烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中多酚類物質(zhì)及其相關(guān)酶活性的變化

袁衛(wèi)瑜，王興德，李軍營(yíng)，蔡慶生，周 宏，焦旭勇

(1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650031；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.云南省煙草公司玉溪市公司華寧縣分公司，云南 華寧 652800；4.湖南省煙草職工培訓(xùn)中心，湖南 湘潭 411104)

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烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中多酚類物質(zhì)及其相關(guān)酶活性的變化

袁衛(wèi)瑜1,2，王興德3，李軍營(yíng)1*，蔡慶生2，周 宏4，焦旭勇1,2

(1.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650031；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；3.云南省煙草公司玉溪市公司華寧縣分公司，云南 華寧 652800；4.湖南省煙草職工培訓(xùn)中心，湖南 湘潭 411104)

【目的】明確烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中葉片多酚類物質(zhì)含量及其相關(guān)酶活性的變化規(guī)律，為確定云南產(chǎn)區(qū)適熟煙葉物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)?！痉椒ā吭谔镩g采集不同發(fā)育階段的煙葉，同時(shí)在采收期設(shè)定常規(guī)采收和延遲7、14 d采收3個(gè)處理，跟蹤測(cè)定了煙葉中主要多酚類物質(zhì)含量及其代謝相關(guān)酶活性，并進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析。【結(jié)果】打頂措施大幅提升煙葉中多酚含量，其中新綠原酸、綠原酸、蕓香苷反應(yīng)明顯，莨菪亭含量不受打頂措施的影響；打頂后煙葉多酚含量逐漸回落至較低水平，并維持到煙葉進(jìn)入成熟期；隨著煙葉成熟度的增加(由常規(guī)采收至延遲14 d采收)，中部葉多酚總量總體呈上升趨勢(shì)，上部葉在這段時(shí)期呈下降趨勢(shì)；除莨菪亭外，中部和上部葉PAL活性與其他酚類物質(zhì)含量均呈正相關(guān)；中部和上部葉PPO活性與酚類物質(zhì)含量均呈負(fù)相關(guān)?！窘Y(jié)論】煙葉中多酚含量隨成熟度增加呈規(guī)律性變化，打頂可短暫提升煙葉多酚類物質(zhì)含量，莨菪亭的變化規(guī)律不同于其它幾類多酚類物質(zhì)，多酚類物質(zhì)含量受煙葉中多酚合成和降解酶活性控制。

烤煙；酚類；苯丙氨酸解氨酶；多酚氧化酶

【研究意義】煙葉中的多酚類物質(zhì)是優(yōu)質(zhì)煙葉品質(zhì)形成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，煙葉成熟度密切相關(guān)，研究煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中多酚物質(zhì)含量及其代謝特征，對(duì)明確多酚類物質(zhì)代謝與煙葉成熟度的關(guān)系具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)學(xué)者通常從比較不同成熟度煙葉的外觀質(zhì)量以及烤后煙葉化學(xué)成分等方面來(lái)確定煙葉成熟采收的標(biāo)準(zhǔn)[1～6]。多酚類物質(zhì)作為煙葉重要的煙葉化學(xué)成分之一，對(duì)煙葉品質(zhì)具有重要影響，通過(guò)影響煙葉生長(zhǎng)發(fā)育和烘烤特性，進(jìn)而對(duì)煙葉外觀質(zhì)量、煙氣質(zhì)量和風(fēng)格起著重要作用[7]。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化多酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，對(duì)煙葉中多酚類物質(zhì)含量調(diào)控起限速作用[8]。多酚氧化酶(PPO)是催化多酚類物質(zhì)降解的關(guān)鍵酶，參與多酚類物質(zhì)的氧化，對(duì)煙葉的色度、色澤有重要影響[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】成熟度作為煙葉質(zhì)量的核心因素，對(duì)煙葉多酚也有重要影響[10]，不同成熟度煙葉中多酚物質(zhì)含量差異較大，研究烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中多酚類物質(zhì)及其代謝關(guān)鍵酶活性變化，對(duì)明確優(yōu)質(zhì)煙葉適宜成熟度具有重要意義?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】文章通過(guò)研究不同發(fā)育階段葉片多酚物質(zhì)含量及其代謝關(guān)鍵酶活性的變化規(guī)律，為確定云南產(chǎn)區(qū)適熟煙葉的物質(zhì)代謝基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地點(diǎn)位于云南省玉溪市峨山縣小街鎮(zhèn)，試驗(yàn)時(shí)間為2012年，采用的烤煙品種為云煙87。田間試驗(yàn)土壤酸堿度為6.87，堿解氮160.13 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量為4.33%，速效鉀83.55 mg/kg，速效磷24.87 mg/kg。 移栽時(shí)間為4月24日，打頂時(shí)間為6月30日左右，種植密度為行距120 cm×株距50 cm，施肥量為90 kg純氮/hm2，基追比為5∶5，追肥分2次兌水澆施。其余管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)要求進(jìn)行。

