血管生成素1對(duì)大鼠血-脊髓屏障功能的增強(qiáng)作用

徐婉茹

血管生成素1對(duì)大鼠血-脊髓屏障功能的增強(qiáng)作用

徐婉茹

目的：探討血管生成素1（Ang1）對(duì)大鼠血-脊髓屏障功能的增強(qiáng)作用，及表皮生長因子受體通路底物8（Eps8）在此增強(qiáng)過程的作用。方法：分離、培養(yǎng)大鼠脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞（SCMEC），建立體外血-脊髓屏障模型。以Ang 1處理的SCMEC為Ang1處理組，未處理的為對(duì)照組。于Ang1處理后于不同時(shí)間點(diǎn)（0 h、4 h、8 h、12 h）測定各組跨內(nèi)皮電阻（TEER）值，比較2組Eps8蛋白的表達(dá)水平。再將SCMEC分為對(duì)照siRNA組、對(duì)照siRNA+Ang1組、Eps8 siRNA組及Eps8 siRNA+Angl組，分別給予siRNA干擾Eps8表達(dá)及Ang 1處理，比較不同組間Eps8蛋白的表達(dá)水平與TEER值。結(jié)果：Ang1處理組4 h、8 h、12 h SCMEC的TEER值均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），Eps8蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）。Eps8 siRNA組SCMEC中Eps8蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照siRNA組（P＜0.05），而與Eps8 siRNA+Ang1組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Eps8 siRNA組不同時(shí)間點(diǎn)TEER值均明顯低于對(duì)照siRNA組（P＜0.05）；Eps8 siRNA+Ang1組與Eps8 siRNA組間TEER值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：Ang1可增強(qiáng)大鼠血-脊髓屏障的功能，其機(jī)制可能與Eps8有關(guān)。

表皮生長因子受體通路底物8；血管生成素1；血-脊髓屏障功能；大鼠

血-脊髓屏障是血-腦屏障的延伸，主要由微血管內(nèi)皮細(xì)胞間及星形膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，能有效阻止細(xì)胞旁路的物質(zhì)交換，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。血-脊髓屏障功能的異?？蓪?dǎo)致多種脊髓病變[1]。內(nèi)皮細(xì)胞間連接蛋白及細(xì)胞骨架表達(dá)量、分布等均可增高內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，進(jìn)而引發(fā)相關(guān)疾病[2]。血管生成素1（Angiopoietin，Ang1）是1種血管生成因子，可在多種條件下誘導(dǎo)新血管生成。Ang1在血-脊髓屏障中，可與相關(guān)受體結(jié)合，以維持屏障完整性的穩(wěn)定[3]。表皮生長因子受體通路底物8（EGF receptor pathway substrate 8，Eps8）與血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）結(jié)合后，可使細(xì)胞的DNA合成和癌化能力增加。Eps8在多種實(shí)體腫瘤中異常高表達(dá)，并通過各種通路調(diào)節(jié)促使腫瘤細(xì)胞生長和遷移，被認(rèn)為是腫瘤預(yù)后不良的指標(biāo)之一[4]。本研究以大鼠脊髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞（spinal cord microvascularendothelial cell，SCMEC）為研究對(duì)象，建立體外血-脊髓屏障模型，以探討Ang1對(duì)血-脊髓屏障的通透性的影響及Eps8在此過程中可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑設(shè)備

成年SD大鼠80只，體質(zhì)量275～300 g，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，動(dòng)物合格證書編號(hào)為SCXK(遼)2008-0005。DMEM/F12培養(yǎng)基購于美國Sigma公司，堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、Angl、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）購于美國Peprotech公司；山羊抗大鼠β-actin抗體、?？股窖騃gG購于美國Santa Cruz公司；DC蛋白定量試劑盒購于美國Bio-Rad公司；小鼠抗Eps8抗體購于美國BD公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購于美國Pierce公司。Millicell ERS-2細(xì)胞電阻儀、細(xì)胞培養(yǎng)皿購于美國Millicell公司；5417-R臺(tái)式低溫離心機(jī)購于德國Eppendorf公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo Scientific公司；VS-1300U超凈工作臺(tái)購于浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；BX51熒光顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SCMEC的分離培養(yǎng)與鑒定 成年SD大鼠CO2窒息處死后手術(shù)分離椎管，分離脊髓組織，去除腦脊膜及大血管。冷DMEM/F12培養(yǎng)液中將組織剪碎至1 mm3左右，冰上勻漿，置于37℃Ⅱ型膠原酶中消化0.5 h。低速離心5 min，22%BSA重懸組織沉淀，再次離心后棄留下層血管組織，并用DMEM/F12培養(yǎng)液清洗。用無菌濾器過濾，以收集微血管組分。置于37℃、0.1%膠原酶及脂肪酶中消化30 min，待內(nèi)皮細(xì)胞呈串珠樣時(shí)低速離心5 min后終止消化。SCMEC培養(yǎng)液（成分包括DMEM/F12、10%胎牛血清、1 mg/mL肝素、3μmol/L嘌呤霉素、2 mmol/L谷氨酸鈉、10%馬血清、10 ng/mL VEGF、1 ng/mLbFGF、50 mg/mL慶大霉素），微血管組分接種于纖連蛋白及預(yù)鋪Ⅳ型膠原的培養(yǎng)平板。培養(yǎng)6 d后采用免疫熒光法觀察因子Ⅷ表達(dá)，待SCMEC培養(yǎng)純度在95%以上時(shí)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.25g/L胰酶消化SCMEC，按不同密度分別傳代：1:1接種于6孔培養(yǎng)板用于蛋白樣品制備以進(jìn)行Western blotting檢測；1:1接種于Millicell插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，建立體外血-脊髓屏障模型，用于跨內(nèi)皮電阻（TEER）值及通透性檢測；1:5接種于蓋玻片用于纖維型肌動(dòng)蛋白（F-actin）熒光染色。

