豬偽狂犬病疫苗研究及應用現(xiàn)狀

任衛(wèi)科+池晶晶+李秀麗+鄢明華+張莉

摘 要： 豬偽狂犬?。╬seudorabies， PR）是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus， PRV）引起的豬的一種急性傳染病，對世界養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重。疫苗免疫是預防和控制豬偽狂犬病的主要措施之一。目前，國內外臨床應用的豬偽狂犬病疫苗包括滅活疫苗、弱毒疫苗和基因缺失疫苗。近年來，隨著我國偽狂犬病的反彈和流行，偽狂犬病防控和疫苗研究再次成為研究熱點。本文對豬偽狂犬病疫苗的研究及使用現(xiàn)狀進行了較為詳細的綜述。

關鍵詞： 豬；偽狂犬病；疫苗；現(xiàn)狀

中圖分類號：S852.4 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.08.009

Abstract：Pseudorabies （PR） is an acute infectious disease caused by pseudorabies virus （PRV）， which causes great losses to the pig industry in the world. Now， vaccination remains one of the main measures to prevent and control PR. At present， clinical application of PR vaccine at home and abroad include inactivated vaccine， attenuated vaccine and gene deleted vaccine. In recent years， with the rebound and epidemic of PR in China， the prevention and control of PR and vaccine research have become the focus of research again.In the article， the research and application status of PR vaccines were reviewed in detail.

Key words： swine； pseudorabies； vaccine； status

偽狂犬病（pseudorabies， PR）是一種由偽狂犬病病毒（pseudorabies virus， PRV）引起的以多種家畜及野生動物為主的以發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征的急性傳染病[1]。該病感染豬后可引起母豬流產，產死胎和木乃伊胎；仔豬發(fā)病后表現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉和神經(jīng)癥狀，兩周齡內仔豬死亡率可達100%。20世紀90年代以來，隨著PR基因缺失疫苗（Bartha-K61株）的引入并廣泛使用，該病在我國大部分地區(qū)得到有效控制[2-4 ]。然而，自2011年以后，我國華東、華中、華北及東北等地區(qū)的疫苗免疫豬群中相繼出現(xiàn)了PR疫情，部分地區(qū)甚至大規(guī)模爆發(fā)，并呈現(xiàn)逐漸蔓延的趨勢，給養(yǎng)豬業(yè)造成新的威脅[5-6]。這些發(fā)病豬場大多都免疫過PR基因缺失疫苗，并表現(xiàn)出了新的流行特點[7-9]。

近期的研究結果表明，新的PRV流行株部分毒力基因相比以前的流行毒株已經(jīng)發(fā)生了變異，且對仔豬的致病性有所增強，現(xiàn)有的疫苗不能完全保護免疫豬抵抗PRV流行株的攻擊[10-12]。對于該病的防控，國內外均以疫苗免疫預防為主，結合偽狂犬病毒gE抗原和gE抗體檢測淘汰、凈化野毒感染豬。目前，臨床應用的PR疫苗大體可分為以下三類：一是將分離的野毒或強毒經(jīng)甲醛滅活后，加佐劑乳化制成油乳劑滅活疫苗；二是將分離的野毒或強毒經(jīng)非豬源細胞或者雞胚反復傳代致弱研制的弱毒疫苗；三是利用基因工程技術構建的基因缺失疫苗。這些疫苗在PR的防控方面起到了非常重要的作用。此外，一些基因工程疫苗例如核酸疫苗、亞單位疫苗及重組疫苗尚在研究之中。本研究擬對PR疫苗研究進展及其在我國養(yǎng)豬生產中的應用現(xiàn)狀進行詳細闡述。

1 滅活疫苗

2001年陳煥春等[13-14]應用PRV分離株Ea株研制成功我國第一個全病毒油乳劑滅活疫苗。該疫苗免疫效力較好，后備母豬免疫4周后血清中和滴度可高達1∶1 412，對新生仔豬和斷奶仔豬保護率分別為90.6%，100.0%。2014年，Gu等[15]利用細菌人工染色體技術（BAC）缺失了PRV流行株ZJ01株的gE/gI基因，構建了PRVZJ01△gE/gI株，將該病毒用福爾馬林滅活后，添加佐劑Montanide ISA 206 研制成功PRVgE/gI雙基因缺失滅活疫苗。用該疫苗免疫4周齡仔豬，二免后3周用1 mL 106.0 TCID50·mL-1的PRV-ZJ01株鼻內攻擊，結果攻毒對照豬7 d內全部死亡，而vZJ01△gE/gI株滅活疫苗免疫組豬未出現(xiàn)臨床癥狀，但免疫過兩次PRBartha-K61株疫苗的試驗豬均出現(xiàn)一過性痙攣及共濟失調癥狀。2015年，Wang等[16]基于分離的PRV流行株HN1201構建了gE基因缺失株（PRV-HN1201ΔgE株），滅活后添加佐劑Montanide ISA 206研制出PRVgE基因缺失滅活疫苗。該疫苗免疫3周齡小豬4周后用1 mL 107.0 TCID50·mL-1親本強毒PRV-HN1201滴鼻攻擊，攻毒后免疫豬僅有一過性發(fā)熱，沒有其他臨床癥狀，但有兩頭在攻毒后第2天經(jīng)鼻拭子檢測到排毒現(xiàn)象，持續(xù)3天；對照組攻毒后14天所有對照豬全部死亡，且攻毒后第1天至死亡時，均可經(jīng)鼻拭子檢測到排毒。

