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    龍爪槐SRAP—PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

    2017-08-12 18:36:25倪雅楠劉博
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年11期
    關(guān)鍵詞:正交試驗(yàn)

    倪雅楠+劉博

    摘要:以龍爪槐(Sophora japonica f. pendula Hort.)葉片為材料,采用L16(45)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),對SRAP-PCR反應(yīng)體系中的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,并確立適用于龍爪槐SRAP-PCR反應(yīng)的最佳體系。結(jié)果表明,龍爪槐SRAP-PCR反應(yīng)的最佳體系為反應(yīng)總體積12.5 μL,Taq酶0.10 U、Mg2+ 3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均為1.2 nmol/L、DNA 100 ng,其余體積用ddH2O補(bǔ)足。各因素水平變化對反應(yīng)體系的影響影響大小依次為引物、模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶。用35個(gè)龍爪槐樣品對優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證,均得到條帶清晰、多態(tài)性豐富的圖譜,證實(shí)了該體系的穩(wěn)定性。

    關(guān)鍵詞:龍爪槐;SRAP-PCR;正交試驗(yàn);反應(yīng)體系優(yōu)化

    中圖分類號: S687.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號:1002-1302(2017)11-0019-03

    相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence related aplified polymorphism,SRAP),是美國加州大學(xué)蔬菜作物系Li等在蕓薹屬(Brassica)中開發(fā)出的,利用1對獨(dú)特的引物設(shè)計(jì)方式實(shí)現(xiàn)對開放閱讀框架ORFs進(jìn)行擴(kuò)增的標(biāo)記[3],適合于植物的遺傳多樣性研究、比較基因組學(xué)、遺傳圖譜的構(gòu)建等領(lǐng)域研究。筆者首次采用SRAP技術(shù)對龍爪槐的遺傳多樣性進(jìn)行分析,因此,須要確定其SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系。

    正交試驗(yàn)?zāi)芫C合各因素及其相互作用,快速找到影響因素的最佳水平組合,不僅效率高,且結(jié)果穩(wěn)定可靠。正交試驗(yàn)已被廣泛應(yīng)用到菊花、荷花和番茄的優(yōu)化體系中,并已確定最佳的反應(yīng)體系[4-6]。

    1材料與方法

    1.1材料

    供試材料為采自北京市35株龍爪槐的嫩葉(表1),硅膠

    1.3.4龍爪槐SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系驗(yàn)證以35份龍爪槐的基因組DNA為模板,隨機(jī)選取2個(gè)SRAP引物組合ME1-EM7、ME8-EM8,按照上述擴(kuò)增及檢驗(yàn)方法,對優(yōu)化的龍爪槐SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行檢測。

    1.4數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

    采用Excel軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

    2結(jié)果與分析

    2.1龍爪槐SRAP-PCR反應(yīng)體系的確立

    2.1.1試驗(yàn)材料基因組DNA檢測部分試驗(yàn)材料的DNA瓊脂糖電泳檢測結(jié)果見圖1,DNA條帶清晰、完整,符合SRAP對DNA的要求。

    2.1.2正交試驗(yàn)結(jié)果分析根據(jù)正交試驗(yàn)表,每個(gè)處理重復(fù)3次,得到的電泳結(jié)果見圖2,采用不同的反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。第1、6、9、10、12、14、15、16組擴(kuò)增效果較差,條帶不清晰穩(wěn)定性差;2、11組重復(fù)性差,反應(yīng)體系彌散嚴(yán)重,條帶不清晰;4、5、7、8組擴(kuò)增效果較好,但2、3、5、7、8組條帶豐富性差。綜合以上分析,根據(jù)條帶豐富度、清晰度以及重復(fù)性等因素初步確定第4組為最佳反應(yīng)體系。

    2.2龍爪槐最佳SRAP-PCR反應(yīng)體系驗(yàn)證

    應(yīng)用上述篩選出的龍爪槐最佳反應(yīng)體系,選取2個(gè)引物組合ME1-EM7和ME8-EM8對35個(gè)龍爪槐樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果(圖3)顯示,隨機(jī)選取的這2個(gè)引物組合能應(yīng)用篩選得到的最佳體系擴(kuò)增出豐富的條帶,且圖譜條帶清晰、穩(wěn)定性好,證明該最佳體系可以應(yīng)用到龍爪槐基因組DNA的SRAP-PCR反應(yīng)中。