1.2.2 Ang1處理培養(yǎng)SCMEC 于培養(yǎng)的第7天用含100 ng/mL Ang1的培養(yǎng)液處理SCMEC12 h，設(shè)置為Angl處理組，于不同時(shí)間點(diǎn)（0、4、8、12 h）測定處理后TEER值的變化；其余未用Ang1處理者設(shè)置為對(duì)照組。

1.2.3 TEER值測定 在Angl處理后不同時(shí)間（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)平行孔），于培養(yǎng)內(nèi)室及外室連接細(xì)胞電阻儀（Millicell ERS-2）的正負(fù)電極，記錄待測孔電阻值（Ru），并計(jì)算各組TEER值，其中未接種細(xì)胞空白孔電阻值、培養(yǎng)面積分別計(jì)為Rc、S。

1.2.4 Western blot檢測 分別收集Angl處理組及對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)SCMEC，NP-40裂解液處理后提取總蛋白，蛋白濃度用BCA定量法測定后制備樣品。SDSPAGE電泳上樣量30μg，分離蛋白成分，轉(zhuǎn)印至PVDF膜、封閉，依次經(jīng)小鼠抗Eps8抗體（1:1000）、HRP標(biāo)記的牛抗小鼠IgG（1:3000）孵育后進(jìn)行ECL顯色（β-actin為內(nèi)參）；將0 h時(shí)刻樣品Eps8與β-actin灰度值比值設(shè)定為1。

1.2.5 siRNA轉(zhuǎn)染 靶向大鼠Eps8的siRNA（5’-TTCGTGCCAAATAACATTCTGGATA-3’）及對(duì)照siRNA（5’-TTCTTCTCCGAACGTGTCACGTCCA-3’）均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。于SCMEC培養(yǎng)第4天時(shí)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染：在Opti-MEM培養(yǎng)液中混勻siRNA及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，以終濃度100 nmol/L轉(zhuǎn)染，12 h后更換為正常培養(yǎng)液；繼續(xù)培養(yǎng)至第7天時(shí)對(duì)部分細(xì)胞進(jìn)行Ang1（100 ng/mL）處理，分為對(duì)照siRNA組、對(duì)照siRNA+Ang1組、Eps8 siRNA組及Eps8 siRNA+Ang1組。處理4 h后收集細(xì)胞，Westem blotting檢測Eps8蛋白的表達(dá)水平及TEER值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SCMECs的形態(tài)學(xué)鑒定

培養(yǎng)的第1天，微血管片段呈串珠狀或分支狀，見圖1A；2 d后SCMECs從微血管片段中爬出，細(xì)胞呈梭形單層貼壁生長，見圖1B；第5天起細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈“鵝卵石”狀，見圖1C；第7天起細(xì)胞匯合緊密，呈“漩渦狀”，見圖1D。因子Ⅷ相關(guān)抗原免疫熒光染色驗(yàn)證所培養(yǎng)細(xì)胞為SCMECs，見圖1E。

2.2 Ang1處理后SCMEC屏障模型功能的變化

Ang1處理組4 h、8 h、12 h SCMEC的TEER值均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 Angl處理后Eps8表達(dá)水平的變化

Angl處理組4 h、8 h、12 h SCMEC的Eps8蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2，圖2。

2.4 Eps8沉默對(duì)Ang1增強(qiáng)SCMEC屏障模型功能作用的影響

Eps8沉默處理后，各組SCMEC中Eps8蛋白的表達(dá)存在顯著性差異（P＜0.05）；Eps8 siRNA組Eps8蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照siRNA組（P＜0.05），而與Eps8 siRNA+Ang1組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)照siRNA+Ang1組SCMEC中Eps8蛋白的表達(dá)水平明顯高于其他各組（P＜0.05），見表3。各組F-actin熒光染色結(jié)果見圖4。