目前，我國臨床使用的PR滅活疫苗主要是PRV Ea株全病毒油乳劑滅活疫苗，但由于該疫苗不能區(qū)別免疫豬和野毒感染豬，在PR基因缺失活疫苗上市以來臨床上使用越來越少，近年來市場占有率已經(jīng)不足5%。

2 弱毒疫苗

PR弱毒疫苗是將分離到的野毒株經(jīng)非豬源細胞或雞胚反復傳代，或在高于一般培養(yǎng)溫度條件下加入致突變劑在細胞培養(yǎng)基上反復傳代而獲得。由于其特殊的自然基因缺失的特點，再加之免疫原性優(yōu)良，生產工藝簡便易行，在控制及凈化世界范圍PR的流行中起到至關重要的作用。目前，已經(jīng)報道的PR弱毒疫苗有Bartha-K61株、Bucharest株和JS-2012-F120株。其中Bartha-K61和Bucharest株弱毒疫苗應用最為廣泛[17-18]。

Bartha株是由匈牙利科學家Bartha于1961年分離的強毒株經(jīng)雞胚細胞傳代致弱的[19]。致病力試驗結果顯示，Bartha株對部分小動物仍有一定的致病性，例如對小于4月齡的狗和貓以及小于2 kg家兔可引起50%發(fā)病死亡或麻痹；但對其他動物的癢癥誘發(fā)力已消失。研究表明，該疫苗免疫后7 d就可產生抗體，5周可以達到高峰，且高水平的抗體可以維持長達2個月以上[20]。近年來，研究者用分子生物學技術分析該疫苗株的基因結構，發(fā)現(xiàn)該疫苗基因組中US區(qū)存在整個gE基因缺失，11 k和部分gI、28 k片段的缺失；在UL區(qū)gC基因信號肽存在點突變，UL21存在8個點突變[21-23]，UL10即gM基因也存在點突變[24]。由于gE、gC基因是PRV的重要毒力基因，因此，gE基因的缺失及gC基因的點突變可能導致該毒株的毒力下降。

Bucharest株弱毒疫苗是由羅馬尼亞的布加勒斯特獸醫(yī)所通過將PR強毒株在雞胚尿囊膜上培養(yǎng)至200 代后致弱而成。Bucharest株的基因特點同Bartha-K61株相似，也在US區(qū)絕大部分的gE基因發(fā)生缺失。該疫苗同樣存在一定的毒力，對小鼠、豚鼠和家兔有一定較強的毒力；在豬上僅適用于9 日齡以上的仔豬和妊娠2月的母豬[25]。

JS-2012-F120株弱毒疫苗是2017年由LIANG C等[26]將親本毒JS-2012株在vero細胞上處于40 ℃的條件下連續(xù)傳代120代研制成功的。利用PCR和序列分析發(fā)現(xiàn)，該疫苗株發(fā)現(xiàn)缺失了2 307 bp，這段缺失的范圍是從gE基因的487位核苷酸到US2基因的531位核苷酸之間。用105TCID50 JS-2012-F120接種2周齡的哺乳仔豬后發(fā)現(xiàn)，該疫苗株對仔豬無任何不良反應，而且能同時保護免疫豬被經(jīng)典PRVSC株和變異PRVJS-2012株的攻擊。

Bartha-K61株疫苗是20世紀70年代末由中國農科院哈爾濱獸醫(yī)研究所的袁慶志等[27]從匈牙利引進并研制成的弱毒疫苗，目前在我國廣泛使用，是我國PR防控中應用最多的疫苗[28]，對經(jīng)典PR強毒具有良好的免疫保護效果，但對我國2011年以來流行的PR強毒株，免疫保護效果不佳[10-12]。Bucharest疫苗是用雞胚培養(yǎng)后制成的凍干苗，目前在我國應用范圍不廣。

