自制爬片裝置用于細(xì)胞爬片及細(xì)胞染色

蘇獲，毛林鋒，Benson Kaluba，段智曦，劉擎，黃鵬

（1.中南大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南 長沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410011）

自制爬片裝置用于細(xì)胞爬片及細(xì)胞染色

蘇獲1，毛林鋒2，Benson Kaluba2，段智曦3，劉擎2，黃鵬2

（1.中南大學(xué)護(hù)理學(xué)院，湖南 長沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；3.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410011）

目的利用自制爬片裝置改進(jìn)細(xì)胞爬片的制備方法。方法通過自制裝置和傳統(tǒng)方法制備細(xì)胞爬片，蘇木精-伊紅染色法（HE染色）觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，比較兩種細(xì)胞爬片制備方法的差異；利用自制裝置制備同時給予3種不同干預(yù)處理的細(xì)胞爬片，驗(yàn)證其應(yīng)用于制備多干預(yù)條件細(xì)胞爬片；制備同時含有3種不同細(xì)胞的集成爬片，驗(yàn)證其用于制作細(xì)胞集成爬片的應(yīng)用。結(jié)果自制裝置可簡化細(xì)胞爬片流程，細(xì)胞直接貼于載玻片上生長，未出現(xiàn)污染和增殖受限，制作多干預(yù)或多種細(xì)胞集成爬片效果明確，無相互干擾現(xiàn)象。結(jié)論自制裝置能更簡便地制備以滿足普通染色及特殊染色實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞爬片，是一種更好的制備細(xì)胞爬片的方法。

細(xì)胞爬片；細(xì)胞培養(yǎng)；染色

Abstract:ObjectiveTo provide an improved method to prepare cell-attached slides.MethodsCellattached slides were prepared by routine method and self-made device,and the difference between the two methods were compared by observing the cell growth after HE staining.Three kinds of interventions were given to the same cell-attached slide to test the application in making different interventions cell-attached slide of the device.Three kinds of cells were planted in the same slide to test the application in making integrated cell-attached slides of the device.ResultsOur device simplified the preparation of cell-attached slides.Cells grown on the glass and never showed pollution or growth restriction,given different interventions or planted different cells at the same time without interaction.ConclusionsThe new method simplifies the processes of preparation cell-attached slides,and the slides made by our device satisfies the experiment demands of all kinds of cells staining,makes it as a more effective method than before.

Keywords:cell-attached slide;cells culture;cells staining

細(xì)胞爬片是觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)最常用的一種實(shí)驗(yàn)手段，利用細(xì)胞爬片進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)可排除體內(nèi)諸多干擾因素的影響，并方便對細(xì)胞進(jìn)行各種干預(yù)處理[1]。傳統(tǒng)的方法是在裝有蓋玻片的孔板中種入細(xì)胞，待細(xì)胞在蓋玻片上貼壁生長后再取出蓋玻片進(jìn)行后續(xù)的染色實(shí)驗(yàn)，整個過程操作起來比較繁瑣，且存在許多缺陷。隨著研究的深入，細(xì)胞檢測指標(biāo)日漸豐富，對細(xì)胞爬片的需求逐漸增大，傳統(tǒng)的方法需要逐一對每張爬片進(jìn)行染色，不但操作繁瑣，效率低，制作成本高，且每張細(xì)胞爬片處理過程難免會有差異，導(dǎo)致相互之間可比性差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析困難。本研究中制備一種新型的細(xì)胞爬片裝置，對傳統(tǒng)爬片方法進(jìn)行改良，簡化操作流程，提高細(xì)胞爬片的制作效率，并且能夠在一張載玻片上制作含有多種不同細(xì)胞的集成爬片，并同時進(jìn)行多種干預(yù)處理，節(jié)約大量試劑及相關(guān)材料，減小實(shí)驗(yàn)誤差，提高實(shí)驗(yàn)效率，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通載玻片、直徑9mm圓形小蓋玻片、1.5ml EP管、12孔細(xì)胞培養(yǎng)板及用于染色用的HE染色[蘇木精 - 伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining）]試劑盒、茜素紅染色試劑盒、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液、鬼筆環(huán)肽（紅色）染色液（購自上海生工生物工程股份有限公司），DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶（購自美國Gibco公司），用于干預(yù)處理的納米顆粒（KaolinMeOH及KI@KaolinMeOH）（為本課題組前期制備），甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞株人骨肉瘤（HOS）細(xì)胞、P1代大鼠正常軟骨細(xì)胞及大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）模型P1代軟骨細(xì)胞（均為湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心保存）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞爬片的制備 蓋玻片及載玻片置于濃硫酸中浸泡過夜，自來水及雙蒸水沖洗3遍，再在無水乙醇中浸泡6 h，雙蒸水沖洗后烘干，并同爬片支架一起高溫高壓消毒，然后烤干。使用前，蓋玻片及載玻片用多聚賴氨酸處理備用。在無菌超凈工作臺內(nèi)剪下無菌EP管的蓋子，并在距離EP管底部10 mm處剪斷。將載玻片插入爬片裝置，并將剪斷的EP管放入爬片裝置內(nèi)并卡緊，置入染色濕盒上并用內(nèi)紫外線照1～2 h。見圖1。