2.5 Eps8沉默對(duì)TEER測定結(jié)果的影響

Eps8沉默處理后，各組間TEER值存在顯著性差異（P＜0.05）；Eps8 siRNA組不同時(shí)間點(diǎn)TEER值均明顯低于對(duì)照siRNA組（P＜0.05）；Eps8表達(dá)減少后，TEER值對(duì)Ang1喪失敏感性，Eps8 siRNA+Ang1組與Eps8 siRNA組間TEER值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

3 討論

圖2 對(duì)照組與Ang1處理組不同時(shí)間點(diǎn)Eps8蛋白免疫印跡條帶

表1 Ang1處理后SCMEC的TEER值比較（Ω·cm2，±s）

表1 Ang1處理后SCMEC的TEER值比較（Ω·cm2，±s）

組別對(duì)照組Ang1處理組t值P值孔數(shù)33 0 h 46.52±5.96 47.20±5.15 1.654 0.278 4 h 47.74±5.82 57.63±6.26 15.851＜0.001組別對(duì)照組Ang1處理組t值P值8 h 50.74±5.84 64.41±6.52 19.430＜0.001 12 h 52.41±5.63 65.41±6.93 38.564＜0.001

表2 Angl處理后Eps8表達(dá)水平的變化（±s）

表2 Angl處理后Eps8表達(dá)水平的變化（±s）

組別對(duì)照組Ang1處理組t值P值孔數(shù)33 0 h 1.00±0.00 1.04±0.35 0.263 0.634 4 h 1.32±0.41 1.93±0.86 13.620＜0.001組別對(duì)照組Ang1處理組t值P值8 h 1.42±0.64 1.91±0.92 15.513＜0.001 12 h 1.46±0.63 2.90±1.01 29.120＜0.001

表3 Eps8沉默后各組Eps8蛋白表達(dá)量比較（±s）

表3 Eps8沉默后各組Eps8蛋白表達(dá)量比較（±s）

組別對(duì)照siRNA組對(duì)照siRNA+Ang1組Eps8 siRNA組Eps8 siRNA+Ang1組F值P值孔數(shù)15 15 15 15相對(duì)灰度值1.00±0.00 2.01±0.24 0.26±0.05 0.28±0.08 29.120＜0.001

圖4 各組F-actin熒光染色結(jié)果

表4 Eps8沉默對(duì)TEER各組的影響（Ω·cm2，±s）

表4 Eps8沉默對(duì)TEER各組的影響（Ω·cm2，±s）

組別 孔數(shù)0 h 4 h對(duì)照siRNA組對(duì)照siRNA+Ang1組Eps8 siRNA組Eps8 siRNA+Ang1組F值P值15 15 15 15 27.96±3.20 28.03±3.35 21.84±2.84 21.96±2.93 5.002 0.024 35.63±4.21 46.61±5.20 25.41±3.28 27.14±3.19 15.521＜0.001組別對(duì)照siRNA組對(duì)照siRNA+Ang1組Eps8 siRNA組Eps8 siRNA+Ang1組F值P值8 h 41.65±5.17 50.30±5.82 33.20±4.01 34.08±4.15 21.249＜0.001 12 h 42.10±5.09 49.74±5.42 32.85±3.41 33.10±3.20 18.413＜0.001

近年來人們已經(jīng)成功建立了模擬血-脊髓屏障的體外模型。本研究通過對(duì)培養(yǎng)成熟SD大鼠脊髓微血管進(jìn)行分離，并消化培養(yǎng)SCMEC，并于雙室培養(yǎng)系統(tǒng)中共培養(yǎng)將SCMEC和膠質(zhì)細(xì)胞，通過測定TEER值反映內(nèi)皮屏障功能，驗(yàn)證了Ang1對(duì)血-脊髓屏障功能的影響。

Ang1基因位于染色體8q22，主要在周細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞可見，在維持血管穩(wěn)定、血管發(fā)生及分支形成中發(fā)揮著重要的作用。轉(zhuǎn)基因研究證實(shí)，血管增生變粗的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物Ang1呈過度表達(dá)，且內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞的連接完整；而小鼠在出現(xiàn)Ang1基因缺失后會(huì)出現(xiàn)血管通透性增高且無法連續(xù)形成血管網(wǎng)[5-7]。由此推斷Ang1在維持血管穩(wěn)定性方面具有重要作用。此外，Ang1可通過將磷脂酰肌醇激酶（PI3K）激活，使柱蛋白磷酸化，使內(nèi)皮-基質(zhì)間的相互作用增強(qiáng)，從而維持血管結(jié)構(gòu)的完整性[8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Ang1可限制小分子物質(zhì)通透，從而參與維持了血-腦屏障的功能完整[9]。本研究結(jié)果顯示，Ang1處理組4 h、8 h、12h SCMEC的TEER值均明顯高于對(duì)照組有顯著升高（P＜0.05）。提示Ang1處理后，血-脊髓屏障功能明顯增強(qiáng)。

