生脈注射液對(duì)自體脂肪顆粒移植存活率的影響

林輝，張晶晶，李紅光（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院激光整形美容科，廣西 南寧 530022)

生脈注射液對(duì)自體脂肪顆粒移植存活率的影響

林輝，張晶晶，李紅光
（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院激光整形美容科，廣西 南寧 530022)

目的探索生脈注射液對(duì)自體脂肪顆粒移植存活率的影響。方法9只兔建立自體脂肪顆粒移植動(dòng)物模型，隨機(jī)分為3組，實(shí)驗(yàn)組肌肉注射不同劑量的生脈注射液，對(duì)照組肌肉注射生理鹽水。檢測(cè)血清中VEGF 含量，成活脂肪的質(zhì)量，計(jì)算移植脂肪的存活率。結(jié)果實(shí)驗(yàn)各組移植脂肪組織存活率和VEGF 含量均明顯高于對(duì)照組。結(jié)論生脈注射液可以明顯提高自體脂肪移植的存活率和存活質(zhì)量。

生脈注射液；脂肪移植；兔；存活率

近年來(lái)，中醫(yī)藥在促血管新生作用逐漸被引起重視，單味藥與方劑在促進(jìn)新血管生成及提高促血管新生因子表達(dá)方面的研究均取得較多進(jìn)展。生脈具有抑制促炎細(xì)胞因子和改善血流，增加機(jī)體抗缺氧能力，保護(hù)細(xì)胞，促進(jìn)血管新生等作用。但生脈注射液能否促進(jìn)自體脂肪移植的血管新生尚未有定論。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生脈注射液對(duì)于提高移植脂肪組織新生血管的形成有較大幫助，明顯提高兔自體脂肪移植的存活率和存活質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

生脈注射液（四川川大華西藥業(yè)股份有限公司）；VEGF的ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；磷酸鹽緩沖液、鹽酸氯胺酮注射液、健康新西蘭大白兔9只，雌雄不限，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量2.5～3.0Kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模兔術(shù)前先稱(chēng)重記錄，然后將兔固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。氯胺酮全麻滿(mǎn)意后，手術(shù)部位備皮，用碘伏將兔耳部及腹股溝消毒，鋪巾。于腹股溝切開(kāi)取出腹股溝脂肪團(tuán)約2.5ml，立即沖洗，剪碎，放入裝有生理鹽水的10ml注射器內(nèi)，繼續(xù)剪成直徑1mm左右的脂肪顆粒。裝有脂肪顆粒注射器放入離心機(jī)以800r/min離心3min后，去掉下層水、血液及破碎細(xì)胞成分等，吸去上層游離油脂。將脂肪顆粒導(dǎo)入1ml注射器內(nèi)，接16G注脂頓針頭由穿刺口進(jìn)入兔耳背皮下組織剝離，邊退針邊注射。兔雙耳背部移植區(qū)，共4處，每側(cè)耳背兩處移植區(qū)不相連，每處0.5ml。

1.2.2 分組9只兔建模成功后隨機(jī)分成3組：對(duì)照組3只行肌肉注射無(wú)菌水0.37ml·Kg-1·d-1；實(shí)驗(yàn)1組3只行肌肉注射生脈注射液0.37ml·Kg-1·d-1；實(shí)驗(yàn)2組3只行肌肉注射生脈注射液0.74ml·Kg-1·d-1，均每天用藥，連續(xù)用藥2周。

1.2.3 標(biāo)本采集與檢測(cè) 術(shù)后13周行脂肪移植塊標(biāo)本取材，于耳背皮下丘狀隆起中間處切開(kāi)，在包膜表面，頓性與銳性結(jié)合剝離，完整取下脂肪移植塊，修剪去表面包膜，然后用精密天平準(zhǔn)確測(cè)量脂肪移植塊質(zhì)量。移植脂肪存活率=移植后樣本質(zhì)量/移植前質(zhì)量×100%。移植塊稱(chēng)量后置入10%福爾馬林固定24h，經(jīng)過(guò)沖洗、脫水、浸泡、浸蠟、包埋和切片等步驟后，行HE染色。脂肪移植術(shù)后1周、2周、4周、6周、8周于耳緣靜脈采血，每只采血1ml，放入離心機(jī)以1 500 r/min離心5 min后，移液器吸取上層血清，移入冷凍管，將裝好的冷凍管迅速置入-80 ℃超低溫冰箱保存。術(shù)后13周，將樣品從冰箱取出，用恒溫水浴箱解凍，然后取樣品，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，經(jīng)過(guò)包被抗體洗滌、加樣品孵育洗滌、加入酶標(biāo)再孵育洗滌和加底物顯色等步驟，最后在酶標(biāo)儀下讀取吸光值，得到VEGF含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)用xs±表示，VEGF含量比較采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，移植物質(zhì)量和存活率比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