1.2 樣品采集與分析

在移栽后65 d時(shí)，分別掛牌標(biāo)記自下而上第11和18片葉，分別代表中部葉和上部葉，之后每隔7 d采集煙葉樣品1次，至移栽后100 d時(shí)結(jié)束不同生育階段樣品采集，然后再分別于中、上部葉的常規(guī)成熟、延遲7 d和延遲14 d各取樣1次，用于代表不同部位的不同成熟度煙葉。取樣時(shí)，先將葉片表面擦拭干凈，去掉葉片尖部和基部，沿主脈將煙葉分成兩部分，一部分用液氮固定，一部分殺青、烘干處理，用于多酚類物質(zhì)(包括多酚總量、新綠原酸、綠原酸、莨菪亭和蕓香苷)含量的測(cè)定。液氮固定的鮮樣用于PPO和PAL活性測(cè)定。

N代表正常成熟，D7和D14分別代表延遲7、14 d采收。下同N, D7 and D14 in the figure represents conventional mature, delayed for 7 and 14 days, respectively. The same as below圖1 烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中多酚總量的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of total polyphenols content during the growth of flue-cured tobacco

采用高效液相色譜法(YC/T202-2006)進(jìn)行多酚類物質(zhì)(包括多酚總量、新綠原酸、綠原酸、莨菪亭和蕓香苷)含量測(cè)定；PAL活性測(cè)定采用紫外分光光度法[11]，PPO活性測(cè)定采用鄰苯二酚氧化法[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中多酚類物質(zhì)含量的變化

2.1.1 多酚總量的變化 從圖1可以看出，在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，葉片中多酚總量總體呈明顯的先升后降，而后逐漸上升的變化趨勢(shì)。生產(chǎn)上受打頂措施的影響比較大，打頂會(huì)促使煙葉中多酚物質(zhì)的積累，圖中移栽后72 d時(shí)多酚總量明顯高于移栽后65 d的總量，之后打頂效應(yīng)逐漸減弱，多酚物質(zhì)含量大幅下降。隨著中部和上部葉的逐漸成熟，至移栽后100 d時(shí)，煙葉中多酚物質(zhì)總量處于一個(gè)穩(wěn)定時(shí)期，變化不明顯。葉片由正常成熟至延遲14 d采收時(shí)，中部葉多酚總量增加，而上部葉多酚總量略有減少。有研究提出多酚含量隨煙葉田間成熟度的提高而增加，達(dá)到充分成熟后含量降低，多酚含量的最高值可作為煙葉充分成熟的標(biāo)志，但本研究中成熟期多酚總量的變化趨勢(shì)并不明顯，這可能是由于酚類物質(zhì)含量受品種、栽培管理和環(huán)境因素的影響而引起的。