在血-腦屏障或血-脊髓屏障的構(gòu)成中，細(xì)胞間連接結(jié)構(gòu)及相應(yīng)的細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)在屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有重要作用。其中F-actin參與形成了多種類型的骨架結(jié)構(gòu)，依賴于與之結(jié)合的各種調(diào)節(jié)蛋白（actin binding proteins，ABPs），從多方面影響著內(nèi)皮的屏障功能[10,11]。Eps8是一種已知的促進(jìn)F-actin成束的ABP。在關(guān)于大鼠血-睪屏障的研究中發(fā)現(xiàn)，Eps8參與維持了睪丸支持細(xì)胞上皮屏障的完整性，并對(duì)生精細(xì)胞與支持細(xì)胞間的粘附發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[12]。本研究通過應(yīng)用Ang1處理SCMEC后，Ang1處理組4 h、8 h、12 h SCMEC的Eps8蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）。

進(jìn)一步的F-actin熒光染色顯示，對(duì)照siRNA+Angl組SCMEC中F-actin在細(xì)胞接觸及連接處的分布明顯強(qiáng)于對(duì)照siRNA組明顯增強(qiáng)，Eps8siRNA+Angl組與Eps8siRNA組則無顯著差別。提示Ang1有可能通過影響Eps8的表達(dá)而改變F-actin在SCMEC連接處的分布，進(jìn)而影響血-脊髓屏障功能。為了進(jìn)一步加以驗(yàn)證，在隨后的實(shí)驗(yàn)中，使用siRNA對(duì)SCMEC中Eps8的表達(dá)進(jìn)行了干擾，再次使用Ang1處理，結(jié)果顯示ps8 siRNA組SCMEC中Eps8蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照siRNA組（P＜0.05），而與Eps8 siRNA+Ang1組間并無顯著性差異；此外，Eps8 siRNA組不同時(shí)間點(diǎn)TEER值均明顯低于對(duì)照siRNA組（P＜0.05）；Eps8 siRNA+ Ang1組與Eps8 siRNA組間TEER值無顯著性差異。說明Eps8的水平升高是Ang1增強(qiáng)血-脊髓屏障功能的必要因素。

綜上所述，Ang1可通過影響SCMEC中Eps8的表達(dá)水平改變連接蛋白在大鼠血-脊髓屏障內(nèi)皮細(xì)胞連接處的分布，從而影響血-脊髓屏障的通透性及屏障功能。但關(guān)于Eps8表達(dá)增高的具體發(fā)生機(jī)制及Eps8沉默在SCMEC中所引起的其他與血-脊髓屏障功能相關(guān)的分子變化仍需進(jìn)一步的研究加以闡明。

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（本文編輯：唐穎馨）

Effect of Erythropoietin1 on the Function of Blood Spinal Cord Barrier in Rats

XU Wan-ru.
Department of Neurology,Heze city hospital,Shandong 274000,China

Objective:To investigate the effect of Angiopoietin 1(Ang1)on the function of blood spinal cord barrier(BSB)in rats.Methods:Spinal cord microvessel endothelial cells(SCMECs)of rats were separated and cultured to build the three-dimensional external blood spinal cord barrier model.SCMECs in Ang 1 group were treated with Ang 1 and those in control group were not treated with Ang 1.And then,SCMECs were divided into control siRNA group,control siRNA+Ang group 1,Eps8 siRNA group and Eps8 siRNA+Angl group,in which siRNA was added to interfere Eps8 expression and/or Ang 1 treatment.The transepithelial electrical resistance (TEER)values and the expression of EGF receptor pathway substrate 8(Eps8)were detected at 0,4,8 and 12 h after treatment.Results:The TEER values and the Eps8 expression of Ang1 group at 4 h,8 h and 12 h were significantly higher than those in the control group(P＜0.05).The Eps8 expression in the Eps8 siRNA group was significantly lower than that in the control siRNA group(P＜0.05).The TEER values of siRNA group at 4 h,8 h and 12 h were significantly lower than those in the control siRNA group(P＜0.05).Conclusion:Ang1 has an effect on the permeability and barrier function of BSB.Eps8 maybe plays an important role in it.

EGF receptor pathway substrate 8;Angiopoietin 1;blood spinal cord barrier function;rat

R741；R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2017.04.003

菏澤市立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi) 山東 菏澤 274000

2016-12-15

徐婉茹490983190@qq. com