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    FHL1A在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

    2017-08-12 16:14:11韋喜生鄭曉君曾弼良劉英香范元平
    實(shí)用癌癥雜志 2017年8期
    關(guān)鍵詞:信號

    韋喜生 鄭曉君 曾弼良 劉英香 范元平

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    FHL1A在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

    韋喜生 鄭曉君 曾弼良 劉英香 范元平

    目的 探討FHL1A在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系。方法 采用免疫組化法檢測FHL1A在89例膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá),同時(shí)采用該方法與western blot法對38例配對樣本(同一患者的腫瘤組織及其周圍正常組織)FHL1A表達(dá)差異進(jìn)行檢測,并對各病例的預(yù)后影響與FHL1A表達(dá)差異間關(guān)系進(jìn)行分析比較。結(jié)果 FHL1A 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯低于其在周圍正常組織中表達(dá),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)FHL1A 的表達(dá)與膠質(zhì)瘤級別呈負(fù)相關(guān),F(xiàn)HL1A表達(dá)低的患者預(yù)后效果差。結(jié)論 FHL1A的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的預(yù)后及惡性程度密切相關(guān),對臨床診斷及預(yù)后判斷有參考價(jià)值。

    膠質(zhì)瘤;FHL1A;預(yù)后

    (ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1229~1232)

    膠質(zhì)瘤是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤,具有對放化療不敏感、易體外成瘤以及多向分化的特點(diǎn),而對于膠質(zhì)瘤干細(xì)胞信號通路以及調(diào)控分子的研究成為目前診斷及治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵科學(xué)問題[1]。不少研究表明,Notch 信號通路與膠質(zhì)瘤對于化療的耐受有著密切關(guān)系,即該通路參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的維持、增殖、自我更新以及分化活動[2-4],而FHL1主要通過參與Notch 信號通路、Cas 信號通路及Src信號通路的信號傳導(dǎo),為其中的重要蛋白質(zhì)家族[5],而其中亞型FHL1A與該類通路的關(guān)系,即與膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚少有報(bào)道。因此研究FHL1A與膠質(zhì)瘤的預(yù)后關(guān)系不僅能夠闡明以上信號通路與膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系,更能夠評價(jià)其對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后的作用。故本研究通過對不同類型膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織及其周圍正常組織中FHL1A表達(dá)水平的測定,探討其與膠質(zhì)瘤的預(yù)后及惡性程度的相關(guān)性。

    1 材料與方法

    1.1 樣本來源

    膠質(zhì)瘤標(biāo)本主要來源于我們所在醫(yī)院的膠質(zhì)瘤治療中心。樣本例數(shù)為89例,搜集時(shí)間為2013年至2015年。樣本中膠質(zhì)瘤類型主要包括:8 例WHOⅠ級,18 例WHOⅡ級(6 例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和12 例星形細(xì)胞瘤),15 例WHO Ⅲ級(6例間變型少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、9 例間變型星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤),48 例WHOⅣ級;搜集樣本中來源于男性的樣本44 例,女性樣本 45 例,樣本來源的年齡范圍為19~ 77 歲,平均年齡(33.7±22.1) 歲。 此外,采用IHC以及 western blot進(jìn)行配對樣本(來源于同一患者的腫瘤組織及其自身的周圍正常腦組織)分析,樣本例數(shù)為38例,搜集時(shí)間為2013年-2015年。38例配對樣本中有7 例WHOⅡ級,21 例WHOⅢ級,10 例WHOⅣ級。所有腫瘤樣本的檢驗(yàn)均由我們所在醫(yī)院病理科的2位以上副高醫(yī)師進(jìn)行確診及病理分級后進(jìn)行。本研究所有程序均經(jīng)醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員審核、批準(zhǔn)。

    1.2 主要試劑及儀器

    1.2.1 試劑 蘇木精、畫圈筆、DAB 顯色試劑盒、抗體封閉液(凱基生物有限公司);即用型 Dako 二抗(羊抗兔)、鼠抗人β-actin(sigma)、兔抗人 FHL1 抗體(proteintech)、HRP-羊抗鼠 IgG、HRP-羊抗兔 IgG(凱基生物有限公司)。Tris-Hcl、SDS、甘油、甘氨酸、甲醇、檸檬酸、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4(南京化學(xué)試劑有限公司);伊利脫脂奶粉。

