整合素β1-黏附斑激酶在心肌纖維化中的作用及機(jī)制*

林傳欽，翟秀麗，鄧托

（1.海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院 急診科，海南 三亞 572000；2.海南省三亞市三林醫(yī)院 防治科，海南 三亞 572025）

整合素β1-黏附斑激酶在心肌纖維化中的作用及機(jī)制*

林傳欽1，翟秀麗2，鄧托1

（1.海南省農(nóng)墾三亞醫(yī)院 急診科，海南 三亞 572000；2.海南省三亞市三林醫(yī)院 防治科，海南 三亞 572025）

目的初步探討整合素β1-黏附斑激酶（integrin β1-FAK）在心肌細(xì)胞纖維化中的作用與機(jī)制。方法將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、血清脂肪酶（LPS）處理組、integrin β1抑制組、黏附斑激酶（FAK）抑制組及integrinβ1阻斷+FAK抑制組。免疫熒光雙標(biāo)法檢測原代心肌細(xì)胞純度，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）與實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-RCR）檢測基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原（Col1A1）、Ⅲ型膠原（Col3A1）和整合素β1（integrin β1）mRNA水平的變化，Western blot檢測FAK的表達(dá)。結(jié)果①與對照組比較，LPS能夠刺激心肌細(xì)胞上調(diào)MMP-9、TGF-β1、Col1A1、Col3A1及integrin β1表達(dá)；②與LPS組比較，integrin β1阻斷可以抑制LPS誘導(dǎo)的TGF-β1、MMP-9、Col1A1及Col3A1信使核糖核酸（mRNA）的上調(diào)（P<0.05），并阻斷LPS誘導(dǎo)的磷酸化FAK的激活（P<0.05）；③FAK蛋白抑制劑PF-573228可抑制LPS誘導(dǎo)的TGF-β1和MMP-9 mRNA上調(diào)水平，同時加入integrin β1封閉性抗體顯示相似的效果。結(jié)論Integrin β1阻斷能抑制FAK的磷酸化，下調(diào)TGF-β1、MMP-9、Col1A1及Col3A1的表達(dá)，從而改善在持續(xù)炎癥刺激條件下心肌細(xì)胞的纖維化反應(yīng)進(jìn)程，為未來臨床治療拓展新思路。

心肌纖維化；整合素；黏附斑激酶；血清脂肪酶

Abstract:ObjectiveTo study the effects and mechanisms of integrin β1-FAK on myocardial fibrosis.MethodsCells were randomly divided into five groups:the blank control group,the LPS-stimulated group,integrin β1blocking group,FAK blocking group,blocking integrin β1and FAK group.Double-immunostaining was used to test the purity of myocardial cells.RT-PCR and q-PCR were used to detect the gene expression of MMP-9,TGF-β,Col1A1,Col3A1 and integrin β1.Western blot method was used to detect the expression of FAK protein.ResultsCompared with those in the control group,the LPS-treated cells exhibited a significant increase of MMP-9,TGF-β,Col1A1,Col3A1 and integrin β1,while blocking the integrin β1prevented the increase in LPS-induced up-regulation of MMP-9,TGF-β,Col1A1,Col3A1 and integrin β1and inhibited the FAK phosphorylation.Furthermore,when the cells were treated with the FAK agonist,the expression of MMP-9 and TGF-β decreased,and it had similar effect with blocking integrin β1.ConclusionsOurstudy suggeststhatinhibition ofintegrin β1suppresses the FAK phosphorylation,and decreasesexpressons of MMP-9,TGF-β,Col1A1,Col3A1,which contributes to alleviate the development of myocardial fibrosis under the condition of continuous inflammation stimulation and provides new ideas for the future clinical treatment stimulated H9c2 cardiomyocytes.

