶，加入0.5 mL 95%乙醇，輕搖，使樣品濕潤分散。再加入 4.5 mL 1 mol/L NaOH 溶液，用堿液將瓶壁上黏附的樣品沖洗下去，然后沸水浴 10 min，冷卻至室溫，用超純水定容至50 mL，混勻后取其樣液 2.5 mL，加入已盛有半瓶蒸餾水的50 mL容量瓶中，再向容量瓶中加入0.5 mL 1 mol/L乙酸溶液，使樣品酸化，加0.75 mL碘試劑溶液（0.12 mol/L KI，0.008 mol/L I2），充分搖勻，用蒸餾水定容，靜置20 min，以0.09 mol/L NaOH溶液為空白對照，利用紫外分光光度計（752型）于620 nm 波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線回歸方程y=0.738 2x-0.036 7（r2=0.998 6，標準曲線由不同含量的直鏈淀粉按國標規(guī)定方法配置標樣測定產(chǎn)生）計算表觀直鏈淀粉含量，每個樣品3次重復(fù)，其平均值作為該樣品的AC含量。

2結(jié)果與分析

2.1供試材料Wx基因的G/T多態(tài)性

CAPS標記Wx484/Wx2R-ACCI檢測結(jié)果表明，112份材料中有86份材料基因為TT，約占總試材料的77%，酶切后只有1條257 bp的條帶；25份材料基因為GT，約占總試材料的22%，酶切后既有257 bp的片段，也有129、128 bp的片段；只有1份材料基因為GG，約占總試材料的1%，酶切后只有 128 bp 左右的片段。

2.2Wx基因G/T多態(tài)性與水稻恢保種類的關(guān)系

[JP2]112份供試材料中有76份恢復(fù)系材料，其中70份Wx基因型為TT，占92.11%，6份基因型為GT，占7.89%。有20份保持系材料，[JP3]其中4份基因型為TT，占20%，15份基因型為GT，占75%，1份基因型為GG，占5%。供試的恢復(fù)系材料中Wx基因型主要為TT，而保持系材料的Wx基因型主要為GT（表1）。[JP]

2.3Wx基因G/T多態(tài)性與其他性狀的關(guān)系

從3種基因型材料中隨機抽取37份材料進行相關(guān)性狀和直鏈淀粉含量測定，結(jié)果如表2所示。

37份材料的直鏈淀粉含量在9.3%～21.9%之間，其中基因型為GG和GT的材料直鏈淀粉含量在12.29%～2188%之間，基因型為TT的材料直鏈淀粉含量在9.26%～19.65%之間。從研究結(jié)果看，基因型為GT的直鏈淀粉含量較高，平均為18.64%，糙米率平均為76.69%，精米率平均為67.64%，整精米率平均為56.36%，米粒長寬比平均為2.79，堊白粒率平均為69.83%，堊白度平均為16.35%。而基因型為TT的材料直鏈淀粉含量較低，平均為13.81%，糙米率平均為77.22%，精米率平均為66.43%，整精米率平均為4665%，米粒長寬比平均為2.63，堊白粒率平均為22.57%，堊白度平均為799%。

3討論與結(jié)論

隨著人們生活水平的提高，對品質(zhì)要求越來越高，同時地處不同區(qū)域的人們由于生活習慣口味不同，對米質(zhì)要求也各不相同，另外不同的稻米加工對直鏈淀粉含量的要求也不一致。TT基因型的材料直鏈淀粉含量較低，GT基因型的材料直鏈淀粉含量較高，TT基因型的材料其堊白粒率和堊白度比GT基因型的材料低。供試的陜西省主要水稻種質(zhì)資源中保持系材料和恢復(fù)系材料占85.71%，其中恢復(fù)系材料的Wx基因型大部分為TT，而保持系材料的Wx基因型大部分為GT，因此雜交種Wx基因型可能為TT或GT，TT基因型的品種直鏈淀粉含量較低，黏性強，適口性好，GT基因型的品種直鏈淀粉含量較高，黏性弱，膨脹性好。由于Wx基因型與AC含量有良好的對應(yīng)關(guān)系，因此無需等種子成熟后測定AC含量，而在作物生長的任何時期可以根據(jù)育種需要，利用檢測Wx基因型來培育滿足要求的不同品種。由于供試材料中只有1份材料的Wx基因型是GG，其直鏈淀粉含量及其他所測性狀接近GG基因型材料。在長江上游秈稻種植區(qū)，科研人員在育種實踐中發(fā)現(xiàn)稻米品質(zhì)由碾米品質(zhì)、外觀品質(zhì)、食味品質(zhì)決定，其中直連淀粉含量是食味品質(zhì)的重要指標之一。目前使用[CM參考文獻：