2.1.2 新綠原酸含量的變化 從圖2可以看出，打頂前后烤煙葉片新綠原酸含量變化急劇，打頂后5 d(即移栽后72 d)中部葉新綠原酸含量增加至2.47 mg/g，上部葉增加至2.54 mg/g，打頂后12 d(即移栽后79 d)新綠原酸含量均降至與打頂前同一水平。移栽79 d以后，烤煙中部和上部葉新綠原酸含量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)(除移栽后100 d略有下降外)，這種上升的趨勢(shì)在中部葉片中一直延續(xù)到延遲14 d采收時(shí)，延遲14 d采收的中部葉新綠原酸含量是移栽后79 d的6.0倍；總體來(lái)看，上部葉的新綠原酸含量明顯低于中部葉。

圖2 烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中新綠原酸含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of new chlorogenic acid content during the growth of flue-cured tobacco

圖3 烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中綠原酸含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of chlorogenic acid content during the growth of flue-cured tobacco

2.1.3 綠原酸含量的變化 從圖3可以看出，隨著煙葉的生長(zhǎng)發(fā)育，葉片中綠原酸含量變化趨勢(shì)與新綠原酸基本相同。打頂后，葉片中的綠原酸含量大幅上升，上部葉中綠原酸含量上升幅度明顯高于中部葉。打頂后(移栽后79 d)，葉片中的綠原酸含量大幅回落，在達(dá)到常規(guī)成熟時(shí)(移栽后79 d～移栽后100 d)，處于相對(duì)爭(zhēng)穩(wěn)定狀態(tài)。從常規(guī)成熟到延遲14 d采收這一時(shí)期，煙葉中的綠原酸含量明顯上升，以中部葉最為明顯，下部葉變化上升幅度較小。

2.1.4 莨菪亭含量的變化 從圖4可以看出，莨菪亭是多酚類物質(zhì)重要組成部分，移栽后65 d至常規(guī)成熟時(shí)，煙葉中莨菪亭含量呈上升趨勢(shì)，中、上部葉表現(xiàn)的變化規(guī)律相同。在移栽后100 d-常規(guī)成熟這段時(shí)間內(nèi)，中部和上部葉的莨菪亭含量上升幅度明顯加快，在常規(guī)成熟時(shí)，中、上部葉莨菪亭含量最大值，分別為0.13和0.14 mg/g。常規(guī)成熟-延遲14 d采收這一時(shí)期，莨菪亭含量由最大值開始下降，表明隨著煙葉成熟度的增加，葉片中莨菪亭含量呈下降趨勢(shì)，不同于綠原酸和新綠原酸。

圖4 烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中莨菪亭含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of scopoletin content during the growth of flue-cured tobacco

圖5 烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中蕓香苷含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic changes of rutin content during the growth of flue-cured tobacco

2.1.5 蕓香苷含量的變化 從圖5可以看出，蕓香苷含量變化趨勢(shì)與新綠原酸和綠原酸變化趨勢(shì)基本一致，受打頂措施的誘導(dǎo)效應(yīng)影響較大，在打頂后含量大幅上升，上部葉中蕓香苷含量上升幅度大于中部葉。打頂5 d(移栽后72 d)后，葉片中蕓香苷含量急驟下降，然后處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。在常規(guī)成熟至延遲14 d 采收這一時(shí)期，煙葉中蕓香苷含量略有提升，在延遲14 d采收時(shí)，中部葉的蕓香苷含量是移栽后79 d的2.8倍左右，上部葉的蕓香苷含量是移栽后79 d的2.7倍左右。

2.2 烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中多酚相關(guān)酶活性變化

2.2.1 葉片內(nèi)PAL活性的變化 PAL是催化多酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，從圖6可以看出，在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，PAL的活性呈明顯的多峰變化，峰值分別為打頂后5 d左右和常規(guī)成熟之后，中部葉為常規(guī)成熟時(shí)，上部葉為延遲7 d采收時(shí)。不同部位煙葉PAL活性的變化動(dòng)態(tài)基本一致，但在不同時(shí)期的活性值略有不同。在打頂前后，上部葉PAL活性明顯高于中部葉，這與這一時(shí)期多酚類物質(zhì)(綠原酸、新綠原酸、蕓香苷)含量上部葉高于中部葉的結(jié)果相一致。到成熟期前后(從移栽后93 d開始)，煙葉中PAL活性中部葉明顯高于上部葉，與這時(shí)期多酚類物質(zhì)含量變化趨勢(shì)相一致。以上結(jié)果表明，PAL活性對(duì)調(diào)控?zé)熑~多酚類物質(zhì)含量起著重要作用。煙葉成熟度過(guò)高(延遲14 d采收)時(shí)，PAL活性明顯降低，表明煙葉成熟度不能過(guò)高，否則不利于葉片中多酚類物質(zhì)的合成。