    3討論

    龍爪槐在我國具有悠久的栽培歷史,是園林造景中不可缺少的樹種,目前關(guān)于龍爪槐的研究僅局限于嫁接技術(shù)、蟲害防治方面[8-13],對于龍爪槐分子生物學(xué)方面的研究還未見報(bào)道,因此本研究旨在探究龍爪槐分子水平上的特征,評價(jià)龍爪槐的遺傳結(jié)構(gòu)和變異,為龍爪槐種質(zhì)資源的搜集、保存和利用提供理論依據(jù),并為龍爪槐的分子水平研究奠定一定的基礎(chǔ)。

    對PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化有單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)2種方法,單因素試驗(yàn)不能兼顧到各因素之間的相互作用,無法分析各組分不同水平對擴(kuò)增結(jié)果影響的差異顯著性,且單因素試驗(yàn)次數(shù)多,耗時(shí)耗力成本較高;正交試驗(yàn)與單因素試驗(yàn)相比節(jié)省試驗(yàn)時(shí)間,用較少的試驗(yàn)次數(shù)便可獲得可靠的試驗(yàn)結(jié)果,并能通過數(shù)據(jù)反映出各因素間的交互作用。本研究通過正交試驗(yàn)對影響SRAP-PCR的5個(gè)因素和4個(gè)水平進(jìn)行優(yōu)化和篩選,最終確定龍爪槐SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系為反應(yīng)總體積12.5 μL,Taq酶0.10 U、Mg2+ 3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均為1.2 nmol/L,DNA 100 ng,其余體積用ddH2O補(bǔ)足。

    反應(yīng)體系中的各個(gè)因素之間會產(chǎn)生相互作用,每種因素發(fā)生變化都可能影響擴(kuò)增的結(jié)果。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示,各個(gè)因素對龍爪槐SRAP-PCR的影響大小依次為引物、模板DNA、Mg2+、dNTPs、Taq酶。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),SRAP-PCR反應(yīng)體系針對不同物種的分析中,每個(gè)反應(yīng)因素對物種的影響程度均有所不同,因此SRAP-PCR反應(yīng)體系必須針對不同物種和試劑的差異對主要的影響因素進(jìn)行優(yōu)化,保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

    隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于植物的遺傳多樣性研究中[14]。陳興彬利用篩選出的多態(tài)性高、擴(kuò)增穩(wěn)定的7對引物對11個(gè)黑松群體進(jìn)行擴(kuò)增,共擴(kuò)增出73個(gè)條帶,其中59個(gè)多態(tài)性條帶,多態(tài)性條帶比率為80.82%,平均每對引物擴(kuò)增出10.4、8.4個(gè)多態(tài)性條帶[15];Pinar等用過SRAP標(biāo)記對地中海地區(qū)57株野生杏的遺傳多樣性進(jìn)行分析,其中19對引物中有16對可以擴(kuò)增出多態(tài)性條帶,擴(kuò)增出的87段條帶中,有56段具有多態(tài)性,多態(tài)性條帶比率為64.37%[16]。在本試驗(yàn)中應(yīng)用SRAP技術(shù),使用隨機(jī)選取的2個(gè)引物對,對35份龍爪槐樣品進(jìn)行分析,獲得32個(gè)條帶,多態(tài)性條帶有26條,多態(tài)性比率為81.25%。以上研究可以看出,SRAP技術(shù)擴(kuò)增條帶豐富度、多態(tài)性均較高,且試驗(yàn)過程中具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性;SRAP技術(shù)可以在未知基因組序列信息的條件下使用,所用引物也具有通用性,因此,SRAP技術(shù)適用于龍爪槐遺傳多樣性的研究,同時(shí)

    也為對龍爪槐進(jìn)行資源鑒定、基因定位等方面的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

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