Keywords:myocardial fibrosis;integrin;focal adhesion kinase;lipase

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是以膠原過度沉積以及細(xì)胞外基質(zhì)增多為特征的慢性病理過程，其發(fā)展在一定程度上影響著心肌梗死、高血壓病、肥厚性心肌病及心力衰竭等多種心血管疾病的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸[1-2]。盡管目前已有許多研究試圖去揭示心肌纖維化的形成機(jī)制及所涉及的相關(guān)信號通路，例如心肌張力/壓力的改變，轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）信號通路的激活等[3-5]，但是總體而言，心肌纖維化的機(jī)制仍未完全明了，尚需進(jìn)一步研究闡明。目前已有研究表明，心肌纖維化涉及到細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM）的產(chǎn)生[6]。而整合素（Integrin）作為介導(dǎo)細(xì)胞外環(huán)境與細(xì)胞相互作用的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其與細(xì)胞周圍ECM蛋白質(zhì)的結(jié)合對細(xì)胞黏附、功能傳遞、增殖及分化等具有重要的調(diào)控作用[7-9]。然而，目前關(guān)于integrin β1受體是否是介導(dǎo)心肌纖維化，整合素β1（beta-1 integrins，integrin β1）激活后又是通過何種信號通路來調(diào)控心肌纖維化等并不清楚?；谝陨蠁栴}，本研究擬探討integrin β1在心肌纖維化中的作用與相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

杜氏磷酸鹽緩沖液（Dulbecco's phosphate buffered saline，D-PBS）、胎牛血清、DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)液及L-谷氨酰胺（購自美國Hyclone公司），兔抗磷酸化黏附斑激酶抗體（anti-phospho-focal adhesion kinase，Anti-P-FAK）、Anti-FAK、心肌肌鈣蛋白 T（cardiac troponin T，cTnT）、α-Sarcomeric Alexa Fluor 488及水溶性熒光染料（cyanine dye 3，Cy3）（購自美國Abcam公司），Anti-GAPDH兔抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記（horse radish peroxidase，HRP）的羊抗兔二抗（購自美國的Cell Signaling Technology公司），DMEM、胎牛血清及胰酶消化液（Trypsin-EDTA）（購自美國Gibco公司），聚氰基丙烯酸正丁酯（Butyleyanoacrylate，BCA）蛋白定量檢測試劑盒（購自陜西省西安飛揚(yáng)生物科技有限公司），RIPA裂解液（radio immunoprecipitation assay，RIPA）（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（re verse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（購自美國Thermo Scientific公司），抗體（購自美國Abcam公司），其他試劑為國產(chǎn)分析純，熒光倒置顯微鏡（購自日本奧林巴斯株式會社），酶聯(lián)免疫檢測儀、Power PacTM電泳儀、Trans-blot電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)Chemi Doc XRS（購自美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞分離 取新生48 h內(nèi)的（ICR）小鼠，斷頸處死，75%乙醇浸泡5 min取出。在超凈工作臺中將鼠腹面向上放置，用眼科剪剪開小鼠胸腔，充分暴露心臟。將獲取的心臟放入含有冰的DPBS液中，剪去心房，反復(fù)洗滌，至心室內(nèi)無血漬。然后將心室肌剪碎（<1 mm3）并轉(zhuǎn)移到離心管中，800 r/min離心5 min，棄去磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）后，加入 5 ml 0.5%膠原酶Ⅱ的消化液，37℃水浴并振蕩消化10 min；吸取上層混懸液，加入等量的心肌培養(yǎng)基終止反應(yīng)；剩余沉淀物再加膠原酶Ⅱ消化液消化3～5次，直至組織塊完全消化。200目雙重不銹鋼細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集濾液，800 r/min離心5 min；棄上清液，加入心肌培養(yǎng)基培養(yǎng)，用滴管反復(fù)、緩慢吹打，使細(xì)胞重浮，調(diào)整細(xì)胞密度，接種到培養(yǎng)皿中，置37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)換液。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定原代心肌細(xì)胞 將滅菌的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中，以3×104個/孔密度接種細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后用PBS洗滌細(xì)胞，之后加入4%多聚甲醛固定10 min，用PBS漂洗3次，1%Trixon-100通透細(xì)胞10 min，PBS漂洗3次，5%牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）室溫封閉30min，加入一抗（cTnT和 α-Sarcomeric actinin），放置 4℃孵育過夜。PBS洗滌3次×5 min，加入二抗488和Cy3，37℃孵育1 h。PBS洗滌3次，DAPI（1∶1 000）孵育15 min，PBS洗滌3次，封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 所有組細(xì)胞采用含0.5%血清的DMEM/F12高糖培養(yǎng)基同化24 h后，進(jìn)行分組。①對照組（control）：不作任何處理；②LPS 組：使用1μg/ml LPS處理心肌細(xì)胞24 h；③integrin β1阻斷組：使用10μg/ml integrin β1封閉性抗體[HMβ1-1（美國BD pharmingen公司）]預(yù)處理細(xì)胞2 h后，再加入1 μg/ml LPS處理24h；④FAK抑制組：使用1μmol PF-573228預(yù)處理細(xì)胞2 h，與LPS處理組同一時間加入相同濃度LPS處理細(xì)胞24h；⑤integrin β1阻斷+FAK抑制組：使用10μg/ml integrin β1封閉性抗體和1μmol的FAK抑制劑PF-573228預(yù)處理細(xì)胞2 h后，再加入1μg/ml LPS處理24 h。