    1.2.2 儀器 生物組織包埋機(jī)(KL)(湖北康龍電子儀器有限公司),自動恒溫?cái)偪竞嫫瑱C(jī)(蘇州奧德機(jī)械設(shè)備有限公司),生物組織自動脫水機(jī)(湖北慧達(dá)儀器有限公司),石蠟組織切片機(jī)(RM2235GTK-2002)(德國Leica 公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑配置 ①上樣緩沖液:1 g SDS(10%),5 ml甘油,50 mg BPB(0.5%),2.5 ml 1M Tris-Hcl(pH6.8),蒸餾水溶解并定容至10 ml,分裝為每份 500 μl,室溫保存待用。使用前加入2-ME稀釋。②蛋白電泳緩沖液:94 g甘氨酸,15.1 g Tris 堿,5 g SDS混合后用蒸餾水定容至 1 L,室溫保存待用。使用前采用蒸餾水稀釋5倍。③膜轉(zhuǎn)移緩沖液:3.035 g Tris 堿和14.41 g Glycine中加入200 ml甲醇后用蒸餾水定容到1 L,現(xiàn)配現(xiàn)用。⑤封閉緩沖液:用100 ml PBST將脫脂奶粉溶解為5%的濃度,現(xiàn)配現(xiàn)用。

    1.3.2 免疫組化 采用多聚甲醛將樣本固定,并用石蠟包埋,冷凍切片后進(jìn)行免疫組化染色。使用二甲苯將待測標(biāo)本進(jìn)行脫蠟,脫蠟3次,每次做好標(biāo)記,并采用酒精梯度水化(梯度為100%,100%,95%,95%,90%,85%,80%,75%),采用0.3%的過氧化氫避光封閉條件下孵育12 min,用抗原修復(fù)液將樣本修復(fù),PBS清洗載玻片3次并用抗體封閉半小時(shí)后,加入FHL1一抗(1∶150稀釋)75 ml,4 ℃過夜,PBS洗滌3次,采用DAB顯色10 min,自來水終止顯色,蘇木精復(fù)染3 min,鹽酸酒精酚化,梯度酒精脫水干燥5 min,二甲苯透明3次,中性樹膠封片。

    1.3.3 Western Blot 采用PBS將100 g組織樣本上血液洗凈,勻漿、離心后取上清進(jìn)行蛋白定量,并于-80 ℃保存待用。采用12%分離膠及5%的濃縮膠,將預(yù)先準(zhǔn)備好的總蛋白上樣,利用恒壓進(jìn)行蛋白電泳,用緩沖液封閉室溫孵育后加入抗體,其中FHL1抗體(1∶1 000稀釋),其他二抗(1∶2 000稀釋),進(jìn)行37 ℃孵育,1 h后采用顯色液顯影(顯影液A∶B=1∶1)。

    1.3.4 預(yù)后評價(jià) 在患者接受30天治療后采用隨訪方式對患者進(jìn)行改良 Rankin’s 評分[6],其中按照患者日常生活是否可以自理分為6級評分,0分為生活可以完全自理,5分為生活不能自理、完全依賴他人、且量便失禁。得分在0~2分的患者說明其預(yù)后良好,得分在3~5分者預(yù)后不良。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 FHL1 A在膠質(zhì)瘤和相應(yīng)瘤周正常腦組織中的表達(dá)

    通過對38例患者的膠質(zhì)瘤及腫瘤組織周圍的正常組織標(biāo)本進(jìn)行western blot以及免疫組化檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),F(xiàn)HL1A在腫瘤組織周圍的正常組織中表達(dá)(125.3±10.3)高于在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(12.3±2.0),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.303,P=0.0311)。

    2.2 不同膠質(zhì)瘤級別患者的預(yù)后評價(jià)

    經(jīng)改良Rankin’s法評分后,WHO Ⅳ級組得分(4.9±1.8)最高,WHOⅠ級組得分(2.2±0.7)最低,WHO Ⅱ級得分(3.8±0.8),WHO Ⅲ級得分(4.1±1.0),不同級別患者得分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=11.35,P<0.05)。

    2.3 FHL1A表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系

    對所搜集的89 例患者的膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組化分析,根據(jù)患者預(yù)后評價(jià)結(jié)果,對 FHL1A的表達(dá)與患者的預(yù)后以及臨床特點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn) FHL1A表達(dá)與膠質(zhì)瘤級別具有負(fù)相關(guān)性,見表1。

    3 討論

    腦部腫瘤占人類全身腫瘤發(fā)生率的2%,而膠質(zhì)瘤是人體腦部腫瘤中最為常見的一種腫瘤,其致死率極高,預(yù)后較差[7]。且該類腫瘤在體內(nèi)彌散性較快,對化療及常規(guī)放射性療法具有抵抗作用。而僅通過手術(shù)切除法治療的患者,其生命也只能延續(xù)6~9個月。因此,對于膠質(zhì)瘤的治療以及預(yù)后探討成為目前研究的熱點(diǎn)及難點(diǎn)[8]。