傳統(tǒng)細(xì)胞爬片制作前，在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔內(nèi)滴加1滴磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），再放入蓋玻片，使蓋玻片貼住孔板的底部，確?？装迮c蓋玻片之間無氣泡。復(fù)蘇甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，用0.25%胰酶消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度約為6×103，新型爬片裝置每孔加入400μl細(xì)胞懸液，傳統(tǒng)細(xì)胞爬片組每孔加入1 ml細(xì)胞懸液，放入37℃、5%二氧化碳CO2和>90%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞均勻生長在載玻片或蓋玻片上后，取出載玻片或蓋玻片，分別浸入PBS（pH 7.4）中洗3×5 min，然后再浸入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3×5 min，再進(jìn)行后續(xù)的HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)。

圖1 爬片裝置示意圖及操作流程圖

1.2.2 多種細(xì)胞集成爬片的制備 爬片裝置及載玻片等物品準(zhǔn)備方法同上述，為驗(yàn)證爬片裝置可同時制作多種不同細(xì)胞的集成爬片，本研究中分別在3個EP管內(nèi)種入骨肉瘤細(xì)胞株HOS細(xì)胞、P1代大鼠正常膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞（Normal）及大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎（OA）模型P1代軟骨細(xì)胞，由于3種細(xì)胞鈣鹽含量不同，后續(xù)通過茜素紅染色進(jìn)行3種細(xì)胞的鑒定。復(fù)蘇3種細(xì)胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，用0.25%胰酶消化并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度約為6×103，在3個EP管中分別加入3種細(xì)胞懸液400 μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞均勻生長在載玻片上后，取出載玻片進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 多種干預(yù)條件細(xì)胞爬片的復(fù)制 本課題組之前的研究報(bào)道過甲狀腺癌吞噬甲基化高嶺土納米顆粒（KaolinMeOH）及負(fù)載碘化鉀的甲基化高嶺土納米顆粒（KI@KaolinMeOH）的能力不同[2]，本研究中為驗(yàn)證爬片裝置可以同時進(jìn)行多種干預(yù)處理，分別在3個EP管內(nèi)加入PBS及FITC處理的KaolinMeOH、KI@Kaolin-MeOH進(jìn)行干預(yù)，通過鬼筆環(huán)肽及DAPI染色并在激光共聚焦顯微鏡下觀察甲狀腺癌細(xì)胞吞噬納米材料的情況。按上述方法培養(yǎng)甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞，利用自制爬片裝置制作細(xì)胞爬片，并加入20 μl濃度為50 μg/ml的納米顆?；鞈乙?，培養(yǎng)細(xì)胞過夜，再進(jìn)行后續(xù)的染色實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)胞染色 HE染色：上述制作的爬片經(jīng)4%多聚甲醛固定后，PBS洗3×5min，蘇木素染核8min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，自來水沖洗，伊紅染液染2 min，自來水沖洗，自然晾干后中性樹膠封片。兩種方法分別制備6張細(xì)胞爬片，HE染色，萊卡倒置顯微鏡（×100）下觀察細(xì)胞形態(tài)，并計(jì)數(shù)單張爬片細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。茜素紅染色：細(xì)胞爬片固定后，用茜素紅染液覆蓋樣本，37℃避光孵育60 min，雙蒸水緩慢沖洗3 min，常規(guī)封片后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)鈣鹽堆積情況，鈣沉積細(xì)胞呈現(xiàn)橘紅色，計(jì)數(shù)橘紅色細(xì)胞數(shù)目并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。鬼筆環(huán)肽染色：細(xì)胞固定后，0.5%Triton X-100室溫孵育10 min，用3%脫脂牛奶于4℃結(jié)合非特異性蛋白1 h，用鬼筆環(huán)肽工作液室溫染色20 min，PBS洗2×5 min，最后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核10min后，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架及納米顆粒吞噬情況，通過Image J軟件分析圖片中細(xì)胞吞噬材料的OD值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間的數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自制爬片裝置與傳統(tǒng)方法制備細(xì)胞爬片比較