圖6 烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葉片PAL活性的變化Fig.6 The PAL activity in the process of flue-cured tobacco growth and development

部位Position酶活性Enzymaticactivity多酚總量Totalpolyphenolcontent新綠原酸含量Newchlorogenicacidcontent綠原酸含量Chlorogenicacidcontent莨菪亭含量Scopoletincontent蕓香苷含量Rutincontent中部葉PAL活性0．1400．2980．2610．516??0．319PPO活性-0．311-0．377-0．449?-0．288-0．311上部葉PAL活性0．610??0．705??0．712??0．462?0．727??PPO活性-0．669??-0．575??-0．622??-0．318-0．684??

注：表中“*”代表達(dá)到5%顯著水平，“**”代表達(dá)到1%顯著水平。

Note: ‘*’ in the table represents 5% significant level, ‘**’ represents 1% significant level.

2.2.2 葉片內(nèi)PPO活性的變化 PPO是葉片中多酚類物質(zhì)降解過(guò)程的關(guān)鍵酶，從圖7可以看出，在烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，中、上部葉PPO活性變化幅度不大，在打頂前后，PPO活性較低，這與當(dāng)時(shí)葉片中多酚類物質(zhì)合成處于優(yōu)勢(shì)狀態(tài)相對(duì)應(yīng)。不同部位間PPO活性存在明顯差異，表現(xiàn)為上部葉PPO活性明顯高于中部葉，這與以前的研究結(jié)果一致[15]。

2.3 酚類物質(zhì)含量與相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析

表1顯示了烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中多酚類物質(zhì)含量與PAL、PPO活性的相關(guān)性，通過(guò)簡(jiǎn)單相關(guān)分析可以看出，葉片中酚類物質(zhì)含量與葉片中PAL活性呈正相關(guān)關(guān)系，與PPO活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，部分指標(biāo)達(dá)到顯著水平。但總體來(lái)看，多酚類物質(zhì)含量與PAL、PPO活性的相關(guān)程度存在部位間的差異，二者相關(guān)程度上部葉明顯高于中部葉。中部葉僅莨菪亭和綠原酸分別與PAL和PPO活性達(dá)1%顯著水平的相關(guān)關(guān)系，而上部葉PAL活性與多酚總量、新綠原酸、莨菪亭、綠原酸和蕓香苷含量均呈1%顯著水平的正相關(guān)關(guān)系，PPO活性與多酚總量、新綠原酸、綠原酸以及蕓香苷含量呈1%顯著水平的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖7 烤煙生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葉片PPO活性的變化Fig.7 The PPO activity in the process of flue-cured tobacco growth and development

3 討 論

因多酚類物質(zhì)含量多少與煙葉品質(zhì)形成關(guān)系密切，所以有關(guān)煙葉中多酚類物質(zhì)代謝的相關(guān)研究較多[7,9-10,15-17]。煙葉中多酚類物質(zhì)含量受遺傳因素、生長(zhǎng)環(huán)境和生產(chǎn)措施等因素的影響較大，通過(guò)本試驗(yàn)的研究，可進(jìn)一步明確煙葉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，多酚類物質(zhì)含量受打頂、成熟進(jìn)程和部位差異的影響。打頂是煙葉生產(chǎn)上的一項(xiàng)主要技術(shù)措施，影響煙葉中物質(zhì)流的再分配，同時(shí)產(chǎn)生一種傷害信號(hào)，可誘導(dǎo)PAL等酶活性的上調(diào)，進(jìn)而利于多酚類物質(zhì)的大量合成，本文的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了此現(xiàn)象，打頂后5 d(移栽后72 d)多酚總量、新綠原酸、綠原酸和蕓香苷含量大幅積累，同時(shí)控制多酚類物質(zhì)生物合成的酶PAL活性明顯升高。不同生長(zhǎng)階段的煙葉多酚類物質(zhì)含量差異較大，以往研究結(jié)果表明，隨著煙葉的逐漸成熟，多酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果類似[19]，也有研究結(jié)果認(rèn)為，煙草多酚含量隨煙株生長(zhǎng)和煙葉成熟度的增加而增加，煙葉達(dá)到生理成熟后多酚的積累量開始下降[17]，這可能與所研究葉片的材料不同有關(guān)，本研究結(jié)果顯示，中部葉在過(guò)成熟時(shí)(延遲14 d采收)時(shí)葉片中多酚類物質(zhì)含量呈增加積累趨勢(shì)，而上部葉則呈略下降趨勢(shì)。