3 基因工程缺失疫苗

PR基因工程缺失疫苗是利用基因工程操作技術將PRV基因中對生長非必需毒力基因或糖蛋白基因進行切除或插入，使其徹底失活，但又保持PRV的免疫原性而獲得的疫苗。已經(jīng)報道的PRV基因缺失疫苗主要有3種：單基因缺失疫苗、雙基因缺失疫苗和多基因缺失疫苗。目前，我國市場上應用的主要是HB-98株雙基因缺失疫苗（TK基因和gG基因）和剛上市的SA215株三基因缺失疫苗（gE基因、gI基因和TK基因）。

3.1 單基因缺失疫苗

PR單基因缺失疫苗其代表疫苗株是PRV BUK-d13株，該疫苗是20世紀80年代Kit等[29]將強毒株PRV-BUK TK中的基因缺失掉148 bp基因序列構建所得。動物試驗證明該疫苗對豬安全，并能提供有效的保護，5～6周齡豬在免疫接種該疫苗后能產生中和抗體，在攻毒后可以表現(xiàn)出再次免疫應答能力。在國內，周復春[30]和王琴等[31]先后用分離的強毒株Ea株和Fa株構建了TK基因缺失疫苗，動物試驗證明對小鼠有保護作用。但是該疫苗有個致命的缺點，即無法區(qū)別PR疫苗免疫接種豬和野毒感染豬，原因在于TK基因屬于酶蛋白基因，不能在豬體內產生相應的抗體。

3.2 雙基因缺失疫苗

PR雙基因缺失疫苗相比PR單基因疫苗有很大優(yōu)點，由于缺少2個毒力基因，因而所構建的疫苗毒力進一步降低，對免疫動物安全性也更高。另外，在非編碼必需糖蛋白的基因內引入了一個新的缺失或插入一個報告基因，這樣得到的突變株疫苗免疫動物后就不能產生被缺失的糖蛋白抗體，從而可以通過血清學方法將免疫豬與野毒感染豬相區(qū)分。1987年Kit S等[32]在PRV-d13株的基礎上，通過缺失gC基因序列的1 100 bp，構建了PRV-delTK/gC雙基因缺失疫苗株，動物試驗證明該缺失疫苗接種動物后不能產生抗gC的抗體。何啟蓋[33]用經(jīng)典強毒株Ea株構建了TK和gG雙基因缺失株PRV HB-98株。該疫苗株動物試驗表明應用比較安全，且免疫原性表現(xiàn)優(yōu)良，例如用病毒量為107.0 TCID50的PRV HB-98株接種BALB/c小鼠不會引起小鼠死亡，其毒力明顯低于Bartha-K61株。同樣，用病毒量為107.0TCID50PRV HB-98株接種妊娠50～60 d母豬和1日齡仔豬，母豬均能正常產仔，仔豬也未出現(xiàn)任何臨床癥狀；用病毒含量為105.0 TCID50的PRV HB-98株免疫妊娠50～60 d母豬和1日齡仔豬，分別在免疫后28，20 d，用107.0 TCID50 PRV-Ea株強毒進行攻擊，結果所有免疫豬均得到良好的保護，未表現(xiàn)異常狀況[34]。該疫苗株于2006年獲得國家新獸藥注冊證書和生產許可證[35]，目前在我國應用較為廣泛。近年，有學者用分離的PRV變異株構建PR雙基因缺失疫苗在動物試驗中表現(xiàn)出良好免疫原性，例如2014年Wang等[16]用PRV變異株TJ株構建的rPRVTJ-delgE疫苗以103，104和105TCID50 的劑量分別免疫6周齡仔豬，1 周后用TJ株攻擊，結果所有免疫豬均未表現(xiàn)出任何臨床癥狀。2016年Tong W等[36]用分離的變異株PRV JS-2012株構建了gE和gI雙基因缺失苗株PRV-JS-2012-△gE/gI，用病毒含量為105.0TCID50的該疫苗株鼻內接種2周齡小豬，4周后同樣用病毒含量為105.0TCID50PRV經(jīng)典強毒株SC株和PRV親本變異株JS-2012株鼻內攻擊免疫豬，結果免疫豬均得到100%的保護。