分別利用傳統(tǒng)方法及自制爬片裝置成功獲得細(xì)胞爬片。普通載玻片的空白區(qū)域面積約為58 mm×25 mm，而1.5 ml EP管管口直徑約為14 mm，利用自制爬片裝置可以在1張載玻片上面同時獲得3個細(xì)胞爬片區(qū)域。HE染色發(fā)現(xiàn)2種細(xì)胞爬片制備方法均可得到形態(tài)清晰的細(xì)胞爬片，但是傳統(tǒng)方法制備的細(xì)胞爬片易出現(xiàn)嚴(yán)重的邊緣效應(yīng)及細(xì)胞脫落現(xiàn)象。應(yīng)用傳統(tǒng)方法單張爬片細(xì)胞數(shù)約為（2532±32.76）個，另外，從孔板中取出蓋玻片的過程容易折斷蓋玻片；自制爬片裝置讓細(xì)胞直接生長并貼壁在載玻片上，制備的細(xì)胞爬片貼壁更均勻，貼壁更牢靠，無邊緣現(xiàn)象及細(xì)胞脫落現(xiàn)象，單張爬片細(xì)胞數(shù)約為（4 145±83.10）個，傳統(tǒng)爬片與新型爬片上單張爬片細(xì)胞數(shù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。見圖2A、2B。

2.2 自制爬片裝置用于制備集成細(xì)胞爬片

在自制爬片裝置中同時培養(yǎng)的HOS細(xì)胞、P1代正常大鼠軟骨細(xì)胞（Normal）、P1代大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨細(xì)胞（OA）分別貼壁在同一載玻片上的不同位置，相互獨(dú)立，茜素紅染色后，細(xì)胞內(nèi)沉積的鈣鹽被染成橘紅色。3種細(xì)胞在相同的條件下得到不同程度的染色效果，鈣鹽沉積細(xì)胞比率分別為：HOS組為0.81%、Normal組為15.45%、OA組為97.33%，3種細(xì)胞鈣鹽沉積比率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。由于3種細(xì)胞分布在載玻片的不同位置，在同步染色的過程中無相互影響，提示自制爬片裝置可用于集成多種細(xì)胞爬片的制備。見圖3。

2.3 自制爬片裝置用于制備多干預(yù)條件的細(xì)胞爬片

鬼筆環(huán)肽將細(xì)胞膜骨架蛋白染成紅色，DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色，甲狀腺癌細(xì)胞吞噬的納米顆粒呈綠色熒光，用Image J軟件測得3種干預(yù)條件下單張圖片內(nèi)的綠色熒光OD值分別為：PBS組為0；KaolinMeOH組為 （259.6±3.28）；KI@KaolinMeOH組為（616.1±20.26）。3組圖片的綠色熒光OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。KI@KaolinMeOH干預(yù)的甲狀腺癌細(xì)胞內(nèi)綠色熒光顆粒多于KaolinMeOH干預(yù)處理的細(xì)胞。見圖4。