4 結(jié) 論

通過(guò)本研究，可以得到如下結(jié)論：①打頂可短暫提升煙葉多酚類物質(zhì)含量，莨菪亭的變化規(guī)律不同于其它幾類多酚類物質(zhì)；②煙葉中多酚含量隨成熟度增加呈規(guī)律性變化，但因部位不同略有差異。③煙葉中多酚類物質(zhì)含量與PAL和PPO酶活性成顯著相關(guān)，上部葉比中部葉更為明顯。酚類物質(zhì)及相關(guān)酶活性可作為判斷煙葉適宜的成熟采收時(shí)間的指標(biāo)，但并非唯一標(biāo)準(zhǔn)，判斷煙葉適宜采收時(shí)間還需要綜合參考烤煙生長(zhǎng)過(guò)程中化學(xué)成分含量和激素水平等多方面的變化規(guī)律，為煙葉適時(shí)采收提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Changes of Polyphenols and Related EnzymeActivities during Flue-cured Tobacco Growth

YUAN Wei-yu1,2, WANG Xing-de3, LI Jun-ying1*, CAI Qing-sheng2, ZHOU Hong4, JIAO Xu-yong1, 2

(1.Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650031, China; 2.College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Jiangsu Nanjing 210095, China; 3.Huaning Branch of Yuxi Tobacco Company, Yunnan Huaning 652800, China; 4.Employee Training Center of Hunan Tobacco, Hunan Xiangtan 411104, China)

【Objective】In order to define the suitable harvest time of flue-cured tobacco, polyphenols content and its related enzyme activity change of leaves during flue-cured tobacco growth process were studied. 【Method】Tobacco leaves of different growing stage from three harvest time treatments (normal, delay 7 d and delay14 d) were collected to measure the content of polyphenols and activity of polyphenols metabolism related enzyme.【Result】Results showed that topping could great stimulate polyphenols content, especially new chlorogenic acid, chlorogenic acid and rutin, but not including scopoletin. Polyphenols content decreased after topping, and maintained a low level in maturing stage. From normal harvest to delay 14 d, polyphenols content in middle part leaf increased, but decreased in upper part leaf. Except for scopoletin, PAL activity for both middle part leaf and upper part leaf correlated positively with polyphenols content. PPO activity for both middle part leaf and upper part leaf correlated negatively with polyphenols content. 【Conclusion】Polyphenols content was changed regularly with tobacco leaf maturing, and topping could stimulate transitorily polyphenols content, and scopoletin had a different change law from other polyphenols. The content of polyphenols was controlled by the activities of polyphenols related synthesis and degradation enzymes.

Flue-cured tobacco; Polyphenols; Phenylalanine ammonialyase; Polyphenol oxidase

1001-4829(2017)7-1528-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.011

2015-06-16

云南省煙草公司科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016YN28)；云南中煙科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016YL03)

袁衛(wèi)瑜(1987-)，女，河南舞鋼人，碩士，主要從事煙草栽培生理研究，E-mail:1530877729@qq.com，*為通訊作者：李軍營(yíng)，E-mail: 83754331@qq.com，主要從事煙草栽培研究，Tel:(0871)65106249。

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