圖1 各組血清VEGF表達(dá)

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物無(wú)死亡，耳背皮下可見(jiàn)丘狀隆起的脂肪移植物，移植的脂肪組織無(wú)移位及擴(kuò)散，未見(jiàn)壞死及液化。實(shí)驗(yàn)各組脂肪組織移植物體積均明顯大于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)2組稍大于實(shí)驗(yàn)1組。

2.2 移植物質(zhì)量和存活率

術(shù)后13周,實(shí)驗(yàn)1組脂肪質(zhì)重(0.5923±0.1074)g，脂肪存活率（65.9±6.2）%；實(shí)驗(yàn)2組脂肪質(zhì)重(0.5976±0.1062)g，脂肪存活率（66.5±7.6）%；對(duì)照組脂肪質(zhì)重(0.3613±0.0916)g，脂肪存活率（40.2±6.3）%。實(shí)驗(yàn)各組脂肪移植物質(zhì)量和存活率與對(duì)照組差異有顯著性（P ＜0.05）。

2.3 VEGF含量

術(shù)后1周、2周、4周和6周，實(shí)驗(yàn)各組VEGF含量是先升高后降低，而對(duì)照組VEGF含量基本沒(méi)有變化。實(shí)驗(yàn)各組VEGF含量與對(duì)照組差異有顯著性（P＜0.05）。（圖1）

2.4 組織學(xué)觀察

HE染色顯示，實(shí)驗(yàn)各組均可見(jiàn)周?chē)律茌^豐富，新生脂肪細(xì)胞大小一致，脂肪小葉結(jié)構(gòu)接近正常脂肪組織, 脂肪組織間纖維間隔少，仍見(jiàn)散在前脂肪細(xì)胞聚集。實(shí)驗(yàn)2組對(duì)比實(shí)驗(yàn)1組的新生脂肪細(xì)胞大小更一致，但以上差別不明顯。對(duì)照組移植脂肪組織中周?chē)律懿幻黠@,有較多脂肪細(xì)胞凋亡和壞死，脂滴融合在一起，形成較多大小不等囊泡樣改變，脂肪細(xì)胞排列不整齊，纖維間隔較多，有炎性細(xì)胞反應(yīng)。（圖2）

圖2 各組移植物的組織學(xué)改變(HE,×100)

3 討 論

Kotaro Yoshimura[1]等提出了移植脂肪的三分層理論：最外層的存活區(qū)，中間的再生區(qū)和中心的壞死區(qū)。中央部分的脂肪組織由于缺血缺氧時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，極易發(fā)生了壞死，引發(fā)感染、硬結(jié)、囊腫等后遺癥。由此可見(jiàn)，影響自體顆粒脂肪移植成活的關(guān)鍵是移植脂肪應(yīng)盡早建立充分的血供，移植脂肪應(yīng)盡快完成血管化。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖以及多種血管活性物質(zhì)的合成和分泌[2］。VEGF能夠增強(qiáng)微靜脈和小靜脈血管通透性，調(diào)節(jié)與促進(jìn)血管網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)成熟，維持血管功能、影響血流動(dòng)力學(xué)和組織愈合等作用。