1.2.4 RT-PCR各處理組細(xì)胞 用Trizol裂解細(xì)胞后提取總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），終樣品測定OD260/280確定RNA濃度，進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR反應(yīng)以總體積20 μl，RNA樣品500 ng的體系，參照試劑盒[oligo（dT）18 primer and a Revet AidTMFirst Strand互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）Synthesis Kit]反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測基因（TGF-β1：正向 5'-CCGCAACAACGCAATCTATG-3'，反向 5'-GC CCTGTATTCCGTCTCCTT-3'；MMP-9：正向 5'-TCTG CCTGCACCACTAAAGG，反向5'-CAGGCTGTACCCT TGGTCTG-3'；Col1A1：正向 5'-CAAGGTCCTTCTGGA TCAAGTG-3'，反向 5'-CCTTTATGCCTCTGTCACCTT G-3'；Col3A1：正向 5'-GACCAAAAGGTGATGCTGGA CAG-3'，反向5'-CAAGACCTCGTGCTCCAGTTAG；integrin β1：正向 5'-TCTCACCAAAGTAGAAAGCAG GGA-3'，反向 5'-ACGATAGCTTCATTGTTGCCATTC-3'；GAPDH：正向 5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，反向5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'）的表達(dá)。

1.2.5 實(shí)時螢光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定各處理組細(xì)胞，用Trizol裂解細(xì)胞后提取總RNA，以總體積20 μl，RNA樣品500 ng的體系，參照試劑盒（oligo（dT） 18 primer and a Revet AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit）反應(yīng)條件進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，合成cDNA。然后參照試劑盒（Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master Mixes）進(jìn)行qRT-PCR測定相關(guān)基因的表達(dá)情況。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為對照，通過 2-△△Ct算法進(jìn)行分析。

1.2.6 Western blot檢測 提取心肌細(xì)胞總蛋白，測定蛋白含量。每孔道加入50 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PACE）并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。然后于50 g/L脫脂奶粉TBST（tris buffered saline with tween）緩沖液下室溫封閉2 h，分別加入1∶1 000兔抗p-FAK和FAK，4℃振搖孵育過夜。TBS洗膜 10 min×3次，加入二抗（1∶6 000），室溫下振搖90 min并洗膜。然后加入ECL試劑發(fā)光，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代心肌細(xì)胞的鑒定

原代心肌細(xì)胞接種24 h后在顯微鏡下呈梭形或不規(guī)則扁平狀，并逐漸鋪展伸出偽足，相互交織成網(wǎng)，形成自發(fā)收縮細(xì)胞單層或細(xì)胞簇。對其進(jìn)行心肌標(biāo)志蛋白cTnT，α-actinin免疫熒光染色，結(jié)果顯示幾乎所有細(xì)胞cTnT染色呈陽性，且cTnT陽性細(xì)胞同時表達(dá)α-actinin蛋白（紅色），證實(shí)分離所得原代心肌細(xì)胞純度可達(dá)≥90%。見圖1。