3.3 三基因缺失疫苗

2003年陳陸[37]將PRV-Fa株通過酶切、同源重組等基因操作方法，去掉其主要毒力基因gE、gI和TK，構建了獨特的三基因缺失株SA215。該疫苗已經(jīng)獲得國家二類新獸藥證書，也是第一個在我國注冊上市的PRV三基因缺失疫苗。該疫苗臨床應用證明對1日齡仔豬、妊娠60 d的母豬、牛、羊以及家兔均安全，無任何反應，接種動物不排毒。用病毒含量為105PFU的SA215株疫苗肌注免疫的3周齡豬，免疫對照組用Bartha株，4周后再用病毒含量為107PFU PRV-Fa強毒株鼻內攻擊所有免疫豬，攻毒后所有攻毒試驗豬均出現(xiàn)一過性發(fā)熱期、增重受阻和散毒，但免疫SA215株疫苗的發(fā)熱期、增重受阻天數(shù)和散毒的滴度均低于Bartha株疫苗免疫豬[38]。2015年Zhang C L等[39]利用BAC技術將分離的變異PRV HN1201株缺失了TK、gE和gI 3個基因，構建了三基因缺失疫苗vPRV HN1201TK-/gE-/gI-株。用劑量為107.0 TCID50 的該疫苗經(jīng)滴鼻免疫9日齡哺乳仔豬，4周后用同樣劑量的親本毒變異PRV HN1201株鼻內攻擊，結果免疫組的豬中只有2/5的豬出現(xiàn)一過性的體溫增高，再無其他癥狀，且攻毒14 d后免疫豬的PRV gE抗體均為陰性。胡睿銘[40]利用基因同源重組技術將變異PRV SMX/2012株缺失了TK、gE和gI基因后構建了基于變異株的三基因缺失疫苗rSMX△gI/gE△TK株，該疫苗安全性較高，使用劑量為107.0 TCID50接種小鼠和家兔，均未有不良反應。用劑量為108.0 TCID50接種綿羊，同樣未有任何臨床癥狀。同樣，用劑量為108.0 TCID50經(jīng)滴鼻或肌注接種1日齡仔豬和妊娠母豬，均未有任何不良反應，且同窩或同群豬未檢測到PRV抗體。該疫苗的免疫效力明顯優(yōu)于Bartha-K61株，例如用該疫苗劑量為106.0 TCID50 肌注免疫21日齡的仔豬，對照組用劑量為106.3 TCID50 Bartha-K61株免疫，免疫后28 d用107.0 TCID50劑量的親本毒PRV SMX/2012滴鼻攻擊所有免疫豬。結果顯示，rSMX△gI/gE△TK免疫豬僅出現(xiàn)一過性體溫略升高，沒有超過41 ℃，攻毒后3 d的排毒峰值為103.3TCID50，而Bartha-K61株免疫豬攻毒后體溫升高至41 ℃以上，且有嚴重的呼吸癥狀，3/5的豬只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，且持續(xù)了4～6 d，雖未造成死亡，但也失去飼養(yǎng)價值。Cong等[41]在變異PRV雙基因缺失疫苗rPRVTJ-delgE/gI株的基礎上刪除了TK基因，構建了rPRVTJ-delgE/gI/TK。該疫苗株相對于其親本rPRVTJ-delgE/gI株安全性有了很大的提升，例如rPRVTJ-delgE/gI/TK株對小鼠的LD50高于106.0 TCID50，而rPRVTJ-delgE/gI株對小鼠的LD50為104.13TCID50；用105.0 TCID50的rPRVTJ-delgE/gI/TK株疫苗和rPRVTJ-delgE/gI株分別接種18月齡的綿羊，結果rPRVTJ-delgE/gI接種綿羊全部死亡，而rPRVTJ-delgE/gI/TK接種羊全部存活，且未表現(xiàn)出任何臨床癥狀。

4 結論與展望

PR是威脅世界養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一，該病在傳入我國后，曾經(jīng)給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，但在以Bartha-K61株為主的基因缺失疫苗得到廣泛應用以后，該病在我國得到很好的控制，許多豬場還完成了偽狂犬野毒的凈化。然而，2011年以來豬偽狂犬病的重新流行和反彈，使我國養(yǎng)豬業(yè)再次蒙受嚴重的損失。研究發(fā)現(xiàn)，PRV流行株基因組已經(jīng)發(fā)生變異，現(xiàn)有商品化疫苗不能完全保護免疫豬抵抗新的PRV流行株的攻擊，因此，如何防控PR的發(fā)生和流行，研究開發(fā)針對PRV流行株的偽狂犬病疫苗，迫在眉睫。令人欣喜的是，近兩年來我國獸醫(yī)科研工作者已經(jīng)在預防PR疾病和凈化PR方面取得重要進展，新的PR流行變異株基因缺失疫苗也相繼被研究成功，雖然新疫苗距離臨床使用仍需一段時間，但相信在廣大獸醫(yī)研究工作者的共同努力下，新的PR流行株疫苗將在PR預防、控制和凈化過程中發(fā)揮重要作用。

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