在脂肪移植中加入VEGF，證實(shí)VEGF可促進(jìn)移植物的血運(yùn)重建，提高脂肪成活率和移植物的質(zhì)量[3]。

生脈注射液具有益氣養(yǎng)陰、復(fù)脈固脫、活血化瘀等功效，臨床廣泛用于病毒性心肌炎、急性胰腺炎、休克及配合化療治療某些癌癥等。張育彬[4]發(fā)現(xiàn)生脈注射液可有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO，保護(hù)血管內(nèi)皮功能, 并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF, 促進(jìn)血管新生增多, 降低炎癥反應(yīng)。曹艷花[5]等證實(shí)生脈注射液可明顯提高缺氧復(fù)氧損傷乳鼠心肌細(xì)胞的SOD、ATP活性, 降低LDH、MDA水平, 從細(xì)胞水平表明生脈注射液具有保護(hù)細(xì)胞作用。低劑量生脈成骨膠囊兔血清可促進(jìn)ECV304細(xì)胞分泌VEGF，提示這可能是生脈促進(jìn)血管生成的主要作用機(jī)制之一[6]。多項(xiàng)研究已證實(shí)，生脈注射液能夠使細(xì)胞分泌VEGF，提高局部血供，從而促進(jìn)局部組織生長(zhǎng)與修復(fù)[7,8]。鑒于生脈注射液能夠降低炎癥反應(yīng)、保護(hù)細(xì)胞、分泌VEGF和促進(jìn)血管新生增多等作用，由此推測(cè)生脈注射液可能促進(jìn)移植脂肪組織血管新生，提高移植脂肪存活率和存活質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在自體脂肪移植術(shù)后13周，實(shí)驗(yàn)兩組自體脂肪移植存活率和質(zhì)量均明顯高于對(duì)照組。HE切片染色觀察顯示，脂肪細(xì)胞大小與形態(tài)、新生毛細(xì)血管數(shù)量、移植脂肪組織纖維化程度等方面，實(shí)驗(yàn)組均優(yōu)于對(duì)照組。提示生脈注射液可以增加移植脂肪組織內(nèi)血供，加速移植物新生血管的形成，從而增加自體脂肪移植存活率和質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)兩組的血清VEGF在脂肪移植術(shù)后的不同時(shí)間段的含量均明顯高于對(duì)照組。提示生脈注射液可能提高細(xì)胞分泌VEGF，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)脂肪內(nèi)部血管新生，加快移植脂肪內(nèi)部血供的重建，增強(qiáng)血管通透性，提高脂肪內(nèi)部細(xì)胞所需要的營(yíng)養(yǎng)，減少移植物液化、壞死；VEGF又可以增加機(jī)體及移植脂肪組織抗缺氧能力，保持移植物順利度過(guò)缺血、缺氧期，進(jìn)一步提高了自體脂肪移植存活率和存活質(zhì)量。

本實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)生脈注射液可以提高自體脂肪移植存活率和存活質(zhì)量，但生脈注射液成分復(fù)雜，仍需要進(jìn)一步研究哪種成分起作用，還有生脈注射液或者這種成分能否通過(guò)提高脂肪干細(xì)胞或前體細(xì)胞增殖、向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化等，還有待進(jìn)一步體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。

[1] Kato H,Mineda K,Eto H,et al.Degeneration, regeneration,and cicatrization after fat grafting:dynamic total tissue remodeling during the first 3 months[J].Plast Reconstr Surg,2014,133(3):303e-313e.

[2] Pons J,Huang Y,Arakawa Hoyt J，et al.VEGF improves survival of mesenchymal stem cells in infarctedhearts［J］．Biochem Biophys Res Commun，2008,376(2)419-422．

[3] Feng L,Jie L,JianHua G,et a1.Improvement of the survival of human Autologous fat transplantation by using VEGF-transfected adiposederived stem cells[J]. Plast Reconstr Surg,2009,124(5):1437-1446.

[4] 張育彬.生脈注射液對(duì)老年冠心病不穩(wěn)定型心絞痛NO 、VEGF及hs-CRP 的影響[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,25(5):39-40.

[5]曹艷花,劉珊珊.生脈注射液對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用[J]. 山東醫(yī)藥,2010,50(14):38-39.

[6] 樊粵光,趙長(zhǎng)青.生脈成骨膠囊對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及分泌VEGF 功能的影響[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,25(10):1228-1231.

[7] 蔣勝蘭,朱丹妮,余伯陽(yáng).生脈注射液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)的主要活性部位研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(17):88-90.

[8] 孫德波,韓淵.生脈注射液配合介入化療治療非小細(xì)胞肺癌前后VEGF水平變化[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,32(9):1282-1284.

Effects of shengmai injection on the survival rate of fat autografts

LIN Hui,ZHANG Jing-jing,LI Hong-guang
(Department of Laser and Plastic Surgery, The First Affliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medical ，NanNing ，530022,，China)

Objective To investigate the infuence of shengmai injection on the survival rate of fat autografts .Methods Autologous fat was transplanted on rabbit to establish an animal model. Nine rabbits were randomly divided into 3 groups. The rabbit were injected different doses of Shengmai injection by intramuscular injection in cexperimental groups The ontrol groups were given normal saline.The content of VEGF in serum were detected , the weight of transplanted fat was determined and the survival rates were computed.Results The survival rate of fat autografts and the level of VEGF expression in experimental groups were signifcantly higher than those in control groups.Conclusion Shengmai injection can dramatically increase the survival rate and quality of fat autografts.

shengmai injection; fat autografting ; rabbit ;survival rate

10.19593/j.issn.2095-0721.2017.07.032

廣西衛(wèi)計(jì)委科研項(xiàng)目（編號(hào):Z2015485）