[1]Yan C J，Tian Z X，F(xiàn)ang Y W，et al. Genetic analysis of starch paste viscosity parameters in glutinous rice （Oryza sativa L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2011，122（1）：63-76.

[2]蔡秀玲，劉巧泉，湯述翥，等. 用于篩選直鏈淀粉含量為中等的秈稻品種的分子標記[J]. 植物生理與分子生物學學報，2002，28（2）：137-144.

[3]周屹峰，趙霏，任三娟，等. 利用Wx基因功能性標記選育中等直鏈淀粉含量優(yōu)質(zhì)水稻保持系[J]. 浙江大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2010，36（6）：602-608.

[4]侯立恒，夏明元，戚華雄，等. 利用Wx基因分子標記輔助選擇技術(shù)培育中等直鏈淀粉含量的水稻恢復(fù)系[J]. 中國農(nóng)學通報，2009，25（14）：32-36.

[5]陳深廣，周屹峰，趙霏，等. 利用Wx和fgr基因雙功能性標記高效選育優(yōu)質(zhì)水稻保持系[J]. 中國水稻科學，2011，25（1）：31-36.

[6]劉燕清，強新濤，趙春芳，等. 水稻淀粉合成相關(guān)基因分子標記的篩選與利用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2015，31（3）：471-476.

[7]Frances H，Bligh J，Larkin P D，et al. Use of alternate splice sites in granule-bound starch synthase mRNA from low-amylose rice varieties[J]. Plant Molecular Biology，1998，38（3）：407-415.

[8]強新濤，趙春芳，趙凌，等. 秈稻栽培品種中淀粉合成相關(guān)基因的[CM（26*2]遺傳變異和群體結(jié)構(gòu)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2016，32（2）：[CM）][ZK）][HT][FL）]

[11]毛興學，肖昕，陳建偉，等. PCR一步法檢測水稻蠟質(zhì)基因第一內(nèi)含子剪接供體+1位堿基[J]. 中國水稻科學，2005，19（3）：285-287.

[12]萬映秀，鄧其明，王世全，等. 水稻W(wǎng)x基因的遺傳多態(tài)性及其與主要米質(zhì)指標的相關(guān)性分析[J]. 中國水稻科學，2006，20（6）：603-609.

[13]張婭麗，許明輝，曾亞文，等. 云南地方稻種Wx基因第一內(nèi)含子供體+1位堿基變異與直鏈淀粉含量的關(guān)系[J]. 中國水稻科學，2007，21（1）：20-24.

[14]Cai X L，Wang Z Y，Xing Y Y，et al. Aberrant splicing of intron 1 leads to the heterogeneous 5′ UTR and decreased expression of waxy gene in rice cultivars of intermediate amylose content[J]. The Plant Journal，1998，14（4）：459-465.

[15]欒麗，陳英，王興，等. 同源四倍體水稻秈型突變體Wx基因序列分析及特異識別分子標記的建立[J]. 遺傳，2008，30（2）：209-216.

[16]Hirano H Y，Eiguchi M，Sano Y. A single base change altered the regulation of the Waxy gene at the posttranscriptional level during the domestication of rice[J]. Molecular Biology and Evolution，1998，15（8）：978-987.

[17]Wang Z Y，Zheng F Q，Shen G Z，et al. The amylose content in rice endosperm is related to the posttranscriptional regulation of the Waxy gene[J]. Plant Journal，1995，7（4）：613-622.

[18]稻米直鏈淀粉含量的測定常規(guī)方法：ISO/TC 34 ISO 6647-2—2007[S].