2.2 LPS誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶9、TGF-β1mRNA的表達(dá)

圖1 免疫熒光檢測心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTnT和α-actinin

在沒有LPS的誘導(dǎo)下，心肌細(xì)胞會有基礎(chǔ)性的基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）和 TGF-β1表達(dá)，而在加入 0.1、0.5、1.0 和2.0μg/ml的LPS作用 24h，各組 MMP-9、TGF-β1表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MMP-9：F=54.784，P=0.000；TGF-β1：F=33.540，P=0.000）。隨著LPS濃度的提升，MMP-9和TGF-β1表達(dá)均成梯度增加，并于LPS濃度1.0 μg/ml時均達(dá)到一個較高峰值（與 0 μg/ml LPS 比較，0.1 μg/ml LPS：tMMP-9=3.980，PMMP-9=0.016；tTGF-β1=4.214，PTGF-β1=0.014；0.5μg/ml LPS：tMMP-9=10.400，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=4.923，PTGF-β1=0.008；1.0μg/ml LPS：tMMP-9=14.080，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=16.625，PTGF-β1=0.000；2.0μg/mlLPS：tMMP-9=9.368，PMMP-9=0.001；tTGF-β1=12.612，PTGF-β1=0.000）。見圖2。

2.3 LPS誘導(dǎo)小鼠心肌細(xì)胞中Ⅰ型、Ⅲ型膠原和integrin β1受體的表達(dá)

RT-PCR和qRT-PCR結(jié)果顯示，LPS 1.0 μg/ml作用24 h后，各組mRNA表達(dá)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Col1A1：F=89.769，P=0.001；Col3A1：F=411.429，P=0.000；integrin β1：F=43.891，P=0.003）。LPS 組 Col1A1、Col3A1、integrin β1mRNA表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（與對照 組 比 較 ，tCol1A1=9.475，PCol1A1=0.001；tCol3A1=20.284，PCol3A1=0.000；tintegrinβ1=6.625，Pintegrinβ1=0.003）。見圖3。

2.4 阻斷integrin β1抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌 細(xì) 胞 中 TGF-β1、MMP-9、Col1A1、Col3A1 和integrin β1mRNA的表達(dá)

筆者采用10μg/ml的integrin β1封閉性抗體處理細(xì)胞2 h，之后用1μg/ml的LPS孵育細(xì)胞24 h，各組mRNA表達(dá)經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（MMP-9：F=89.214，P=0.000；TGF-β1：F=81.536，P=0.000；Col1A1：F=272.390，P=0.000；Col3A1：F=113.352，P=0.000；integrin β1：F=69.780，P=0.000）。結(jié)果顯示：加入integrin β1阻斷劑預(yù)處理后，integrinβ1阻斷劑可以抑制LPS誘導(dǎo)的TGF-β1和MMP-9 mRNA上調(diào)水平（LPS組與對照組比較：tMMP-9=11.711，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=12.105，PTGF-β1=0.000；tCol1A1=21.559，PCol1A1=0.000；tCol3A1=14.473，PCol3A1=0.000；tintegrinβ1=11.525，Pintegrinβ1=0.000；LPS 組與 integrin β1阻斷后比較：tMMP-9=11.0461，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=9.576，PTGF-β1=0.000；tCol1A1=18.525，PCol1A1=0.000；tCol3A1=10.831，PCol3A1=0.000；tintegrinβ1=8.010，Pintegrinβ1=0.000）。見圖4。

2.5 阻斷integrin β1抑制LPS誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞中FAK蛋白的磷酸化情況

圖2 PCR檢測不同濃度LPS時MMP-9和TGF-β1的表達(dá)情況

圖3 RCR檢測Ⅰ型、Ⅲ型膠原和integrin β1受體的表達(dá)

各組mRNA表達(dá)及FAK蛋白活化水平，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FAK：F=21.050，P=0.000；MMP-9：F=34.633，P=0.000；TGF-β1：F=87.251，P=0.000）。結(jié)果顯示，LPS可以使磷酸化FAK蛋白表達(dá)上調(diào)，而阻斷integrin β1抑制LPS誘導(dǎo)的憐酸化FAK蛋白的上調(diào)（見圖5A）。分別加入integrin β1封閉性抗體和FAK蛋白抑制劑PF-573228可以抑制LPS誘導(dǎo)的TGF-β1和MMP-9 mRNA上調(diào)水平，但同時加入integrin β1封閉性抗體和FAK蛋白抑制劑PF-573228，與單獨(dú)integrin β1抑制和FAK抑制相比并未顯示出進(jìn)一步的抑制（LPS）組與對照組比較：tFAK=8.503，PFAK=0.000；tMMP-9=10.366，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=15.548，PTGF-β1=0.000；LPS 組與 integrin β1抑制比較：tFAK=5.715，PFAK=0.000；tMMP-9=8.1111，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=11.494，PTGF-β1=0.000；LPS 與 FAK 抑制比較：tFAK=6.238，PFAK=0.000；tMMP-9=8.645，PMMP-9=0.000；tTGF-β1=14.080，PTGF-β1=0.000）。見圖5。