    表1 FHL1A表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特征的關(guān)系/例

    通常情況下,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移都與細(xì)胞之間黏著有密切的關(guān)系[9],Notch 信號通路中的FHL 家族蛋白是參與黏著斑激酶的重要信號傳導(dǎo)蛋白[10]。該類家族蛋白主要由4個半 LIM 結(jié)構(gòu)域組成,包括FHL5(ACT)、FHL4、FHL3、FHL2以及FHL1蛋白[11]。FHL1為1種腫瘤抑制因子,在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌以及膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈明顯降低,且參與有關(guān)Notch 信號通路、Cas 信號通路及Src信號通路,影響細(xì)胞正常的生長、分化以及骨架的重塑,對腫瘤細(xì)胞的發(fā)展以及轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用[12]。而有關(guān)FHL1A是否參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展,以及該指標(biāo)與膠質(zhì)瘤的預(yù)后關(guān)系少有報(bào)道。

    本研究通過采用western blot 以及免疫組化檢測對膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織以及其腫瘤組織周圍的正常組織中FHL1A的表達(dá)量進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),F(xiàn)HL1A在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)明顯低于其在腫瘤組織周圍的正常組織,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。說明該項(xiàng)指標(biāo)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研我們發(fā)現(xiàn),F(xiàn)HL1A 主要通過抑制 AKT 的磷酸化,進(jìn)而干涉PI3K/AKT 信號通路的正常功能,對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期具有一定的影響,促進(jìn)參與抑制細(xì)胞周期蛋白的依賴性激酶P21的表達(dá),進(jìn)而通過影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的周期來控制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,起到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[13-14]。同時(shí),F(xiàn)HL為Notch信號通路中重要的蛋白家族,而Notch信號通路與膠質(zhì)瘤對于化療藥物的敏感性有密切關(guān)系,可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對于化療的耐受程度,對膠質(zhì)瘤的預(yù)后有著極大的影響。而FHL1A可以有效地阻斷Notch信號通路中磷酸化過程[15],進(jìn)而阻斷該通路的信號傳導(dǎo),可以耗竭膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,并且增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對于化療藥物以及放射性治療的敏感性,提高治愈率,改善膠質(zhì)瘤的預(yù)后。

    此外,本研究還通過對不同腫瘤級別的樣本中FHL1A表達(dá)進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤腫瘤級別越高,其中FHL1A表達(dá)量越低,說明膠質(zhì)瘤腫瘤級別與FHL1A表達(dá)水平存在負(fù)性相關(guān)性,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)P值小于0.05。改良的Rankin’s法評分中分?jǐn)?shù)越高說明患者預(yù)后效果越差,其自理能力恢復(fù)越差。本研究中采用改良Rankin’s法評分法對各入選患者的預(yù)后進(jìn)行評價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn),腫瘤級別越高的患者術(shù)后預(yù)后結(jié)果越差,也進(jìn)一步證實(shí)了FHL1A表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性,兩者也存在負(fù)性相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)中還考察了FHL1A與患者年齡、性別以及做腫瘤切除手術(shù)的范圍之間的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),F(xiàn)HL1A與上述一些臨床指標(biāo)間并不存在相關(guān)性,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P值大于0.05。而FHL1A卻與患者腫瘤級別類型密切相關(guān),從側(cè)面反映出FHL1A與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

    本研究探討了FHL1A表達(dá)水平的高低與膠質(zhì)瘤患者病情的嚴(yán)重程度的關(guān)系,結(jié)果表明該項(xiàng)指標(biāo)可以作為膠質(zhì)瘤病情演化嚴(yán)重程度的一項(xiàng)參照指標(biāo),F(xiàn)HL1A表達(dá)較高的患者,其膠質(zhì)瘤級別較高,且預(yù)后不良,該項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)與患者預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)性相關(guān)性。因此,該項(xiàng)指標(biāo)對于臨床檢測及預(yù)后判斷具有一定借鑒價(jià)值。

    [1] van Loon EM,Heijenbrok-Kal MH,van Loon WS,et al.Assessment methods and prevalence of cognitive dysfunction in patients with low-grade glioma:A systematic review〔J〕.J Rehabil Med,2015,47(6):481-488.

    [2] Liu P,Man Y,Wang Y,et al.Mechanism of BMP9 promotes growth of osteosarcoma mediated by the Notch signaling pathway〔J〕.Oncol Lett,2016,11(2):1367-1370.