圖2 自制爬片裝置與傳統(tǒng)方法制備細(xì)胞爬片比較

圖3 自制爬片裝置制備多種細(xì)胞的集成細(xì)胞爬片（茜素紅染色×100）

圖4 自制爬片裝置制備多種干預(yù)條件細(xì)胞爬片（鬼筆環(huán)肽染色×400）

3 討論

細(xì)胞爬片是體外培養(yǎng)細(xì)胞常用的一種實(shí)驗(yàn)手段，廣泛應(yīng)用普通染色下觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)[2-3]或特殊染色下觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白分布情況[4-5]。傳統(tǒng)爬片方法通過在置入蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)板中種植細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，傳統(tǒng)的細(xì)胞爬片制作方法存在以下不足：①每張爬片均需單獨(dú)制備，進(jìn)行大量細(xì)胞爬片制備的時候操作繁瑣，且相互之間差異較大，對干預(yù)結(jié)果造成影響；②置入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片由于貼合不緊易發(fā)生滑動，導(dǎo)致蓋玻片的兩面均可能有細(xì)胞貼壁生長，觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)時出現(xiàn)重影，影響結(jié)果；③虹吸作用導(dǎo)致細(xì)胞爬片與底部嚴(yán)密結(jié)合而很難分開，取出蓋玻片的過程容易折斷、夾碎和顛倒正反面等，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成干擾；④細(xì)胞大量聚集生長在蓋玻片的邊緣，造成邊緣效應(yīng)；⑤染色過程中，反復(fù)沖洗夾取蓋玻片易導(dǎo)致細(xì)胞脫片。

有研究在傳統(tǒng)方法上進(jìn)行改進(jìn)，通過中性樹膠將1ml tips粘在載玻片上，從而實(shí)現(xiàn)集成爬片的制作[6-7]。但是這些改進(jìn)方法均存在一些不足，首先，中性樹膠中普遍存在二甲苯等細(xì)胞毒性物質(zhì)，對細(xì)胞增殖有一定的影響[8]；其次，爬片制備好之后載玻片上面殘留的中性樹膠不利于后續(xù)的染色和封片；最后，中性樹膠粘合不是很牢靠，爬片過程中可能因?yàn)槁┮憾鴮?dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。

通過反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，本研究中自制的爬片裝置可以高效地制作細(xì)胞爬片，相對于傳統(tǒng)方法及現(xiàn)有報(bào)道的爬片方法，本研究方法具有以下的優(yōu)勢：①簡化試驗(yàn)流程，操作簡單，提高細(xì)胞爬片制備的成功率；②爬片裝置可以反復(fù)消毒重復(fù)使用，試驗(yàn)用材價(jià)格低廉，載玻片、EP管都是實(shí)驗(yàn)室常用的耗材，不需要購買相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)孔板，同時也不需要購買專用的細(xì)胞爬片；③細(xì)胞直接在載玻片上生長，分布更均勻，可以避免傳統(tǒng)方法兩面都貼上細(xì)胞的情況；④不使用中性樹膠等粘合劑，不會對細(xì)胞生長造成影響；⑤單張載玻片上可同時制備3個細(xì)胞爬片，方便大批量的細(xì)胞爬片制備；⑥能確保干預(yù)條件一致性，提高研究結(jié)果的準(zhǔn)確性；⑦EP管之間相互獨(dú)立，單張載玻片上可以同時制備多種細(xì)胞的集成爬片和同時進(jìn)行多種干預(yù)處理。

綜上所述，本研究中自制的細(xì)胞爬片裝置能極大地節(jié)約試劑盒耗材，細(xì)胞爬片效果好、操作方便，滿足大批量細(xì)胞爬片染色的需求，有效地提高實(shí)驗(yàn)效率及準(zhǔn)確率，滿足普通染色及特殊染色實(shí)驗(yàn)要求，是一種更好的制備細(xì)胞爬片的方法，非常適合推廣使用。

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New method of preparation cell-attached slides for staining with self-made device

Huo Su1,Lin-feng Mao2,Benson Kaluba2,Zhi-xi Duan3,Qing Liu2,Peng Huang2
(1.School of Nursing,Central South University,Changsha,Hunan 410013,China;2.Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,China;3.The Second Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,Hunan 410011,China)

Q2-33

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.008

1005-8982（2017）15-0038-04

2017-04-19

黃鵬，E-mail：xiangyahp@csu.edu.cn；Tel：15273124136