圖4 RCR 檢測 integrin β1阻斷后 TGF-β1、MMP-9、Col1A1、Col3A1 及 integrin β1的表達(dá)

圖5 integrin β1FAK通過FAK調(diào)節(jié)纖維化因子MMP-9和 TGF-β1的表達(dá)

3 討論

心肌纖維化是高血壓、心肌梗死及心力衰竭等多心血管疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一[1]。細(xì)胞內(nèi)膠原合成代謝與降解代謝失衡，Col1A1與Col3A1合成比率升高，基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)和活性降低，最終導(dǎo)致膠原合成增加、降解降低，從而產(chǎn)生心肌的纖維化，心臟舒張與收縮功能下降，致使心力衰竭、心律失常等的發(fā)生[10]。

Integrin是由約220 kD的糖基化蛋白組成的異二聚體，包括α、β兩種亞基[11]。其表達(dá)于細(xì)胞表面，介導(dǎo)細(xì)胞外環(huán)境與細(xì)胞相互作用的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，對于細(xì)胞黏附、細(xì)胞功能傳遞、細(xì)胞增殖及分化等具有重要的調(diào)控作用[12]。Integrin β1作為主要的Ⅰ型和Ⅲ膠原受體，目前受到廣泛關(guān)注。在本實(shí)驗(yàn)中，原代心肌細(xì)胞在LPS刺激誘導(dǎo)24 h，心肌纖維化標(biāo)志基因（TGF-β1和MMP-9）表達(dá)上調(diào)，心肌纖維化程度增加，并伴隨著細(xì)胞Col1A1、Col3A1及integrin β1表達(dá)的增加，而聯(lián)合給予integrin β1封閉性抗體處理后，integrin β1表達(dá)減少，同時細(xì)胞Col1A1、Col3A1 表達(dá)下調(diào)，TGF-β1和 MMP-9 表達(dá)減弱，提示integrin β1信號可能成為治療心肌纖維化的一種潛在靶點(diǎn)。

Integrin不具有酶活性，必須通過激活下游分子來向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號[13]。FAK作為Integrin的主要下游作用分子，在Integrin介導(dǎo)細(xì)胞遷移中起著必不可少的作用[14]。整合素與ECM蛋白質(zhì)接觸可導(dǎo)致FAK的酪氨酸磷酸化，從而激活FAK[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原代心肌細(xì)胞在LPS刺激誘導(dǎo)24 h，p-FAK的表達(dá)上調(diào)，分別加入integrin β1封閉性抗體和FAK蛋白抑制劑PF-573228均可以抑制LPS誘導(dǎo)的TGF-β1和MMP-9 mRNA的上調(diào)水平，但同時加入integrin β1封閉性抗體和FAK蛋白抑制劑PF-573228，與單獨(dú)加入integrin β1阻斷組比較，并未有進(jìn)一步抑制，表明integrin β1主要通過激活FAK參與心肌細(xì)胞纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，阻斷integrin β1能抑制FAK的磷酸化，進(jìn)而減少Col1A1與Col3A1合成，下調(diào)相關(guān)纖維化因子TGF-β1和MMP-9的表達(dá)，從而改善在炎癥刺激條件下心肌細(xì)胞的纖維化進(jìn)程，為未來臨床治療拓展新思路。

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Role and mechanism of integrin β1-FAK on myocardial fibrosis*

Chuan-qin Lin1,Xiu-Li Zhai2,Tuo Deng1
(1.Department of Emergency,Hainan Province NongKen Sanya Hospital,Sanya,Hainan 572000,China;2.Department of Prevention and Health Care,Sanya Sanlin Hospital,Sanya,Hainan 572025,China)

R284.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.002

1005-8982（2017）15-0005-06

2016-12-08

三亞市醫(yī)療科技創(chuàng)新項(xiàng)目（No：YW1214）