    [3] Vitale MA,Brogan DM,Shin AY,et al.Intra-articular fractures of the sigmoid notch of the distal radius:analysis of progression to distal radial ulnar joint arthritis and impact on upper extremity function in surgically treated fractures〔J〕.J Wrist Surg,2016,5(1):52-58.

    [4] Deford P,Brown K,Richards RL,et al.MAGP2 controls N- otch via interactions with RGD binding integrins:Identification of a novel ECM-integrin-Notch signaling axis〔J〕.Exp Cell Res,2016,341(1):84-91.

    [5] Brangulis K,Petrovskis I,Kazaks A,et al.Structural characterization of CspZ,a complement regulator factor H and FHL-1 binding protein from Borrelia burgdorferi〔J〕.FEBS J,2014,281(11):2613-2622.

    [6] Gutierrez V1,Kassim S,Bibi O,et al.Alternative for carpal tunnel injection:palmar injection site(Rankin's zone)〔J〕.J Surg Orthop Adv,2015,24(1):1-4.

    [7] Westphal M,Lamszus K.Circulating biomarkers for gliomas〔J〕.Nat Rev Neurol,2015,11(10):556-566.

    [8] Ganau L,Paris M,Ligarotti GK,et al.Management of gliomas:overview of the latest technological advancements and related behavioral drawbacks〔J〕.Behav Neurol,2015,2015:862634.

    [9] Chandra V,Kim JJ,Mittal B,et al.MicroRNA aberrations:An emerging field for gallbladder cancer management〔J〕.World J Gastroenterol,2016,22(5):1787-1799.

    [10] Lin J,Qin X,Zhu Z,et al.FHL family members suppress vascular endothelial growth factor expression through blockade of dimerization of HIF1α and HIF1β〔J〕.IUBMB Life,2012,64(11):921-930.

    [11] Castiblanco-Valencia MM,F(xiàn)raga TR,Silva LB,et al.Leptospiral immunoglobulin-like proteins interact with human complement regulators factor H,F(xiàn)HL-1,F(xiàn)HR-1,and C4BP〔J〕.J Infect Dis,2012,205(6):995-1004.

    [12] Yue J,Guan J,Wang X,et al.MicroRNA-206 is involved in hypoxia-induced pulmonary hypertension through targeting of the HIF-1α/Fhl-1 pathway〔J〕.Lab Invest,2013,93(7):748-759.

    [13] Schessl J1,F(xiàn)eldkirchner S,Kubny C,et al.Reducing body myopathy and other FHL1-related muscular disorders〔J〕.Semin Pediatr Neurol,2011,18(4):257-263.

    [14] Christodoulou DC,Wakimoto H,Onoue K,et al.5'RNA-Seq identifies Fhl1 as a genetic modifier in cardiomyopathy〔J〕.J Clin Invest,2014,124(3):1364-1370.

    [15] Liang L,Zhang HW,Liang J,et al.KyoT3,an isoform of murine FHL1,associates with the transcription factor RBP-J and represses the RBP-J-mediated transactivation〔J〕.Biochim Biophys Acta,2008,1779(12):805-810.

    (編輯:甘 艷)

    Expression of FHL1A in Gliomas Tissues and Its Correlations with Prognosis

    WEI Xisheng,ZHENG Xiaojun,ZENG Biliang,et al.

    The 421 Hospital of PLA,Guangzhou,510318

    Objective To investigate the expressions of FHL1A in gliomas tissue and the relationship between their expressions and prognosis of patients with gliomas.Methods Immunohistochemistry SP methods were applied to detect the expression of FHL1A in 89 cases of gliomas organization and western blot also applied to analyze the expression levels differences of FHL1A of 38 matched samples(normal tumor tissue and surrounding normal tissue of the same patients).The relationship between the expression levels and the glioma prognosis were analyzed.Results The expression of FHL1A in gliomas was significantly lower than the corresponding peritumoral normal brain tissue,and the difference had statistical significance(P<0.05);The expression of FHL1A was inversely correlated with tumor grade of gliomas and the lower expression of the FHL1A of patients,the worse prognosis appeared in patients.Conclusion The expression of FHL1A is closely related to the prognosis and malignancy of glioma,and has reference values for clinical diagnosis and prognosis.

    Gliomas;FHL1A;Prognosis

    510318 解放軍第四二一醫(yī)院

    10.3969/j.issn.1001-5930.2017.08.003

    R730.264

    A

    1001-5930(2017)08-1229-04

    2017-04-06

    2017-05-25)

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